人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达
作者：左亚刚 王家璧 王宝玺
单位：100730北京，中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院皮肤科
关键词：乳头状瘤病毒；人；质粒；角蛋白细胞；转染
中华皮肤科杂志000418
【摘要】目的利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞，观察HPV16mRNA在转染细胞的表达。方法用FuGENETM6转染试剂，将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞，在转染后24h提取细胞总RNA和DNA，进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果24h后，RT-PCR成功地扩增出110bp的片段，转染细胞中已出现HPV16mRNA的表达，Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。
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Transient Expression of a Transfected HPV16 Whole Gene in Normal Human Keratinocytes
ZUO Yagang，WANG Jiabi，WANG Baoxi.
(Department of Dermatology, Beijing Union Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Beijing 100730)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of HPV16 mRNA in normal human keratinocytes transfected with a plasmid containing HPV16 whole gene. Methods Normal human keratinocytes were cultured in vitro with HPV16 whole gene and FuGENETM 6, a transfecting reagent, then total RNA and DNA were extracted. RT- PCR and Southern blot were used to identify the expression of HPV16 mRNA and DNA, respectively. Results Tweenty four hours after transfection HPV mRNA was expressed in transfected human keratinocytes and a 110 bp product was successfully amplified by RT-PCR method.A 7.9 kb DNA fragment, which corresponded to HPV16 whole gene, was confirmed in the transfected keratinocytes by Southern blot analysis. Conclusion Tweenty four hours after transfection of normal human keratinocytes with pSV2- neo/16,the expression of HPV16 mRNA and DNA was successfully detected.
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【Key words】 Papillomavirus, human Plasmids Keratinocytes Transfection
人类乳头瘤病毒(HPV)感染已成为一种最常见的性传播疾病之一，已发现80多种HPV型别 ，其中45种与生殖道粘膜上皮细胞有关[1-3]。HPV感染后不仅表现为良性皮损，如尖锐 湿疣，有些型别还会导致癌变[4，5]。目前许多关于HPV的研究如基因转录调节机制、 HPV对细胞分化转化作用以及HPV治疗药物的筛选等方面都通过将HPV基因转入细胞进行 表达，最常用的细胞是永生化宫颈癌细胞系[6]。而人表皮角质形成细胞是HPV感染的天 然靶细胞，因其培养较困难，且转染效率较低[7]，有关原代角质形成细胞基因转染的报 道相对较少，且大部分研究是将HPVE6、E7或其他早期区基因转入细胞。我们利用HPV全 长基因转入正常人角质形成细胞，为今后进行HPV的研究奠定基础。
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材料和方法
一、材料
1.标本：北京协和医院妇产科病房新生儿包皮。
2.试剂：质粒pSV2-neo/16由本科自备(该质粒是将HPV16全长基因克隆在pSV2-neo载体的 BamHⅠ酶切位点而构成的重组质粒,具有BamHⅠ、StuⅠ的单一切点)[8]，质粒提取纯化试 剂盒(中国协和医科大学生物技术开发中心)，RNA提取试剂盒(SABC公司)，地高辛 DNA标记及检测试剂盒、RT-PCR试剂盒、转染试剂FuGENETM6(BoehringerMannhein公司)。
3.仪器及器材：倒置相差显微镜(日本OlympusIX70型)、M154培养基(美国Cascade Biologics公司)、CO2孵箱(美国Napco5410型)、电泳仪及紫外透射仪(美国Bio-RAD)。
