聚合酶链反应(PCR)检测可疑HSK患者外周血及角膜上皮单纯疱疹病毒DNA
作者：马吉献 惠延年 金学勇 杜海阳
单位：马吉献(第四军医大学西京医院眼科中心, 陕西 西安 710033)；惠延年(第四军医大学西京医院眼科中心, 陕西 西安 710033)；金学勇(新疆库尔勒市第四医院,新疆 库尔勒 841000)；杜海阳(第四军医大学西京医院眼科中心, 陕西 西安 710033)
关键词：聚合酶链反应；单纯疱疹病毒；角膜炎；外周血；角膜上皮细胞
第四军医大学学报000674 中图号：R779.65 文献标识码：B
文章编号：1000-2790(2000)06-S0136-01
1 材料和方法
1.1 材料 正常对照组20 例，临床可疑单纯疱疹性角膜炎(HSK)患者50例(均为我院眼科中心住院或门诊患者). ①外周血采集：肘静脉血2 mL，取血清50 μL备检. ②角膜上皮细胞采集：用棉签擦拭病变处角膜上皮细胞(含泪液成分)，置入含1.5 mL生理盐水的Eppendorf 管中，待检. 试剂：选用上海prormega 公司提供的检测人单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)试剂盒. 本技术用HSV-DNA基因高保守区设计的3条引物，扩增片段分别为469 bp和391 bp，采用PCR检测其特异性DNA片段.
, 百拇医药
1.2 方法 ①DNA模板制备：外周血标本：取50 μL裂解液于离心管中，加入20 μL待检血清，100℃煮沸10 min，720 g离心10 min，取10 μL模板，待扩增. 角膜上皮标本DNA模板制备，按我科实验室常规方法操作[1]. ② PCR反应体系：模板10 μL，反应液14 μL，石蜡油30 μL，Taq酶1 μL. ③结果检测：取10 μL扩增产物加3 μL溴酚蓝混匀，于20 g.L-1 琼脂糖凝胶(含0.5 mg.L-1 溴化乙锭)上，FS600型电泳仪，300 V,15 min，将电泳后的琼脂糖凝胶放到FS-312型
紫外透射反射检测分析仪上观察[1]，有469 bp和391 bp扩增区带者为阳性，未见扩增区带者为阴性. ④ 结果判定：患者同时取外周血及角膜上皮细胞标本，经PCR检测，两种取样结果一项阳性即为PCR(+)，视为单阳性；(阳性例数/总检查数)×100%
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2 结果
检验HSK患者外周血与角膜上皮，对照组(20例)全部阴性. 在50例可疑患者中， 外周血39份阳性(78.0%)，角膜上皮27份阳性(54.0%)，两种取材有显著差异(P<0.05). 22例血液和角膜上皮HSK均阳性.
3 讨论
HSK是由HSV-Ⅰ引起的一种最常见的、高复发可致盲性眼病. 初发病例较易诊断，但不典型者诊断困难. 近年来由于激素和免疫抑制剂的滥用，角膜病变常不典型，需借助PCR方法进行早期特异诊断. 范俊等[2]报告HSK 患者角膜病变区组织PCR检查的阳性率为37.1%，贺冰等[3]报告用泪液为取材标本的PCR检查阳性率为76.1%， James[4]报告成人70.0%～90.0%血清中可以检测出HSV-Ⅰ抗体，说明曾有HSV-Ⅰ感染 . 但直接从血清中检测到HSV-Ⅰ DNA迄今未见报道. 单纯疱疹病毒性角膜炎为典型潜伏性病毒感染性疾病，有关复发的理论有3种：即神经节触发理论、皮肤触发理论和神经节-皮肤触发理论. 我们通过对临床可疑HSK患者外周血及角膜上皮细胞的HSV-Ⅰ DNA双项取样检测，同时检测出HSK-Ⅰ DNA，是否可以认为：临床上HSK患者外周血中HSV-Ⅰ感染先于角膜局部，在机体免疫力低下如发烧、外伤等因素刺激下而诱发角膜病变，并据此设想HSK复发患者外周血中可能也是HSV-Ⅰ的潜伏地之一有待进一步研究.
, 百拇医药
作者简介：马吉献(1956-)，男(汉族)，河南省南阳市人. 主管技师. Tel.(029)3375377
参考文献：
[1] 马吉献, 惠延年,汪凤姣. PCR在检测单纯疱疹病毒性角膜炎中的诊断价值[J]. 眼科研究，1998；16(2)：108-110.
[2] 范俊,张文华,武宇影.多聚酶链反应快速检测单纯疱疹Ⅰ型病毒眼部急性和潜伏感染[J]. 中华眼科杂志, 1994；30(4):298-301.
[3] 贺 冰，徐 杰，郑永晨. 用多聚酶链反应检测泪液中单疱病毒DNA[J]. 中国实用眼科杂志，1997；7(7)：457-459.
[4] James M. Herpes simplex latency and the eye[J]. Br J Ophthalmol，1991；75(6)：641.
