P195蛋白及其抗体抑制恶性疟原虫裂殖子入侵人红细胞的研究
作者：方军 管惟滨 钱锋
单位：200433上海，第二军医大学寄生虫学教研室
关键词：疟原虫，恶性；P195蛋白；抗体；红细胞
中华传染病杂志990309 【摘要】 目的 寻找恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白P195中的红细胞结合位点，为设计疫苗阻断裂殖子入侵红细胞提供实验依据。方法 在大肠杆菌中分8段表达P195蛋白。各段蛋白用镍亲和层析柱分离，然后复性。将得到的各段蛋白免疫家兔，制备抗血清。在体外培养疟原虫至成熟裂殖体期，将各段蛋白及其相应的抗血清分别加入到培养基上清中，继续培养24小时，检查红细胞感染率。通过感染率了解各段蛋白及其抗体对裂殖子入侵红细胞的影响。结果 P195蛋白中氨基酸序列为383～595(M6)，595～897(M7)，1397～1663(M11)的三段蛋白的抗血清具有抑制裂殖子入侵红细胞的作用，而其中M6蛋白片段也具有抑制裂殖子入侵红细胞的作用。结论 P195蛋白中氨基酸序列为383～595的一段序列，M6可能含恶性疟原虫识别人红细胞的位点，该位点可以作为疟疾疫苗的候选抗原。
, 百拇医药
Inhibitory effect of P195 and its antibodies on the invasion of merozoite of Plasmodium falciparum into human erythrocyte
FANG Jun,GUAN Weibing,QIAN Feng.
Department of Parasitology,Second Military Medical University,Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To map out the binding site of P195,which is the major protein on the surface of P.falciparum merozoites,to human erythrocytes,and offer a basis for designing malaria vaccine to blockade invasion of merozoites into human erythrocytes.Methods Eight proteins derived from P195 were expressed in E.coli, and purified by Ni-chelare affinity chromatography.There after,the eight fragments and rabbit serums immunized by which were added into culture medium of P.falciparum in vitro respectively.Twenty-four hours later,the invasion of merozoite to erythrocyte was observed.Results The antibodies which were induced by three fragments of P195,M6(Amino Acid,AA384～595),M7(AA 595～897) and M11(AA 1397～1563) could inhibit the invasion of P.falciparum merozoite into human erythrocytes.Especially,one fragment of P195, M6,had the ability to inhibit the invasion of P.falciparum merozoite into human erythrocytes.Conclusion M6,a fragment of P195 on the merozoite of P.falciparum may contain a domain thought to be involved in the recognition of human erythrocyte.The domain can be used as a candidate antigen for a malaria vaccine.
, 百拇医药
【Key words】 Plasmodium falciparum Protien 195 Antibody Erythrocyte
恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白是一相对分子质量为195 000的蛋白，被称为P195，是疟疾疫苗的一个重要候选抗原。P195被发现具有人红细胞结合作用[1]，这种结合是恶性疟原虫裂殖子识别人红细胞的基础。在本实验中我们用分段表达的P195蛋白，以及P195蛋白的兔抗血清分别进行恶性疟原虫体外培养的抑制试验，目的在于确定P195蛋白与红细胞的结合位点，以及用该位点作为疟疾疫苗候选抗原的可行性。
材料与方法
一、P195蛋白在大肠杆菌中的分段表达与提纯