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二、方法
1.pSV2-neo/16质粒提取、纯化及鉴定：质粒提
1、2、3、6、7均为标本，4为Marker(pBR322/HinfⅠ)，5为阳性对照，8为未转染正常细胞
图2RT-PCR结果
取纯化按泛特津超纯质粒提取纯化试剂盒说明书进行。将纯化质粒用限制性内切酶 BamHⅠ、StuⅠ进行单酶切和双酶切分析，37℃孵育1h，酶切产物用质量分数为0.8%琼脂 糖电泳观察鉴定。
2.pSV2-neo/16转染正常人角质形成细胞：将新生儿包皮用0.25%胰酶4℃消化，无血清 M154培养基(含青霉素、链霉素、二性霉素B、牛垂体提取物和表皮生长因子等)培养原代 角质形成细胞。将第二代角质形成细胞分铺6孔板，细胞密度为2×104/孔，用FuGENETM 6转染试剂进行转染(FuGENETM6∶质粒DNA为9∶4)，转染后24h提取细胞总RNA和DNA。
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3.RT-PCR：按照BoehringerMannhein公司ExpandTM逆转录酶说明书进行。扩增cDNA上游引物和 下游引物分别如下：HPV16上游引物序列为5′-ATTAGTGAGTATAGACATTA-3′，下游引 物序列为5′-GGCACAACCCTAGGAGTTTCG-3′，扩增长度为110bp。PCR扩增条件如下： 94℃预变性2min，继之进行30个循环，包括94℃30s，60℃30s,72℃1min，最后72℃延伸7 min。将10μL扩增产物于质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察照相。
4.Southern印迹：主要步骤如下：提取转染细胞DNA后，BamHⅠ酶切，质量分数为0.8%琼脂 糖凝胶电泳1h，分别用变性液、中和液处理1h，在20×SSC溶液中毛细虹吸法转移16h， 晾干后80℃干烤2h备用。地高辛标记探针(随机引物法)按BoehringerMannhein公司地高辛标记 检测试剂盒说明书进行。变性后置预杂交袋(0.1%N-十二烷基肌氨酸钠盐，0.2%SDS， 1/10体积封阻液)，68℃杂交6h，洗膜后按BoehringerMannhein公司地高辛标记检测试剂盒说明 书进行酶联免疫检测。
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结果
1.质粒提取纯化后酶切鉴定：超纯质粒提取纯化后用限制性内切酶BamHⅠ、StuⅠ进行单 酶切和双酶切鉴定。结果如图1。因pSV2-neo/16是将HPV16全基因插入到pSV2-neo的 BamHⅠ酶切位点而构成的重组质粒，用BamHⅠ消化后，切下全长的HPV167.9kb。StuⅠ在 HPV16有单一切点，而在pSV2-neo上无酶切位点，故双酶切后出现3个片段，其中2个是 StuⅠ切开HPV16而形成的。
2.RT-PCR结果：pSV2-neo/16转染后24h即出现HPV16mRNA的表达，RT-PCR扩增出110bp的 片段，而未转染细胞无该片段。结果如图2。
3.Southern印迹结果：本研究用BamHⅠ消化转染细胞DNA，因HPV16基因中有BamHⅠ酶切位 点，且HPV16是以BamHⅠ酶切位点连接到载体中，经BamHⅠ酶切后应切下7.9kb片段。 Southern印迹杂交后结果显示，除7.9kb片段外还有一条杂交带，可能是HPV16DNA与宿主细 胞DNA发生了整合，BamHⅠ未能完全消化的结果。
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讨论
本研究将含有HPV全长基因的质粒pSV2-neo/16转入体外培养的正常人角质形成细胞中， 转染后24h在转染细胞中即出现了HPV16mRNA的表达，通过RT-PCR扩增出一110bp的片段 ，Southern印迹结果显示含有全长的HPV16基因(7.9kb)。
我们采用了携带HPV16全长的pSV2-neo/16质粒，是将HPV16全基因克隆在pSV2-neo载体的 BamHⅠ酶切位点而构成的重组质粒。采用HPV16而
1为BamHⅠ酶切结果，2为BamHⅠ和StuⅠ双酶切结果，3为未经酶切的质粒DNA，4为 Marker(λDNA/HindⅢ)图1限制性内切酶BamHⅠ和StuⅠ酶切结果
不用其他类型HPV，有2个原因：一是HPV16是高危型中最常见类型，在50%宫颈癌中出现 [9]。二是HPV16具有转化细胞的作用，其DNA可与细胞DNA发生整合，使E6、E7基因产物 过度表达，而致细胞发生转化达到永生化[10,11]，而HPV6、11型则不具有此功能。
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本研究旨在通过将外源HPV基因转入角质形成细胞观察其在细胞内的表达，为进一步筛 选HPV治疗药物以及判断疗效打下基础。HPVDNA转染细胞后其mRNA的表达情况可通过 RT-PCR检测出来。当将药物作用于转染细胞后，若该药物对HPVDNA有抑制作用，则首 先使HPV16mRNA表达水平下降，与未转染的正常细胞同时进行RT-PCR检测，即可判断药 物疗效。总之，本研究利用HPV16全基因对正常人角质形成细胞进行了转染，为进一步 研究HPV打下了基础。
卫生部科研基金资助课题(96-1-054)
参考文献
[1]Meyer T, Arndt R, Christophers E, et al. Association of rare HPV types with genital premalignant and malignant lesions. J Infect Dis, 1998,178:252- 255.
