TGF-β信号通路中Smad蛋白与基因转录调节研究进展
作者：汪娟 柳惠图
单位：北京师范大学生命科学学院，细胞增殖及调控生物学教育部重点实验室，北京10 0875
关键词：
解剖学报00zk04
【中图分类号】 Q257 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)增-13
THE RELATIONSHIP BETWEEN Smads AND REGULATION OF GENE TRANSCRIPTION IN TGF-β SIGNALING PATHWAY
转化生长因子β(transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子 亚家族组成，其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子( GDF)等[1]。TGF-β除了影响细胞的增殖、分化，还在胚胎发育、胞外基质形成、 骨的形成和重建等方面起着重要作用。TGF-β家族成员广泛存在于从果蝇到人多种生物的 各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着显著作用。
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【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39780014)，国家重点基础研 究项目(G1999053901)，北京市自然科学基金资助项目(7961001)(G10000539901)
【作者简介】 汪娟(1975—)，女(汉族)，河南省信阳市人，在读博士
转化生长因子β(transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子 亚家族组成，其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子( GDF)等[1]。TGF-β除了影响细胞的增殖、分化，还在胚胎发育、胞外基质形成、 骨的形成和重建等方面起着重要作用。TGF-β家族成员广泛存在于从果蝇到人多种生物的 各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着显著作用。
由于TGF-β作用的多功能性和广泛性，所以从1981年Robert[2]发现TGF￣β以来 ，对它的研究是沿着不同的路线进行的，但对其信号传导的通路一直不清楚。直到近来发现 了细胞内信号转导蛋白Smad家族，才较深入地阐明了TGF-β信号从膜到核转运的分子机理 。
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TGF-β家族成员通过与两种类型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体异源复合物结合，启动了细 胞反应。胞内信号蛋白Smads被受体激酶活化，形成异源蛋白复合物转移到核内，与特定的D NA序列结合，指导转录，从而实现TGF-β对基因表达的调控。
通过EST文库和cDNA文库筛选，已经在脊椎动物中至少已克隆出9种Smad基因[3],在 Drosophila(果蝇)和Caenorhabditis elegans(尼采蝇) 中发现 了它们的同源物。Smad蛋白的分子量大约在42kD到60kD，其N端和C端各有一段高度保守的区 域，分别称为MH1区和MH2区(mad￣homology domain ),中间有一段富含pro的L区连接。 在非活性状态下，Smad的MH1区和MH2区相互作用，形成自我抑制，被受体激活后，分子 打开，Smad形成异源复合物，转移到核内。
, 百拇医药 不同的Smad家族在信号传递中作用不同。根据结构和功能上的特点，Smad蛋白被分为3类：( 1)R-Smad (receptor-activated Smads),包括Smad1、2、3、5、8，它们是Ⅰ型受体激酶 的底物，具有通路特异性(pathway-restricted)(2)Co-Smad(common￣mediator sm ads),脊 椎动物中Smad4属于此类，它通过此类与R-Smad的结合，参与信号传递；(3)I-Smads(inhi bitory Smads),包括Smad6,7，它们抑制R-Smad的信号传递功能(附表)。附表 Smad蛋白家族
Table The Smad family 配体
ligand
R-Smad
Co-Smad
, 百拇医药 I-Smad
脊椎动物
vertebrate
BMPs
activin,TGF-β
Unknown
果蝇
Smad1,5,8
Smad2,3
Smad4
Smad4
Smad10注
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Smad6(Sma d7)
Smad7(Smad6)
Drosophila
Dpp
dActivin
尼采蝇
MAD
dSmad2
Me dea
DAD
C.elegans
Dbl-1
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Daf-7
Sma-2,-3
Daf-8,-14
Sma-4
Daf-3
注：Smad10[4]与Smad4有高度保守的序列。因此，被归为Co-Smad。
Smad10 shares a high level of sequence identity with Smad4.Thus it is ragarded a s Co-Smad.