将8个含有恶性疟原虫MAD20株P195蛋白DNA片段的pDS781质粒转化入大肠杆菌SG13009中。每个质粒含一段P195的DNA。除第一段较小外，其他每段DNA对应大约150～300个氨基酸，这些片段加起来覆盖了P195DNA的绝大部分。8个质粒均由德国海德堡大学分子生物学中心Bujard H教授提供。将新转化的大肠杆菌培养至A600为0.7时加入IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside)诱导表达4小时，即可在大肠杆菌中表达出各段P195蛋白。按文献[2]方法将表达出来的P195蛋白用镍亲和层析柱分离并复性，然后用SDS-PAGE电泳[3]检测蛋白纯度。
, 百拇医药
二、各段P195蛋白免疫家兔制备抗血清
取1mg表达的P195蛋白与2ml佛氏完全佐剂混合，充分混匀制备乳剂。乳剂要求滴入冷水表面保持完整不分散。将已形成油包水的佐剂抗原乳剂多点分散注射到新西兰兔皮下。其中背部6点，两个脚趾各1点。3周后即可在兔关节处摸到淋巴结，此时在淋巴结内及背部注射同样的抗原与佛氏不完全佐剂(不含卡介苗)的混合乳剂。隔2周后再加强注射1次。第7周时肌内注射200μg抗原溶液。1周后用双向琼脂凝胶免疫扩散法测定抗体效价，中心孔加入各表达提纯的蛋白50μg，周围孔加入倍比稀释的兔血清。血清中抗体效价达1∶64以上时即可收集血清。不抗凝心脏取血，室温放置2小时，待血凝成块状，2 000min/r离心15分钟，吸取上清，-40℃保存。用同样的方法分别制备各段P195蛋白的免疫兔血清。
三、各段蛋白的免疫兔血清及各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响
取液氮中保存的疟原虫株，按文献[4]方法复苏培养。待疟原虫生长稳定后，用5%甘露醇进行同步化处理。经同步化处理后的疟原虫继续培养，待疟原虫生长至成熟裂殖体期，用培养基和人红细胞调整原虫感染率为1%，按每孔2×107红细胞加入96孔板，每孔内加170μl RPMI-1640，同时加入30μl各段P195免疫兔血清。继续培养24小时，吸弃上清，取红细胞涂片，甲醇固定5分钟，吉氏染液染色20分钟，晾干，油镜下观察疟原虫的感染率。用同样的方法，在疟原虫培养上清中加入各段P195蛋白，各段蛋白终浓度控制在100μmol/L，观察各段蛋白对裂殖子入侵人红细胞的影响。
, 百拇医药
结 果
一、在大肠杆菌中表达、提纯各段P195蛋白
恶性疟原虫MAD20株P195蛋白的氨基酸序列见文献[5]。本实验表达提纯的各P195蛋白片段在恶性疟原虫MAD20株氨基酸序列上的位置如表1所示。各段DNA在大肠杆菌中都获得了表达，用镍亲和层析柱提纯，经SDS-PAGE电泳，得到了纯度很高的各P195蛋白片段(图1，图2)。
1：低分子量标准蛋白；2～9：SG13009表达的各段P195蛋白，M2.1，M3，M6，M7，M8，M9，M10，M11；10：不含表达质粒的SG13009
图1 各段MAD20株恶性疟原虫P195蛋白在大肠杆菌
, http://www.100md.com
SG13009中表达的SDS-PAGE电泳图谱
图2 镍亲和层析柱提纯的各段MAD20株恶性
疟原虫P195蛋白的SDS-PAGE电泳图谱
表1 各段恶性疟原虫MAD20株P195蛋白的氨基酸位置 片段名称
氨基酸位置
M2.1
56～111
M3
, http://www.100md.com
123～302
M6
384～595
M7
595～897
M8
897～1079
M9
1078～1251
M10
1250～1398
M11
1397～1563
, 百拇医药
二、各段蛋白免疫兔血清及各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响
经过8周及4次以上加强免疫，除第一段P195蛋白较小，无法得到抗体外，兔血清中各段P195蛋白相应抗体效价达到64以上。用普通兔血清按体积比调整效价统一为64。经同步化处理的疟原虫生长至成熟裂殖体时，加入RPMI-1640和含抗体的兔血清，血清终浓度为15%。继续培养24小时后制作薄血片，吉氏染色计数5 000个红细胞中感染疟原虫的红细胞数，算出原虫率。结果如表2所示，从表中我们可以发现，加入M6，M7，M11抗体的样本中，裂殖子入侵红细胞数明显少于对照。同样的方法观察各段P195蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响，结果如表3所示，加入M6蛋白的样本中，裂殖子入侵红细胞数明显少于对照。
表2 各段P195蛋白产生的抗体对恶性
疟原虫裂殖子入侵人红细胞的影响 片段名称
, 百拇医药 培养孔数
原虫感染率(‰)
对照组
4
23.5±2.1
M3
4
27.3±2.2
M6
4
11.7±1.9*
M7
4
, http://www.100md.com
12.1±1.7*
M8
4
19.3±1.9
M9
4
19.8±2.0
M10
4
24.5±2.2
M11
4
15.8±1.6*
, 百拇医药
与对照组相比，* P<0.01
表3 各段P195蛋白对恶性疟原虫
裂殖子入侵人红细胞的影响 片段名称
培养孔数
原虫率(‰)
对照组
4
41.1±3.3
M2.1
4
39.8±2.9
M3
, 百拇医药
4
41.6±3.2
M6
4
21.3±2.2*
M7