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[2]Dianzani C, Calvieri S, Pierangeli a, et al. The detection of HPV DNA in skin tags. Br J Dermatol, 1998,138:649- 651.
[3]Egawa K, Honda Y, Inaba Y, et al. Pigmented viral warts: a clinical and histopathological study including HPV typing. Br J Dermatol, 1998,138:381- 389.
[4]Tseng CJ, Tseng LH, Lai CH. Identification of HPV types 16 and 18 deoxyxibonucleic acid sequence in bulky cervical cancer after chemotherapy. Am J Obstet Gynecol, 1997,176:865- 869.
, 百拇医药
[5]Tyring S. Perspectives on human papillomavirus infection. Am J Med, 1997,102(5A):1- 2.
[6]Dollard SC, Broker TS, Chow L. Regulation of the human papillomavirus type 11 E6 promoter by viral and host transcription factors in primary human keratinocytes. J Virol, 1993,67:1721- 1726.
[7]Lee JI, Taichman LB. Transient expression of a transfected gene in cultured epidermal keratinocytes: implications for future studies. J Invest Dermatol, 1989,92:267- 271.
, 百拇医药
[8]McCance DJ, Kopan P, Fuchs E, et al. Human papillomavirus type 16 alters human epithelial cell differentiation in vitro.Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:7169- 7173.
[9]White WI, Wilson SD, Bonnez W, et al. In vitro infection and type-restricted antibody mediated neutralization of anthentic human papillomavirus type 16. J Virol, 1998,72:959- 964.
[10]Zaki SR, Judd R, Coffield LM, et al. Human papillomavirus infection and anal carcinoma: retrospective analysis by in situ hybridization and the polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1992,140:1345- 1355.
[11]Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, et al. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol, 1992,79:328- 337.
(收稿日期：1999-07-12), 百拇医药
单位：100730北京，中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院皮肤科
关键词：乳头状瘤病毒；人；质粒；角蛋白细胞；转染
中华皮肤科杂志000418
【摘要】目的利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞，观察HPV16mRNA在转染细胞的表达。方法用FuGENETM6转染试剂，将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞，在转染后24h提取细胞总RNA和DNA，进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果24h后，RT-PCR成功地扩增出110bp的片段，转染细胞中已出现HPV16mRNA的表达，Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。
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Transient Expression of a Transfected HPV16 Whole Gene in Normal Human Keratinocytes
ZUO Yagang，WANG Jiabi，WANG Baoxi.
(Department of Dermatology, Beijing Union Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Beijing 100730)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of HPV16 mRNA in normal human keratinocytes transfected with a plasmid containing HPV16 whole gene. Methods Normal human keratinocytes were cultured in vitro with HPV16 whole gene and FuGENETM 6, a transfecting reagent, then total RNA and DNA were extracted. RT- PCR and Southern blot were used to identify the expression of HPV16 mRNA and DNA, respectively. Results Tweenty four hours after transfection HPV mRNA was expressed in transfected human keratinocytes and a 110 bp product was successfully amplified by RT-PCR method.A 7.9 kb DNA fragment, which corresponded to HPV16 whole gene, was confirmed in the transfected keratinocytes by Southern blot analysis. Conclusion Tweenty four hours after transfection of normal human keratinocytes with pSV2- neo/16,the expression of HPV16 mRNA and DNA was successfully detected.