1.Smad信号传递与其他通路的交联(crosstalk)
现在对Smads如何介导配体信号激活目的基因转录的机制已大致清楚。TGF-β超家族成员先 与细胞膜上的TGF-βⅡ型受体结合，然后吸收Ⅰ型受体在细胞膜上形成一个异源复合物， Ⅰ型受体被Ⅱ受体激酶磷酸化并被激活，活化的Ⅰ型受体与R-Smads暂时结合，磷酸化R-S madsC端SS(V/M)S区的ser残基。Smad1,5,8被BMP受体磷酸化，介导BMP信号，而Smad2,3被 activin和TGF-β受体所活化，介导这些因子的效应。受体对R-Smads的磷酸化使活化的Sm ads构象发生变化后从受体上解离下来，并与Smad4结合。结合后异源寡聚物转移到核内，激 活特定基因的转录。(图1)
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近年来，随着对不同信号通路间相互交联(crosstalk)的研究，人们发现Smads蛋白不仅受 T GF-β信号的调节，而且很多信号通路对其都有调控作用。Smad信号和生长因子激活的酪氨 酸激酶受体信号以及随后的MAPK通路在若干水平上发生交联。有研究发现，EGF和HGF激活的 酪氨酸激酶受体可以激活依赖于Smad2的基因表达。这种效应是由于Smad2的磷酸化所致。但 是这种磷酸化不是发生在activin和TGF-β受体激酶作用的C端ser位点上[5]。虽 然 还需要进一步确定上述激酶的效应，但上述结果仍然显示Smad的激活可能并不仅仅依赖于TG F-β相关因子受体。Smad2还可以被MEKK-1(MAPK kinase kinase-1)所激活。MEKK-1是S AP K/JNK(stress-activated protein kinase/c-Jun Nterminal kinase)通路的激活物。ME KK-1对Smad2的磷酸化加强了Smad2～Smad4的相互作用和核内积累，同时也增强了Smad2与 转录辅激活因子CBP(CREB-binding protein)的结合[6]。另外，MEKK-1，JNK1和 MEK-4(MEK-4是JNK上游的一种激活因子)的显性失活形式会抑制TGF-β诱导的基因表达， 这都显示了SAPK/JNK通路参与了TGF-β信号传递[6～8]。但目前还不清楚HGF和EG F对Smad2的激活作用是否是SAPK/JNK通路对其磷酸化的结果。
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图1 TGF-β/SMAD通路
Fig.1 The transforming growth factor β(TGF-β)/SMAD pathway
与SAPK/JNK通路的正调作用相比，传统的MAPK/ERK(mitogen-activated protein kinase/extracellular-sigal-related kinase)通路可能是Smad信号传递的负调因子。MAP激酶Er k可以磷酸化Smad1L区段PXSP单元的ser残基[9]。这种磷酸化作用会抑制Smad1的核 转 移和转录激活作用，这说明酪氨酸激酶受体抑制BMP的信号传递。同样，活化的MAPK Kinase 1(MEK-1)或癌基因产物Ras也可以诱导TGF￣β活化的Smad2和Smad3核内的积累和依赖于Sma d的转录[10]。现在还不清楚SAPK/JNK或MAPK/Erk对Smads的磷酸化作用是否发生在 同一位点。但是，上述发现证明了Smads能够整合来源于细胞内不同信号的通路。
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酪氨酸激酶受体通路对Smad信号通路的抑制作用还可以通过诱导抑制型Smad6和Smad7的表达 而实现。EGF具有与TGF-β相似的诱导Smad6和Smad7表达的作用。另外，PKC的激活剂PMA在 激活MAPK通路的同时大大增强了TGF-β诱导的Smad6和Smad7的表达[11]。干扰素 γ 通过激活酪氨酸激酶Jak1，然后磷酸化转录因子Stat1而发生作用。已经发现干扰素γ可以 诱导Smad7的表达，但不能诱导Smad6[12]。对抑制型Smad的诱导可以抑制R-Smad 的信号 传递作用，从而抑制TGF-β家族成员的作用。因此，诱导抑制型Smad的表达可能是Jak-S tat通路反式调控Smad信号传递的机制。
综上所述，Smad不仅是TGF-β通路的胞内信号蛋白，而且受到多种信号通路的影响。这 些都说明了不同信号在胞内的整合作用。
2.Smad蛋白与基因转录
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2.1 Smad与DNA启动子序列的结合：在过去的十几年中，在不同的启动子中已经发现了多 种TG F-β和活化素的效应元件，但它们没有明显一致的序列，只是发现TGF-β诱导的转录作用 常常需要一些已知的转录因子如AP-1，Sp1,CTF/NT-1之类的结合位点。近年来人们才逐步 了解Smads调节转录的机制，Smads与启动子序列直接结合，并与其他转录因子一起协同调节 转录。
进入核以后，磷酸化的Smads异源复合物与效应物配体的启动子序列之间相互作用，调节转 录。首次被确证与Smads结合作用于启动子DNA的蛋白是FAST(forehead activin signal tr ansducer)。介导activin效应的Smad2/4复合物与FAST-1结合，作用于非洲爪蟾的Mix2 启动 子，FAST-1是一种翼状螺旋转录因子，是activin的效应元件[13，14]。在上述 过 程中,Smad2与FAST-1之间是直接作用的，而Smad4则是通过它与Smad2的结合，参与到Smad2 /FAST-1复合物中[14,15]。Smad2/4复合物还通过类似的方式作用于小鼠的 goosecoid启动子。不过，在goosecoid启动子上，参与结合的是 FAST -2，而不是FASF1，FAST-2与FAST-1结构上相关，它所结合的序列与FAST-1的相似 [16]。Smad 3/4与PAI-1[17～19]，JunB[20],collagenase[21]等启动子的 作用也与上述过程类似。