4
39.5±3.1
M8
4
38.5±3.5
M9
4
, 百拇医药
42.7±3.2
M10
4
42.9±3.8
M11
4
40.6±3.4
与对照组相比，* P<0.01
讨 论
恶性疟原虫体外培养是一个研究疟原虫的常用方法，培养过程中需要使用兔血清。我们在实验中利用这一特性，用P195蛋白分段免疫兔，得到兔抗血清，加入到体外培养疟原虫的上清中，以期通过抗体的封闭作用了解哪段P195蛋白含裂殖子识别红细胞的位点。实验结果表明P195蛋白中的三段，M6、M7、M11，免疫家兔产生的抗体具有抑制恶性疟原虫裂殖子入侵人红细胞的作用。而在体外培养疟原虫的上清中加入各段P195蛋白，只有M6蛋白片段能够抑制疟原虫裂殖子入侵人红细胞。因此M6蛋白片段可能含P195蛋白的红细胞识别位点。这一结果与我们用同位素和胶体金标记P195蛋白与人红细胞进行结合实验得到的结果一致[6，7]。
, 百拇医药
P195蛋白是恶性疟原虫裂殖子在裂体增殖过程中合成，随后转运到每个裂殖子表面的蛋白，在裂殖子从破裂的红细胞中释放出来之前，P195蛋白就发生了加工裂解，最终分解成三个相对分子质量为83000、36000和19000的蛋白，这三个蛋白分别被称为P83、P36和gP19[8]。只有gP19随裂殖子进入红细胞，开始下一轮裂体增殖，而P83和P36在裂殖子进入红细胞时脱落[9]。
通过氨基酸位置对比发现，M6蛋白片段位于P83中，说明P83具有红细胞结合作用。因此实际情况可能为：P195蛋白通过其中的P83部分与红细胞发生结合，然后进入红细胞，随着裂殖子进入红细胞，P83被留在红细胞外，并脱落进入血液。这一过程可能是疟原虫的一种免疫逃避机制，因为进入血液的P83可中和血液中针对裂殖子表面P83的抗体，从而减少抗体对裂殖子入侵红细胞的影响。
在实验中我们还发现M7、M11的抗体也能抑制疟原虫裂殖子入侵人红细胞，这可能是M7、M11蛋白片段与相应抗体结合后从空间上阻碍了裂殖子对红细胞的识别与入侵，从而导致感染率的下降。也可能是M7、M11蛋白片段对应其它与入侵有关的生物学机制，有待进一步深入研究。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号：39500126)
参考文献
1 Perkins ME,Rocco LJ.Sialic acid-dependent binding of Plasmodium falciparum merozoite surface antigen,pf200,to human erythrocytes.J Immunol,1988,141:3190-3193.
2 Bush GL,Tassin AM,Friden H,et al.Purification and in vitro translocation of chemical amounts of prepo-α-factor.J Biol Chem,1991,266:13811-13814.
3 金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1992.880-887.
, http://www.100md.com
4 Trager M,Jensen JB.Human malaria parasites in continuous culture.Science,1976,193:673-675.
5 Tanabe K,Mackay M,Goman M,et al.Allelic dimorphism in a surface antigen gene of the malaria parasite Plasmodium falciparum.J Mol Biol,1987,195:273-287.
6 FANG J,HE B,GUAN WB.Observation on the specific binding site of P195 protein on human erythrocytes using colloidal gold labelling.J Med Coll PLA,1997,12:116-120.
, http://www.100md.com
7 方军，管惟滨，孙树汉，等.恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白人红细胞结合的研究(英文).中国寄生虫与寄生虫病杂志，1997，15：330-334.
8 Cooper JA.Merozoite surface antigen-1 of Plasmodium.Parasitol Today,1993,9:50-54.
9 Blckman MJ,Holder AA.Secondary processing of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 (MSP1) by a calcium-dependent membrane bound serine protease:shedding of MSP33 as a noncovalently associated complex with other fragments of the MSP1.Mol Biochem Parasitol,1992,50:307-316.