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【Key words】 Papillomavirus, human Plasmids Keratinocytes Transfection
人类乳头瘤病毒(HPV)感染已成为一种最常见的性传播疾病之一，已发现80多种HPV型别 ，其中45种与生殖道粘膜上皮细胞有关[1-3]。HPV感染后不仅表现为良性皮损，如尖锐 湿疣，有些型别还会导致癌变[4，5]。目前许多关于HPV的研究如基因转录调节机制、 HPV对细胞分化转化作用以及HPV治疗药物的筛选等方面都通过将HPV基因转入细胞进行 表达，最常用的细胞是永生化宫颈癌细胞系[6]。而人表皮角质形成细胞是HPV感染的天 然靶细胞，因其培养较困难，且转染效率较低[7]，有关原代角质形成细胞基因转染的报 道相对较少，且大部分研究是将HPVE6、E7或其他早期区基因转入细胞。我们利用HPV全 长基因转入正常人角质形成细胞，为今后进行HPV的研究奠定基础。
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材料和方法
一、材料
1.标本：北京协和医院妇产科病房新生儿包皮。
2.试剂：质粒pSV2-neo/16由本科自备(该质粒是将HPV16全长基因克隆在pSV2-neo载体的 BamHⅠ酶切位点而构成的重组质粒,具有BamHⅠ、StuⅠ的单一切点)[8]，质粒提取纯化试 剂盒(中国协和医科大学生物技术开发中心)，RNA提取试剂盒(SABC公司)，地高辛 DNA标记及检测试剂盒、RT-PCR试剂盒、转染试剂FuGENETM6(BoehringerMannhein公司)。
3.仪器及器材：倒置相差显微镜(日本OlympusIX70型)、M154培养基(美国Cascade Biologics公司)、CO2孵箱(美国Napco5410型)、电泳仪及紫外透射仪(美国Bio-RAD)。
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二、方法
1.pSV2-neo/16质粒提取、纯化及鉴定：质粒提
1、2、3、6、7均为标本，4为Marker(pBR322/HinfⅠ)，5为阳性对照，8为未转染正常细胞
图2RT-PCR结果
取纯化按泛特津超纯质粒提取纯化试剂盒说明书进行。将纯化质粒用限制性内切酶 BamHⅠ、StuⅠ进行单酶切和双酶切分析，37℃孵育1h，酶切产物用质量分数为0.8%琼脂 糖电泳观察鉴定。
2.pSV2-neo/16转染正常人角质形成细胞：将新生儿包皮用0.25%胰酶4℃消化，无血清 M154培养基(含青霉素、链霉素、二性霉素B、牛垂体提取物和表皮生长因子等)培养原代 角质形成细胞。将第二代角质形成细胞分铺6孔板，细胞密度为2×104/孔，用FuGENETM 6转染试剂进行转染(FuGENETM6∶质粒DNA为9∶4)，转染后24h提取细胞总RNA和DNA。
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3.RT-PCR：按照BoehringerMannhein公司ExpandTM逆转录酶说明书进行。扩增cDNA上游引物和 下游引物分别如下：HPV16上游引物序列为5′-ATTAGTGAGTATAGACATTA-3′，下游引 物序列为5′-GGCACAACCCTAGGAGTTTCG-3′，扩增长度为110bp。PCR扩增条件如下： 94℃预变性2min，继之进行30个循环，包括94℃30s，60℃30s,72℃1min，最后72℃延伸7 min。将10μL扩增产物于质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察照相。
4.Southern印迹：主要步骤如下：提取转染细胞DNA后，BamHⅠ酶切，质量分数为0.8%琼脂 糖凝胶电泳1h，分别用变性液、中和液处理1h，在20×SSC溶液中毛细虹吸法转移16h， 晾干后80℃干烤2h备用。地高辛标记探针(随机引物法)按BoehringerMannhein公司地高辛标记 检测试剂盒说明书进行。变性后置预杂交袋(0.1%N-十二烷基肌氨酸钠盐，0.2%SDS， 1/10体积封阻液)，68℃杂交6h，洗膜后按BoehringerMannhein公司地高辛标记检测试剂盒说明 书进行酶联免疫检测。
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结果
1.质粒提取纯化后酶切鉴定：超纯质粒提取纯化后用限制性内切酶BamHⅠ、StuⅠ进行单 酶切和双酶切鉴定。结果如图1。因pSV2-neo/16是将HPV16全基因插入到pSV2-neo的 BamHⅠ酶切位点而构成的重组质粒，用BamHⅠ消化后，切下全长的HPV167.9kb。StuⅠ在 HPV16有单一切点，而在pSV2-neo上无酶切位点，故双酶切后出现3个片段，其中2个是 StuⅠ切开HPV16而形成的。
2.RT-PCR结果：pSV2-neo/16转染后24h即出现HPV16mRNA的表达，RT-PCR扩增出110bp的 片段，而未转染细胞无该片段。结果如图2。
3.Southern印迹结果：本研究用BamHⅠ消化转染细胞DNA，因HPV16基因中有BamHⅠ酶切位 点，且HPV16是以BamHⅠ酶切位点连接到载体中，经BamHⅠ酶切后应切下7.9kb片段。 Southern印迹杂交后结果显示，除7.9kb片段外还有一条杂交带，可能是HPV16DNA与宿主细 胞DNA发生了整合，BamHⅠ未能完全消化的结果。
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讨论
本研究将含有HPV全长基因的质粒pSV2-neo/16转入体外培养的正常人角质形成细胞中， 转染后24h在转染细胞中即出现了HPV16mRNA的表达，通过RT-PCR扩增出一110bp的片段 ，Southern印迹结果显示含有全长的HPV16基因(7.9kb)。