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Smads与确定的启动子序列直接作用，这一点让人有些吃惊。因为第1篇报道Smad2和 Mix2启动子之间作用的文章强调它们是通过FAST-1间接作用的[13]。 但是 ，现在已经有很多文献说明了Smads在不同启动子中是与DNA直接结合的。果蝇中Mad直接结 合vestigial启动子上GC富集序列。但全长的Mad不能结合这段序列，只有去除C端结构 域的M ad才能结合[22]。C端结构域抑制N-L区段与DNA的结合，这种现象可以用N，C结构 域 的相互作用来解释。通常状态，N，C结构域相互作用，受体激活时，才暴露N，C区段[ 2 3]。Medea的N端结构域也同样作用于tinman启动子的GC富集区[24]。
通过PCR技术选择，Smad3和Smad4的最佳DNA结合序列被确定。这个made结合元件的序列是 GTCTAGAC，具有两个拷贝的GTCT回文序列，在它的互补链上是反向互补的AGAC序列。TGF- β诱导的转录激活作用必须有这段序列的串联重复[25]。Smad3和4也结合象TGAGTC AGA这样的序列，它是AP-1结合位点TGAGCA与Smad结合序列AGAC的交错重叠[21,26] 。 在PAI-1和JunB启动子中，Smad3和4直接结合CAGA序列[17,20]。这些序列与Smad 结 合元件的多联化能够发挥TGF-β和Smad3/4的作用，这些序列包括了串联重复的 AGAC或反 向互补序列GTCT。与Mad跟DNA结合的特性一致，C端结构域的缺失也能够大大增强Smads与这 些序列的亲合力[17，21，25]。
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晶体学的分析也证实了Smad3的N端结构域与Smad结合元件之间的直接作用[27]。晶 体 分析结果显示，Smad3N端结构域11个氨基酸的β发夹结构插入到DNA大沟中，与特异的GTCT 序列联接。β发夹结构中的3个氨基酸残基与大沟中的3个碱基形成5个氢键以及另外3处与DN A磷酸骨架的联系。GTCT序列上单个的碱基突变会降低DNA与Smad的亲合力[25]。这 些 都说明GTCT(或AGAC)是Smad3的最佳结合序列。GTCT序列上第2个残基与Smad3的N端没有直接 的联系[27]，它的突变几乎不改变DNA的亲合力[17,21,25]。
值得一提的是，尽管Smad2和Smad3有92%的序列同源性，但Smad2不结合上述序列，这也说 明Smad2和3在功能上不等同。这种不同可能是由于Smad2N端的β发夹结构之前，恰好插入了 一段30个氨基酸残基的序列，干扰了DNA的识别[27]。Smad2和Smad3在DNA结合特性 上 的差异也说明了为什么Smad3不能替代Smad2激活goosecoid启动子的转录 。[16]。
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2.2 Smad与核内其他因子的协同作用：在TGF-β/activin/BMP信号通路中，通过实验表明 Smads与DNA结合蛋白在基因转录调节中 存在协同作用，即Smads的转录激活作用不仅依赖于自身与DNA序列的结合，也需要与其他转 录因子一起构成核蛋白复合物而起作用。Smads蛋白家族可通过结合不同蛋白去调节靶基因 的转录。图2如活化素和Smads2/4介导的Mix2或goosecoid等启动子的转录作用，必 须在Sma d2和FAST-1或2的相互作用下才能完成[14～16]。Smad3的N-C区段与C-Jun相 互 作用，C区段与C-Fos相互作用，形成多蛋白复合体，在启动子的AP-1-Smad3结合序列上 结合。Smad3/4与C-Jun/C-Fos的协同作用使启动子在TGF-β的诱导下转录[21,2 8 ]。Smads3/4还与TTE-3蛋白协同诱导TGF-β效应元件PAII-1启动子的转录。虽然还没 有发现Sm ad3/4与TFE-3之间的作用，但这3种蛋白都作用于启动子的1个区段，这个序列既包括了TF E-3结合的Ebox的序列，也包括了1个Smad3的结合位点[19]。CKIp15和p21的启动 子 对TGF-β效应定位在Sp-1结合点上，说明TGF-β介导的Smad的转录激活作用需要Sp1蛋白 [29]。Smad3与C-Jun[21],Smad2与FAST-1[14]或FAST-2 [16]结合都依赖膜受体的激活作用。
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果蝇中，对Dpp诱导的tinman和Ubx启动子的转录作用 的分 析，进一步证明了上述的协同转录模式。同时具有Medea/Mad和Tinman结合位点的启动子才 能诱导tinman的转录。因此，Dpp介导的Medea/Mad复合体可能是和Tinman 蛋白一起协同介导tinman的转录。[24]。同样， Ubx[ WTBZ〗 启动子既有Mad的结合序列，也包括一段CRE(CAMP效应元件)，Dpp诱导转录需要它们，因此M edea/Mad复合物与CREB协同诱导Ubx转录。[30]。
虽然只发现了Smads与FAST-1和FAST-2，C-Jun/C-Fos的直接作用，但在配体诱导下， Smad可与其他转录因子结合发挥协同作用。Smad3在这种作用下增强了C-Jun在AP-1结合位 点 处的活性[21]。但仍不清楚FAST-1和FAST-2是本身具有转录活性，还是在Smad2/ 4的转录作用中仅仅充当衔接子的角色。也不确定，Smad3/4是否加强了TFE-3本身的转录活 性 。虽然已经发现Smad与多种信号通路中的转录因子协同作用，但这种作用的结构基础仍需探 讨。
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图2 Smads核内伴侣