(收稿：1998-09-22 修回：1999-03-28), http://www.100md.com
单位：200433上海，第二军医大学寄生虫学教研室
关键词：疟原虫，恶性；P195蛋白；抗体；红细胞
中华传染病杂志990309 【摘要】 目的 寻找恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白P195中的红细胞结合位点，为设计疫苗阻断裂殖子入侵红细胞提供实验依据。方法 在大肠杆菌中分8段表达P195蛋白。各段蛋白用镍亲和层析柱分离，然后复性。将得到的各段蛋白免疫家兔，制备抗血清。在体外培养疟原虫至成熟裂殖体期，将各段蛋白及其相应的抗血清分别加入到培养基上清中，继续培养24小时，检查红细胞感染率。通过感染率了解各段蛋白及其抗体对裂殖子入侵红细胞的影响。结果 P195蛋白中氨基酸序列为383～595(M6)，595～897(M7)，1397～1663(M11)的三段蛋白的抗血清具有抑制裂殖子入侵红细胞的作用，而其中M6蛋白片段也具有抑制裂殖子入侵红细胞的作用。结论 P195蛋白中氨基酸序列为383～595的一段序列，M6可能含恶性疟原虫识别人红细胞的位点，该位点可以作为疟疾疫苗的候选抗原。
, 百拇医药
Inhibitory effect of P195 and its antibodies on the invasion of merozoite of Plasmodium falciparum into human erythrocyte
FANG Jun,GUAN Weibing,QIAN Feng.
Department of Parasitology,Second Military Medical University,Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To map out the binding site of P195,which is the major protein on the surface of P.falciparum merozoites,to human erythrocytes,and offer a basis for designing malaria vaccine to blockade invasion of merozoites into human erythrocytes.Methods Eight proteins derived from P195 were expressed in E.coli, and purified by Ni-chelare affinity chromatography.There after,the eight fragments and rabbit serums immunized by which were added into culture medium of P.falciparum in vitro respectively.Twenty-four hours later,the invasion of merozoite to erythrocyte was observed.Results The antibodies which were induced by three fragments of P195,M6(Amino Acid,AA384～595),M7(AA 595～897) and M11(AA 1397～1563) could inhibit the invasion of P.falciparum merozoite into human erythrocytes.Especially,one fragment of P195, M6,had the ability to inhibit the invasion of P.falciparum merozoite into human erythrocytes.Conclusion M6,a fragment of P195 on the merozoite of P.falciparum may contain a domain thought to be involved in the recognition of human erythrocyte.The domain can be used as a candidate antigen for a malaria vaccine.
, 百拇医药
【Key words】 Plasmodium falciparum Protien 195 Antibody Erythrocyte
恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白是一相对分子质量为195 000的蛋白，被称为P195，是疟疾疫苗的一个重要候选抗原。P195被发现具有人红细胞结合作用[1]，这种结合是恶性疟原虫裂殖子识别人红细胞的基础。在本实验中我们用分段表达的P195蛋白，以及P195蛋白的兔抗血清分别进行恶性疟原虫体外培养的抑制试验，目的在于确定P195蛋白与红细胞的结合位点，以及用该位点作为疟疾疫苗候选抗原的可行性。
材料与方法
一、P195蛋白在大肠杆菌中的分段表达与提纯