我们采用了携带HPV16全长的pSV2-neo/16质粒，是将HPV16全基因克隆在pSV2-neo载体的 BamHⅠ酶切位点而构成的重组质粒。采用HPV16而
1为BamHⅠ酶切结果，2为BamHⅠ和StuⅠ双酶切结果，3为未经酶切的质粒DNA，4为 Marker(λDNA/HindⅢ)图1限制性内切酶BamHⅠ和StuⅠ酶切结果
不用其他类型HPV，有2个原因：一是HPV16是高危型中最常见类型，在50%宫颈癌中出现 [9]。二是HPV16具有转化细胞的作用，其DNA可与细胞DNA发生整合，使E6、E7基因产物 过度表达，而致细胞发生转化达到永生化[10,11]，而HPV6、11型则不具有此功能。
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本研究旨在通过将外源HPV基因转入角质形成细胞观察其在细胞内的表达，为进一步筛 选HPV治疗药物以及判断疗效打下基础。HPVDNA转染细胞后其mRNA的表达情况可通过 RT-PCR检测出来。当将药物作用于转染细胞后，若该药物对HPVDNA有抑制作用，则首 先使HPV16mRNA表达水平下降，与未转染的正常细胞同时进行RT-PCR检测，即可判断药 物疗效。总之，本研究利用HPV16全基因对正常人角质形成细胞进行了转染，为进一步 研究HPV打下了基础。
卫生部科研基金资助课题(96-1-054)
参考文献
[1]Meyer T, Arndt R, Christophers E, et al. Association of rare HPV types with genital premalignant and malignant lesions. J Infect Dis, 1998,178:252- 255.
, http://www.100md.com
[2]Dianzani C, Calvieri S, Pierangeli a, et al. The detection of HPV DNA in skin tags. Br J Dermatol, 1998,138:649- 651.
[3]Egawa K, Honda Y, Inaba Y, et al. Pigmented viral warts: a clinical and histopathological study including HPV typing. Br J Dermatol, 1998,138:381- 389.
[4]Tseng CJ, Tseng LH, Lai CH. Identification of HPV types 16 and 18 deoxyxibonucleic acid sequence in bulky cervical cancer after chemotherapy. Am J Obstet Gynecol, 1997,176:865- 869.
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[6]Dollard SC, Broker TS, Chow L. Regulation of the human papillomavirus type 11 E6 promoter by viral and host transcription factors in primary human keratinocytes. J Virol, 1993,67:1721- 1726.
[7]Lee JI, Taichman LB. Transient expression of a transfected gene in cultured epidermal keratinocytes: implications for future studies. J Invest Dermatol, 1989,92:267- 271.
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[8]McCance DJ, Kopan P, Fuchs E, et al. Human papillomavirus type 16 alters human epithelial cell differentiation in vitro.Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:7169- 7173.
[9]White WI, Wilson SD, Bonnez W, et al. In vitro infection and type-restricted antibody mediated neutralization of anthentic human papillomavirus type 16. J Virol, 1998,72:959- 964.
[10]Zaki SR, Judd R, Coffield LM, et al. Human papillomavirus infection and anal carcinoma: retrospective analysis by in situ hybridization and the polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1992,140:1345- 1355.
[11]Lorincz AT, Reid R, Jenson AB, et al. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types. Obstet Gynecol, 1992,79:328- 337.
(收稿日期：1999-07-12), 百拇医药