在核内，R-Smad/Smad4复合物与调节的基因转录的多种蛋白相互作用。不同的DNA结合蛋白 能够特异地与Smad1或Smad2/3结合。SIP1、PEBP2和Gli3与两种R-Smads都可结合。在有些 情 况下，这些DNA结合蛋白也同时受到其他信号通路的调控。Smads可以通过与辅激活物或辅抑 制物 的相互作用调整基因表达。而E1A和Evi-1与Smads的相互作用可阻抑Smad介导的转录激活作 用。(引自 Cell, Vol.100,Jeffrey L 2000)*方框中表示转录调节蛋白。
Fig.2 The nuclear partners for Smads
In the nucleus,the R-Smad/Smad4 complex interacts with a variety of proteins to regulate transcription of target genes. Various DNA-binding proteins can inte r act specifically with either Smad1 or Smad2/3.SIP1,PEBP2,and Gli3 can bind with both R-Smads. In some cases,these DNA-binding proteins also receive inputs from other signaling pathways as indicated.Smads can then modulate gene expression b y recruiting either coactivators or corepressors.Interactions with proteins such as Evi-1 and E1A can block Smad-mediated transcriptional activation.(Cell,Vol. 100,Jeffrey L2000)
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Smad的转录活性还依赖于辅激活因子的作用。Smad或3可增强Smad3的转录活性，这说明R-S mad的寡聚作用可以调节转录活性[18]。虽然Smad4本身不能激活转录，但它是Smad 复 合物中重要的辅激活因子。在Smad2/4与FAST-1的相互作用中，Smad4促进Smad复合物与D NA启动 子的结合[15]。在Smad2/4与FAST-2作用中，Smad4与DNA结合才能启动转录[ 16 ]。另外，Smad4辅激活因子还能稳定Smad复合物与通用转录因子的作用。[15，18 ]。这些都说明了为什么Smad4能够大大增强Smad1,2,3的转录活性。
CBP/p300也是Smad活性的重要辅助因子。已有研究证实，TGF-β介导的p15和p21的表达需 要CBP/p300的参与[31]。在HaCaT细胞中，E1A可以阻止TGF-β介导的生长抑制作 用 ，另外它也可以结合Rb并使Rb失活。而这些作用都来自于它与CBP/p300的结合，这种结合阻 碍了TGF-β介导的p15和p21的表达，从而使cyclin/CDK不受阻抑[32]。CBP/p300 能够把特异序列的激活因子转到通用转录复合物的附近，乙酰化组蛋白，修饰染色质的结构 。 CBP/p300是Smad2/Smad3的辅助激活因子，它们与Smad的C端结构直接作用[18,33,34,3 5]。在TGF-β的诱导下Smad3与CBP/p300结合，而Smad3C端的磷酸化促进这种结合。S mad3 必须结合CBP/p300才能激活转录。缺失C端的Smad3不能结合CBP，因而不能激活转录，而CBP 的作用受到影响也会抑制Smad3/4和TGF-β诱导的转录。因此，CBP/p300表达的增强可以 增 加Smad3的转录活性。但在缺乏Smad4的情况下，CBP不能发挥作用，这可能是因为Smad4能使 Smad3/CBP复合物稳定[18]。由于CBP/p300是多种转录因子的辅激活物，所以它们 促 进了Smad信号与其他信号通路的交联。Stat和Smad信号整合就说明了这一点。CBP/p300可以 使Stat3和Smad1在编码胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)基 因 的启动子处形成复合物[36]。细胞因子LIF(Leukemia inhibitory factor)通过受 体 相连的SAK激酶的酪氨酸磷酸化作用活化Stat3,活化的Stat3转移到核内，与特定基因的启动 子结合，并与p300N端序列相互作用诱导基因转录。BMP受体活化的Smad1与Smad4的复合物与 p300 N端序列相互作用诱导基因转录。BMP受体活化的Smad1与Smad4的复合物与p300 C端 相互 作用，所以很可能在GFAP启动子上也有一段结合序列。Stat3和Smad1与p300不同区段的相互 作用为不同信号通路转录水平的交联提供了另一种可能的机制。另有实验表明，在细胞活化 过程中，TGF-β可以抑制白介素12或4介导的Jak-Stat信号通路，这也说明了Stat和Smad 信号传递之间的交联[37，38]。
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上述研究表明，Smad蛋白家族是TGF-β信号通路的胞内信号蛋白，而且作为转录因子介导T GF-β效应。同时，Smad还受到多种其他信号通路的调控，并与多种通路调节的其他转录因 子协同作用，共同调控目的基因的表达。以往的研究已证实TGF-β信号通路与MAPK、SAPK/ JNK、JAK/STAT等通路相关。Vitamin D3 与VitaminD受体结合，并激活VitaminD受体。Vita min D受体是核受体家庭成员，它在配体结合状态下可直接作用与特定启动子的VitaminD效 应元件从而介导Vitamin D的转录效应。在 SRC-1/TIE-2(steroid receptor coactivator - 1/transcriptional intermediary factor 2)蛋白家族成员存在时，Smad3可与Vitamin D受 体结合增强 Vitamin D受体的转录活性[39]。