将8个含有恶性疟原虫MAD20株P195蛋白DNA片段的pDS781质粒转化入大肠杆菌SG13009中。每个质粒含一段P195的DNA。除第一段较小外，其他每段DNA对应大约150～300个氨基酸，这些片段加起来覆盖了P195DNA的绝大部分。8个质粒均由德国海德堡大学分子生物学中心Bujard H教授提供。将新转化的大肠杆菌培养至A600为0.7时加入IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside)诱导表达4小时，即可在大肠杆菌中表达出各段P195蛋白。按文献[2]方法将表达出来的P195蛋白用镍亲和层析柱分离并复性，然后用SDS-PAGE电泳[3]检测蛋白纯度。
, 百拇医药
二、各段P195蛋白免疫家兔制备抗血清
取1mg表达的P195蛋白与2ml佛氏完全佐剂混合，充分混匀制备乳剂。乳剂要求滴入冷水表面保持完整不分散。将已形成油包水的佐剂抗原乳剂多点分散注射到新西兰兔皮下。其中背部6点，两个脚趾各1点。3周后即可在兔关节处摸到淋巴结，此时在淋巴结内及背部注射同样的抗原与佛氏不完全佐剂(不含卡介苗)的混合乳剂。隔2周后再加强注射1次。第7周时肌内注射200μg抗原溶液。1周后用双向琼脂凝胶免疫扩散法测定抗体效价，中心孔加入各表达提纯的蛋白50μg，周围孔加入倍比稀释的兔血清。血清中抗体效价达1∶64以上时即可收集血清。不抗凝心脏取血，室温放置2小时，待血凝成块状，2 000min/r离心15分钟，吸取上清，-40℃保存。用同样的方法分别制备各段P195蛋白的免疫兔血清。
三、各段蛋白的免疫兔血清及各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响
取液氮中保存的疟原虫株，按文献[4]方法复苏培养。待疟原虫生长稳定后，用5%甘露醇进行同步化处理。经同步化处理后的疟原虫继续培养，待疟原虫生长至成熟裂殖体期，用培养基和人红细胞调整原虫感染率为1%，按每孔2×107红细胞加入96孔板，每孔内加170μl RPMI-1640，同时加入30μl各段P195免疫兔血清。继续培养24小时，吸弃上清，取红细胞涂片，甲醇固定5分钟，吉氏染液染色20分钟，晾干，油镜下观察疟原虫的感染率。用同样的方法，在疟原虫培养上清中加入各段P195蛋白，各段蛋白终浓度控制在100μmol/L，观察各段蛋白对裂殖子入侵人红细胞的影响。
, 百拇医药
结 果
一、在大肠杆菌中表达、提纯各段P195蛋白
恶性疟原虫MAD20株P195蛋白的氨基酸序列见文献[5]。本实验表达提纯的各P195蛋白片段在恶性疟原虫MAD20株氨基酸序列上的位置如表1所示。各段DNA在大肠杆菌中都获得了表达，用镍亲和层析柱提纯，经SDS-PAGE电泳，得到了纯度很高的各P195蛋白片段(图1，图2)。
1：低分子量标准蛋白；2～9：SG13009表达的各段P195蛋白，M2.1，M3，M6，M7，M8，M9，M10，M11；10：不含表达质粒的SG13009
图1 各段MAD20株恶性疟原虫P195蛋白在大肠杆菌
, http://www.100md.com
SG13009中表达的SDS-PAGE电泳图谱
图2 镍亲和层析柱提纯的各段MAD20株恶性
疟原虫P195蛋白的SDS-PAGE电泳图谱
表1 各段恶性疟原虫MAD20株P195蛋白的氨基酸位置 片段名称
氨基酸位置
M2.1
56～111
M3
, http://www.100md.com
123～302
M6
384～595
M7
595～897
M8
897～1079
M9
1078～1251
M10
1250～1398
M11
1397～1563
, 百拇医药
二、各段蛋白免疫兔血清及各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响
经过8周及4次以上加强免疫，除第一段P195蛋白较小，无法得到抗体外，兔血清中各段P195蛋白相应抗体效价达到64以上。用普通兔血清按体积比调整效价统一为64。经同步化处理的疟原虫生长至成熟裂殖体时，加入RPMI-1640和含抗体的兔血清，血清终浓度为15%。继续培养24小时后制作薄血片，吉氏染色计数5 000个红细胞中感染疟原虫的红细胞数，算出原虫率。结果如表2所示，从表中我们可以发现，加入M6，M7，M11抗体的样本中，裂殖子入侵红细胞数明显少于对照。同样的方法观察各段P195蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响，结果如表3所示，加入M6蛋白的样本中，裂殖子入侵红细胞数明显少于对照。
表2 各段P195蛋白产生的抗体对恶性
疟原虫裂殖子入侵人红细胞的影响 片段名称
, 百拇医药 培养孔数
原虫感染率(‰)
对照组
4
23.5±2.1
M3
4
27.3±2.2
M6
4
11.7±1.9*
M7
4
, http://www.100md.com
12.1±1.7*
M8
4
19.3±1.9
M9
4
19.8±2.0
M10
4
24.5±2.2
M11
4
15.8±1.6*
, 百拇医药
与对照组相比，* P<0.01
表3 各段P195蛋白对恶性疟原虫
裂殖子入侵人红细胞的影响 片段名称
培养孔数
原虫率(‰)
对照组
4
41.1±3.3
M2.1
4
39.8±2.9
M3
, 百拇医药
4
41.6±3.2
M6
4
21.3±2.2*
M7
4
39.5±3.1
M8
4
38.5±3.5
M9
4