收稿日期：2000-03-07
修回日期：2000-04-30, 百拇医药
单位：马吉献(第四军医大学西京医院眼科中心, 陕西 西安 710033)；惠延年(第四军医大学西京医院眼科中心, 陕西 西安 710033)；金学勇(新疆库尔勒市第四医院,新疆 库尔勒 841000)；杜海阳(第四军医大学西京医院眼科中心, 陕西 西安 710033)
关键词：聚合酶链反应；单纯疱疹病毒；角膜炎；外周血；角膜上皮细胞
第四军医大学学报000674 中图号：R779.65 文献标识码：B
文章编号：1000-2790(2000)06-S0136-01
1 材料和方法
1.1 材料 正常对照组20 例，临床可疑单纯疱疹性角膜炎(HSK)患者50例(均为我院眼科中心住院或门诊患者). ①外周血采集：肘静脉血2 mL，取血清50 μL备检. ②角膜上皮细胞采集：用棉签擦拭病变处角膜上皮细胞(含泪液成分)，置入含1.5 mL生理盐水的Eppendorf 管中，待检. 试剂：选用上海prormega 公司提供的检测人单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)试剂盒. 本技术用HSV-DNA基因高保守区设计的3条引物，扩增片段分别为469 bp和391 bp，采用PCR检测其特异性DNA片段.
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1.2 方法 ①DNA模板制备：外周血标本：取50 μL裂解液于离心管中，加入20 μL待检血清，100℃煮沸10 min，720 g离心10 min，取10 μL模板，待扩增. 角膜上皮标本DNA模板制备，按我科实验室常规方法操作[1]. ② PCR反应体系：模板10 μL，反应液14 μL，石蜡油30 μL，Taq酶1 μL. ③结果检测：取10 μL扩增产物加3 μL溴酚蓝混匀，于20 g.L-1 琼脂糖凝胶(含0.5 mg.L-1 溴化乙锭)上，FS600型电泳仪，300 V,15 min，将电泳后的琼脂糖凝胶放到FS-312型
紫外透射反射检测分析仪上观察[1]，有469 bp和391 bp扩增区带者为阳性，未见扩增区带者为阴性. ④ 结果判定：患者同时取外周血及角膜上皮细胞标本，经PCR检测，两种取样结果一项阳性即为PCR(+)，视为单阳性；(阳性例数/总检查数)×100%
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2 结果
检验HSK患者外周血与角膜上皮，对照组(20例)全部阴性. 在50例可疑患者中， 外周血39份阳性(78.0%)，角膜上皮27份阳性(54.0%)，两种取材有显著差异(P<0.05). 22例血液和角膜上皮HSK均阳性.
3 讨论
HSK是由HSV-Ⅰ引起的一种最常见的、高复发可致盲性眼病. 初发病例较易诊断，但不典型者诊断困难. 近年来由于激素和免疫抑制剂的滥用，角膜病变常不典型，需借助PCR方法进行早期特异诊断. 范俊等[2]报告HSK 患者角膜病变区组织PCR检查的阳性率为37.1%，贺冰等[3]报告用泪液为取材标本的PCR检查阳性率为76.1%， James[4]报告成人70.0%～90.0%血清中可以检测出HSV-Ⅰ抗体，说明曾有HSV-Ⅰ感染 . 但直接从血清中检测到HSV-Ⅰ DNA迄今未见报道. 单纯疱疹病毒性角膜炎为典型潜伏性病毒感染性疾病，有关复发的理论有3种：即神经节触发理论、皮肤触发理论和神经节-皮肤触发理论. 我们通过对临床可疑HSK患者外周血及角膜上皮细胞的HSV-Ⅰ DNA双项取样检测，同时检测出HSK-Ⅰ DNA，是否可以认为：临床上HSK患者外周血中HSV-Ⅰ感染先于角膜局部，在机体免疫力低下如发烧、外伤等因素刺激下而诱发角膜病变，并据此设想HSK复发患者外周血中可能也是HSV-Ⅰ的潜伏地之一有待进一步研究.
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作者简介：马吉献(1956-)，男(汉族)，河南省南阳市人. 主管技师. Tel.(029)3375377
参考文献：
[1] 马吉献, 惠延年,汪凤姣. PCR在检测单纯疱疹病毒性角膜炎中的诊断价值[J]. 眼科研究，1998；16(2)：108-110.
[2] 范俊,张文华,武宇影.多聚酶链反应快速检测单纯疱疹Ⅰ型病毒眼部急性和潜伏感染[J]. 中华眼科杂志, 1994；30(4):298-301.
[3] 贺 冰，徐 杰，郑永晨. 用多聚酶链反应检测泪液中单疱病毒DNA[J]. 中国实用眼科杂志，1997；7(7)：457-459.
[4] James M. Herpes simplex latency and the eye[J]. Br J Ophthalmol，1991；75(6)：641.
收稿日期：2000-03-07
修回日期：2000-04-30, 百拇医药