总之，Smad蛋白的发现及对其功能的研究使我们对TGF-β信号通路有了清晰的了解，作为 信号蛋白，Smad与其他通路的交联，可能是胞内各信号通路整合的机制之一。另外，Smad与 其他通路转录因子的协同作用，也体现了信号传递的交联，并为TGF-β及其相关因子的多 功 能效应提供了理论依据，对Smad蛋白参与信号传递诱导基因转录作用分子机理的研究有助于 揭示TGF-β多功能作用的分子基础，并为阐明胞内信号通路之间的交联提供了新的线索。
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【收稿日期】2000-08-31 【修回日期】2000-09-15, http://www.100md.com
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转化生长因子β(transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子 亚家族组成，其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子( GDF)等[1]。TGF-β除了影响细胞的增殖、分化，还在胚胎发育、胞外基质形成、 骨的形成和重建等方面起着重要作用。TGF-β家族成员广泛存在于从果蝇到人多种生物的 各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着显著作用。
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【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39780014)，国家重点基础研 究项目(G1999053901)，北京市自然科学基金资助项目(7961001)(G10000539901)
【作者简介】 汪娟(1975—)，女(汉族)，河南省信阳市人，在读博士
转化生长因子β(transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子 亚家族组成，其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子( GDF)等[1]。TGF-β除了影响细胞的增殖、分化，还在胚胎发育、胞外基质形成、 骨的形成和重建等方面起着重要作用。TGF-β家族成员广泛存在于从果蝇到人多种生物的 各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着显著作用。
由于TGF-β作用的多功能性和广泛性，所以从1981年Robert[2]发现TGF￣β以来 ，对它的研究是沿着不同的路线进行的，但对其信号传导的通路一直不清楚。直到近来发现 了细胞内信号转导蛋白Smad家族，才较深入地阐明了TGF-β信号从膜到核转运的分子机理 。
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TGF-β家族成员通过与两种类型的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体异源复合物结合，启动了细 胞反应。胞内信号蛋白Smads被受体激酶活化，形成异源蛋白复合物转移到核内，与特定的D NA序列结合，指导转录，从而实现TGF-β对基因表达的调控。
通过EST文库和cDNA文库筛选，已经在脊椎动物中至少已克隆出9种Smad基因[3],在 Drosophila(果蝇)和Caenorhabditis elegans(尼采蝇) 中发现 了它们的同源物。Smad蛋白的分子量大约在42kD到60kD，其N端和C端各有一段高度保守的区 域，分别称为MH1区和MH2区(mad￣homology domain ),中间有一段富含pro的L区连接。 在非活性状态下，Smad的MH1区和MH2区相互作用，形成自我抑制，被受体激活后，分子 打开，Smad形成异源复合物，转移到核内。
, 百拇医药 不同的Smad家族在信号传递中作用不同。根据结构和功能上的特点，Smad蛋白被分为3类：( 1)R-Smad (receptor-activated Smads),包括Smad1、2、3、5、8，它们是Ⅰ型受体激酶 的底物，具有通路特异性(pathway-restricted)(2)Co-Smad(common￣mediator sm ads),脊 椎动物中Smad4属于此类，它通过此类与R-Smad的结合，参与信号传递；(3)I-Smads(inhi bitory Smads),包括Smad6,7，它们抑制R-Smad的信号传递功能(附表)。附表 Smad蛋白家族
Table The Smad family 配体
ligand
R-Smad
Co-Smad
, 百拇医药 I-Smad
脊椎动物
vertebrate
BMPs
activin,TGF-β
Unknown
果蝇
Smad1,5,8
Smad2,3
Smad4
Smad4
Smad10注
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Smad6(Sma d7)
Smad7(Smad6)
Drosophila
Dpp
dActivin
尼采蝇
MAD
dSmad2
Me dea
DAD
C.elegans
Dbl-1
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Daf-7
Sma-2,-3
Daf-8,-14
Sma-4
Daf-3
注：Smad10[4]与Smad4有高度保守的序列。因此，被归为Co-Smad。
Smad10 shares a high level of sequence identity with Smad4.Thus it is ragarded a s Co-Smad.