, 百拇医药
42.7±3.2
M10
4
42.9±3.8
M11
4
40.6±3.4
与对照组相比，* P<0.01
讨 论
恶性疟原虫体外培养是一个研究疟原虫的常用方法，培养过程中需要使用兔血清。我们在实验中利用这一特性，用P195蛋白分段免疫兔，得到兔抗血清，加入到体外培养疟原虫的上清中，以期通过抗体的封闭作用了解哪段P195蛋白含裂殖子识别红细胞的位点。实验结果表明P195蛋白中的三段，M6、M7、M11，免疫家兔产生的抗体具有抑制恶性疟原虫裂殖子入侵人红细胞的作用。而在体外培养疟原虫的上清中加入各段P195蛋白，只有M6蛋白片段能够抑制疟原虫裂殖子入侵人红细胞。因此M6蛋白片段可能含P195蛋白的红细胞识别位点。这一结果与我们用同位素和胶体金标记P195蛋白与人红细胞进行结合实验得到的结果一致[6，7]。
, 百拇医药
P195蛋白是恶性疟原虫裂殖子在裂体增殖过程中合成，随后转运到每个裂殖子表面的蛋白，在裂殖子从破裂的红细胞中释放出来之前，P195蛋白就发生了加工裂解，最终分解成三个相对分子质量为83000、36000和19000的蛋白，这三个蛋白分别被称为P83、P36和gP19[8]。只有gP19随裂殖子进入红细胞，开始下一轮裂体增殖，而P83和P36在裂殖子进入红细胞时脱落[9]。
通过氨基酸位置对比发现，M6蛋白片段位于P83中，说明P83具有红细胞结合作用。因此实际情况可能为：P195蛋白通过其中的P83部分与红细胞发生结合，然后进入红细胞，随着裂殖子进入红细胞，P83被留在红细胞外，并脱落进入血液。这一过程可能是疟原虫的一种免疫逃避机制，因为进入血液的P83可中和血液中针对裂殖子表面P83的抗体，从而减少抗体对裂殖子入侵红细胞的影响。
在实验中我们还发现M7、M11的抗体也能抑制疟原虫裂殖子入侵人红细胞，这可能是M7、M11蛋白片段与相应抗体结合后从空间上阻碍了裂殖子对红细胞的识别与入侵，从而导致感染率的下降。也可能是M7、M11蛋白片段对应其它与入侵有关的生物学机制，有待进一步深入研究。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目(编号：39500126)
参考文献
1 Perkins ME,Rocco LJ.Sialic acid-dependent binding of Plasmodium falciparum merozoite surface antigen,pf200,to human erythrocytes.J Immunol,1988,141:3190-3193.
2 Bush GL,Tassin AM,Friden H,et al.Purification and in vitro translocation of chemical amounts of prepo-α-factor.J Biol Chem,1991,266:13811-13814.
3 金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1992.880-887.
, http://www.100md.com
4 Trager M,Jensen JB.Human malaria parasites in continuous culture.Science,1976,193:673-675.
5 Tanabe K,Mackay M,Goman M,et al.Allelic dimorphism in a surface antigen gene of the malaria parasite Plasmodium falciparum.J Mol Biol,1987,195:273-287.
6 FANG J,HE B,GUAN WB.Observation on the specific binding site of P195 protein on human erythrocytes using colloidal gold labelling.J Med Coll PLA,1997,12:116-120.
, http://www.100md.com
7 方军，管惟滨，孙树汉，等.恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白人红细胞结合的研究(英文).中国寄生虫与寄生虫病杂志，1997，15：330-334.
8 Cooper JA.Merozoite surface antigen-1 of Plasmodium.Parasitol Today,1993,9:50-54.
9 Blckman MJ,Holder AA.Secondary processing of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 (MSP1) by a calcium-dependent membrane bound serine protease:shedding of MSP33 as a noncovalently associated complex with other fragments of the MSP1.Mol Biochem Parasitol,1992,50:307-316.
(收稿：1998-09-22 修回：1999-03-28), http://www.100md.com