1.Smad信号传递与其他通路的交联(crosstalk)
现在对Smads如何介导配体信号激活目的基因转录的机制已大致清楚。TGF-β超家族成员先 与细胞膜上的TGF-βⅡ型受体结合，然后吸收Ⅰ型受体在细胞膜上形成一个异源复合物， Ⅰ型受体被Ⅱ受体激酶磷酸化并被激活，活化的Ⅰ型受体与R-Smads暂时结合，磷酸化R-S madsC端SS(V/M)S区的ser残基。Smad1,5,8被BMP受体磷酸化，介导BMP信号，而Smad2,3被 activin和TGF-β受体所活化，介导这些因子的效应。受体对R-Smads的磷酸化使活化的Sm ads构象发生变化后从受体上解离下来，并与Smad4结合。结合后异源寡聚物转移到核内，激 活特定基因的转录。(图1)
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近年来，随着对不同信号通路间相互交联(crosstalk)的研究，人们发现Smads蛋白不仅受 T GF-β信号的调节，而且很多信号通路对其都有调控作用。Smad信号和生长因子激活的酪氨 酸激酶受体信号以及随后的MAPK通路在若干水平上发生交联。有研究发现，EGF和HGF激活的 酪氨酸激酶受体可以激活依赖于Smad2的基因表达。这种效应是由于Smad2的磷酸化所致。但 是这种磷酸化不是发生在activin和TGF-β受体激酶作用的C端ser位点上[5]。虽 然 还需要进一步确定上述激酶的效应，但上述结果仍然显示Smad的激活可能并不仅仅依赖于TG F-β相关因子受体。Smad2还可以被MEKK-1(MAPK kinase kinase-1)所激活。MEKK-1是S AP K/JNK(stress-activated protein kinase/c-Jun Nterminal kinase)通路的激活物。ME KK-1对Smad2的磷酸化加强了Smad2～Smad4的相互作用和核内积累，同时也增强了Smad2与 转录辅激活因子CBP(CREB-binding protein)的结合[6]。另外，MEKK-1，JNK1和 MEK-4(MEK-4是JNK上游的一种激活因子)的显性失活形式会抑制TGF-β诱导的基因表达， 这都显示了SAPK/JNK通路参与了TGF-β信号传递[6～8]。但目前还不清楚HGF和EG F对Smad2的激活作用是否是SAPK/JNK通路对其磷酸化的结果。
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图1 TGF-β/SMAD通路
Fig.1 The transforming growth factor β(TGF-β)/SMAD pathway
与SAPK/JNK通路的正调作用相比，传统的MAPK/ERK(mitogen-activated protein kinase/extracellular-sigal-related kinase)通路可能是Smad信号传递的负调因子。MAP激酶Er k可以磷酸化Smad1L区段PXSP单元的ser残基[9]。这种磷酸化作用会抑制Smad1的核 转 移和转录激活作用，这说明酪氨酸激酶受体抑制BMP的信号传递。同样，活化的MAPK Kinase 1(MEK-1)或癌基因产物Ras也可以诱导TGF￣β活化的Smad2和Smad3核内的积累和依赖于Sma d的转录[10]。现在还不清楚SAPK/JNK或MAPK/Erk对Smads的磷酸化作用是否发生在 同一位点。但是，上述发现证明了Smads能够整合来源于细胞内不同信号的通路。
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酪氨酸激酶受体通路对Smad信号通路的抑制作用还可以通过诱导抑制型Smad6和Smad7的表达 而实现。EGF具有与TGF-β相似的诱导Smad6和Smad7表达的作用。另外，PKC的激活剂PMA在 激活MAPK通路的同时大大增强了TGF-β诱导的Smad6和Smad7的表达[11]。干扰素 γ 通过激活酪氨酸激酶Jak1，然后磷酸化转录因子Stat1而发生作用。已经发现干扰素γ可以 诱导Smad7的表达，但不能诱导Smad6[12]。对抑制型Smad的诱导可以抑制R-Smad 的信号 传递作用，从而抑制TGF-β家族成员的作用。因此，诱导抑制型Smad的表达可能是Jak-S tat通路反式调控Smad信号传递的机制。
综上所述，Smad不仅是TGF-β通路的胞内信号蛋白，而且受到多种信号通路的影响。这 些都说明了不同信号在胞内的整合作用。
2.Smad蛋白与基因转录
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2.1 Smad与DNA启动子序列的结合：在过去的十几年中，在不同的启动子中已经发现了多 种TG F-β和活化素的效应元件，但它们没有明显一致的序列，只是发现TGF-β诱导的转录作用 常常需要一些已知的转录因子如AP-1，Sp1,CTF/NT-1之类的结合位点。近年来人们才逐步 了解Smads调节转录的机制，Smads与启动子序列直接结合，并与其他转录因子一起协同调节 转录。
进入核以后，磷酸化的Smads异源复合物与效应物配体的启动子序列之间相互作用，调节转 录。首次被确证与Smads结合作用于启动子DNA的蛋白是FAST(forehead activin signal tr ansducer)。介导activin效应的Smad2/4复合物与FAST-1结合，作用于非洲爪蟾的Mix2 启动 子，FAST-1是一种翼状螺旋转录因子，是activin的效应元件[13，14]。在上述 过 程中,Smad2与FAST-1之间是直接作用的，而Smad4则是通过它与Smad2的结合，参与到Smad2 /FAST-1复合物中[14,15]。Smad2/4复合物还通过类似的方式作用于小鼠的 goosecoid启动子。不过，在goosecoid启动子上，参与结合的是 FAST -2，而不是FASF1，FAST-2与FAST-1结构上相关，它所结合的序列与FAST-1的相似 [16]。Smad 3/4与PAI-1[17～19]，JunB[20],collagenase[21]等启动子的 作用也与上述过程类似。
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Smads与确定的启动子序列直接作用，这一点让人有些吃惊。因为第1篇报道Smad2和 Mix2启动子之间作用的文章强调它们是通过FAST-1间接作用的[13]。 但是 ，现在已经有很多文献说明了Smads在不同启动子中是与DNA直接结合的。果蝇中Mad直接结 合vestigial启动子上GC富集序列。但全长的Mad不能结合这段序列，只有去除C端结构 域的M ad才能结合[22]。C端结构域抑制N-L区段与DNA的结合，这种现象可以用N，C结构 域 的相互作用来解释。通常状态，N，C结构域相互作用，受体激活时，才暴露N，C区段[ 2 3]。Medea的N端结构域也同样作用于tinman启动子的GC富集区[24]。
通过PCR技术选择，Smad3和Smad4的最佳DNA结合序列被确定。这个made结合元件的序列是 GTCTAGAC，具有两个拷贝的GTCT回文序列，在它的互补链上是反向互补的AGAC序列。TGF- β诱导的转录激活作用必须有这段序列的串联重复[25]。Smad3和4也结合象TGAGTC AGA这样的序列，它是AP-1结合位点TGAGCA与Smad结合序列AGAC的交错重叠[21,26] 。 在PAI-1和JunB启动子中，Smad3和4直接结合CAGA序列[17,20]。这些序列与Smad 结 合元件的多联化能够发挥TGF-β和Smad3/4的作用，这些序列包括了串联重复的 AGAC或反 向互补序列GTCT。与Mad跟DNA结合的特性一致，C端结构域的缺失也能够大大增强Smads与这 些序列的亲合力[17，21，25]。
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晶体学的分析也证实了Smad3的N端结构域与Smad结合元件之间的直接作用[27]。晶 体 分析结果显示，Smad3N端结构域11个氨基酸的β发夹结构插入到DNA大沟中，与特异的GTCT 序列联接。β发夹结构中的3个氨基酸残基与大沟中的3个碱基形成5个氢键以及另外3处与DN A磷酸骨架的联系。GTCT序列上单个的碱基突变会降低DNA与Smad的亲合力[25]。这 些 都说明GTCT(或AGAC)是Smad3的最佳结合序列。GTCT序列上第2个残基与Smad3的N端没有直接 的联系[27]，它的突变几乎不改变DNA的亲合力[17,21,25]。
值得一提的是，尽管Smad2和Smad3有92%的序列同源性，但Smad2不结合上述序列，这也说 明Smad2和3在功能上不等同。这种不同可能是由于Smad2N端的β发夹结构之前，恰好插入了 一段30个氨基酸残基的序列，干扰了DNA的识别[27]。Smad2和Smad3在DNA结合特性 上 的差异也说明了为什么Smad3不能替代Smad2激活goosecoid启动子的转录 。[16]。
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2.2 Smad与核内其他因子的协同作用：在TGF-β/activin/BMP信号通路中，通过实验表明 Smads与DNA结合蛋白在基因转录调节中 存在协同作用，即Smads的转录激活作用不仅依赖于自身与DNA序列的结合，也需要与其他转 录因子一起构成核蛋白复合物而起作用。Smads蛋白家族可通过结合不同蛋白去调节靶基因 的转录。图2如活化素和Smads2/4介导的Mix2或goosecoid等启动子的转录作用，必 须在Sma d2和FAST-1或2的相互作用下才能完成[14～16]。Smad3的N-C区段与C-Jun相 互 作用，C区段与C-Fos相互作用，形成多蛋白复合体，在启动子的AP-1-Smad3结合序列上 结合。Smad3/4与C-Jun/C-Fos的协同作用使启动子在TGF-β的诱导下转录[21,2 8 ]。Smads3/4还与TTE-3蛋白协同诱导TGF-β效应元件PAII-1启动子的转录。虽然还没 有发现Sm ad3/4与TFE-3之间的作用，但这3种蛋白都作用于启动子的1个区段，这个序列既包括了TF E-3结合的Ebox的序列，也包括了1个Smad3的结合位点[19]。CKIp15和p21的启动 子 对TGF-β效应定位在Sp-1结合点上，说明TGF-β介导的Smad的转录激活作用需要Sp1蛋白 [29]。Smad3与C-Jun[21],Smad2与FAST-1[14]或FAST-2 [16]结合都依赖膜受体的激活作用。
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果蝇中，对Dpp诱导的tinman和Ubx启动子的转录作用 的分 析，进一步证明了上述的协同转录模式。同时具有Medea/Mad和Tinman结合位点的启动子才 能诱导tinman的转录。因此，Dpp介导的Medea/Mad复合体可能是和Tinman 蛋白一起协同介导tinman的转录。[24]。同样， Ubx[ WTBZ〗 启动子既有Mad的结合序列，也包括一段CRE(CAMP效应元件)，Dpp诱导转录需要它们，因此M edea/Mad复合物与CREB协同诱导Ubx转录。[30]。
虽然只发现了Smads与FAST-1和FAST-2，C-Jun/C-Fos的直接作用，但在配体诱导下， Smad可与其他转录因子结合发挥协同作用。Smad3在这种作用下增强了C-Jun在AP-1结合位 点 处的活性[21]。但仍不清楚FAST-1和FAST-2是本身具有转录活性，还是在Smad2/ 4的转录作用中仅仅充当衔接子的角色。也不确定，Smad3/4是否加强了TFE-3本身的转录活 性 。虽然已经发现Smad与多种信号通路中的转录因子协同作用，但这种作用的结构基础仍需探 讨。
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图2 Smads核内伴侣
在核内，R-Smad/Smad4复合物与调节的基因转录的多种蛋白相互作用。不同的DNA结合蛋白 能够特异地与Smad1或Smad2/3结合。SIP1、PEBP2和Gli3与两种R-Smads都可结合。在有些 情 况下，这些DNA结合蛋白也同时受到其他信号通路的调控。Smads可以通过与辅激活物或辅抑 制物 的相互作用调整基因表达。而E1A和Evi-1与Smads的相互作用可阻抑Smad介导的转录激活作 用。(引自 Cell, Vol.100,Jeffrey L 2000)*方框中表示转录调节蛋白。
Fig.2 The nuclear partners for Smads
In the nucleus,the R-Smad/Smad4 complex interacts with a variety of proteins to regulate transcription of target genes. Various DNA-binding proteins can inte r act specifically with either Smad1 or Smad2/3.SIP1,PEBP2,and Gli3 can bind with both R-Smads. In some cases,these DNA-binding proteins also receive inputs from other signaling pathways as indicated.Smads can then modulate gene expression b y recruiting either coactivators or corepressors.Interactions with proteins such as Evi-1 and E1A can block Smad-mediated transcriptional activation.(Cell,Vol. 100,Jeffrey L2000)
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Smad的转录活性还依赖于辅激活因子的作用。Smad或3可增强Smad3的转录活性，这说明R-S mad的寡聚作用可以调节转录活性[18]。虽然Smad4本身不能激活转录，但它是Smad 复 合物中重要的辅激活因子。在Smad2/4与FAST-1的相互作用中，Smad4促进Smad复合物与D NA启动 子的结合[15]。在Smad2/4与FAST-2作用中，Smad4与DNA结合才能启动转录[ 16 ]。另外，Smad4辅激活因子还能稳定Smad复合物与通用转录因子的作用。[15，18 ]。这些都说明了为什么Smad4能够大大增强Smad1,2,3的转录活性。
CBP/p300也是Smad活性的重要辅助因子。已有研究证实，TGF-β介导的p15和p21的表达需 要CBP/p300的参与[31]。在HaCaT细胞中，E1A可以阻止TGF-β介导的生长抑制作 用 ，另外它也可以结合Rb并使Rb失活。而这些作用都来自于它与CBP/p300的结合，这种结合阻 碍了TGF-β介导的p15和p21的表达，从而使cyclin/CDK不受阻抑[32]。CBP/p300 能够把特异序列的激活因子转到通用转录复合物的附近，乙酰化组蛋白，修饰染色质的结构 。 CBP/p300是Smad2/Smad3的辅助激活因子，它们与Smad的C端结构直接作用[18,33,34,3 5]。在TGF-β的诱导下Smad3与CBP/p300结合，而Smad3C端的磷酸化促进这种结合。S mad3 必须结合CBP/p300才能激活转录。缺失C端的Smad3不能结合CBP，因而不能激活转录，而CBP 的作用受到影响也会抑制Smad3/4和TGF-β诱导的转录。因此，CBP/p300表达的增强可以 增 加Smad3的转录活性。但在缺乏Smad4的情况下，CBP不能发挥作用，这可能是因为Smad4能使 Smad3/CBP复合物稳定[18]。由于CBP/p300是多种转录因子的辅激活物，所以它们 促 进了Smad信号与其他信号通路的交联。Stat和Smad信号整合就说明了这一点。CBP/p300可以 使Stat3和Smad1在编码胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)基 因 的启动子处形成复合物[36]。细胞因子LIF(Leukemia inhibitory factor)通过受 体 相连的SAK激酶的酪氨酸磷酸化作用活化Stat3,活化的Stat3转移到核内，与特定基因的启动 子结合，并与p300N端序列相互作用诱导基因转录。BMP受体活化的Smad1与Smad4的复合物与 p300 N端序列相互作用诱导基因转录。BMP受体活化的Smad1与Smad4的复合物与p300 C端 相互 作用，所以很可能在GFAP启动子上也有一段结合序列。Stat3和Smad1与p300不同区段的相互 作用为不同信号通路转录水平的交联提供了另一种可能的机制。另有实验表明，在细胞活化 过程中，TGF-β可以抑制白介素12或4介导的Jak-Stat信号通路，这也说明了Stat和Smad 信号传递之间的交联[37，38]。
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上述研究表明，Smad蛋白家族是TGF-β信号通路的胞内信号蛋白，而且作为转录因子介导T GF-β效应。同时，Smad还受到多种其他信号通路的调控，并与多种通路调节的其他转录因 子协同作用，共同调控目的基因的表达。以往的研究已证实TGF-β信号通路与MAPK、SAPK/ JNK、JAK/STAT等通路相关。Vitamin D3 与VitaminD受体结合，并激活VitaminD受体。Vita min D受体是核受体家庭成员，它在配体结合状态下可直接作用与特定启动子的VitaminD效 应元件从而介导Vitamin D的转录效应。在 SRC-1/TIE-2(steroid receptor coactivator - 1/transcriptional intermediary factor 2)蛋白家族成员存在时，Smad3可与Vitamin D受 体结合增强 Vitamin D受体的转录活性[39]。
总之，Smad蛋白的发现及对其功能的研究使我们对TGF-β信号通路有了清晰的了解，作为 信号蛋白，Smad与其他通路的交联，可能是胞内各信号通路整合的机制之一。另外，Smad与 其他通路转录因子的协同作用，也体现了信号传递的交联，并为TGF-β及其相关因子的多 功 能效应提供了理论依据，对Smad蛋白参与信号传递诱导基因转录作用分子机理的研究有助于 揭示TGF-β多功能作用的分子基础，并为阐明胞内信号通路之间的交联提供了新的线索。
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