川芎嗪对兔高眼压视神经轴突损伤保护作用的研究
作者：李兴英 杨连洲 康凤英 张士胜 李公宝 韩月香 翟玉梅
单位：李兴英 杨连洲 康凤英 张士胜(山东省潍坊医学院附属医院眼科 261031)；李公宝(山东省潍坊医学院附属医院中心实验室)；韩月香(山东省潍坊医学院附属医院药剂室)
关键词：川芎嗪；视神经；轴突；眼内压；实验；动物
中华眼科杂志000610 【摘要】 目的 探讨川芎嗪对兔持续性高眼压视神经轴突损伤的保护作用。方法 对36只新西兰白兔眼前房注入α-糜蛋白酶，制作成持续性高眼压模型后，随机等分为高眼压对照组和川芎嗪治疗组，治疗组于高眼压持续7 d始肌注川芎嗪，观察不同时间两组动物球结膜微循环变化及视神经轴突光、电镜结构改变。结果 与高眼压对照组相比，川芎嗪组结膜微循环障碍明显减轻(P<0.01)，视神经轴突数目多、直径小，占视神经面积百分比高(P<0.01)，且肿胀的视神经轴突结构基本正常。结论 川芎嗪可通过改善微循环状况，对兔高眼压视神经轴突起保护作用。
, http://www.100md.com
The protective effect of ligustrazine on optic nerve axons in rabbit eyes with continuous elevated IOP
LI Xingying, YANG Lianzhou, KANG Fengying, et al.
(Central laboratory, Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, Shandong 261031, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ligustrazine on optic nerve axons in rabbit eyes with continuous elevated intraocular pressure (IOP). Method Thirty-six NZ rabbits with continuous elevated IOP induced by injection of α-chymotrypsin into anterior chamber were divided into two groups by randomization: treatment and control group. Ten mg/kg ligustrazine injected into the treatment group every day for 3 weeks began on the 7th day after IOP elevated continuously. The changes of conjunctival microcirculation and optic nerve axonal ultrastructure were observed at different time points. Results The destruction of conjunctival microcirculation and axonal ultrastructure was milder in treatment group than that in the control group. In addition, the total number of axons and the percentage of axons in optic nerve area were higher, whereas the axonal diameter was smaller in the treatment group. Conclusion It is suggested that ligustrazine protect optic nerve axons from more damage induced by elevated IOP through improving ocular microcirculation.
, 百拇医药
【Key words】 Ligustrazine； Optic nerve； Axons； Intraocular pressure； Animal, laboratory
青光眼经手术治疗后，多数患者眼压能控制在正常水平，但部分患者视神经损害可继续发展。因此，除降低眼压外，如何保护视神经已成为青光眼防治的重要课题。以往的研究表明，血液流变学改变是原发性开角型青光眼的重要发病因素[1]。因此，从改善微循环角度探讨药物对视神经损害的保护作用，无疑将为青光眼的治疗提供新的途径。目前国内外尚未见报道有关高眼压损伤视神经的保护药物，为此，我们制作了兔持续性高眼压模型，研究了川芎嗪在不同时间对兔眼球结膜微循环的影响，并于光、电镜下观察视神经轴突的改变，以期为青光眼的治疗提供新手段。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药 1.动物：本院动物中心标准健康新西兰大白兔36只，体重2.0～3.0 kg，雌雄不限。
2.药物：无锡市第七制药厂生产的盐酸川芎嗪注射液。
二、方法
1.模型制作：将兔固定于实验架内，0.5%地卡因滴眼2或3次，开睑器开睑，由角膜缘透明区向前房内注入0.5 ml 1∶1 000 α-糜蛋白酶，30 min后测眼压，使眼压持续>50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，如眼压<50 mm Hg可补充注入0.2 ml。
2.动物分组:将36只大白兔随机等分为高眼压对照组和川芎嗪治疗组。治疗组于高眼压持续第7 d开始肌肉注射川芎嗪注射液10 mg/kg，每日2次，表1 两组各18只兔眼球结膜微循环指标积分值变化 组别
球结膜微循环指标积分值(
±s)
, 百拇医药
流速mm/s
微血管形态
血流状态
红细胞聚集
综合积分
高眼压组
204.84±74.21
1.53±0.87
4.31±1.85
2.4±1.2
8.24±3.93
川芎嗪组
, 百拇医药
480.15±86.34
0.38±0.29
1.56±0.73
1.2±0.4
3.24±1.42
t值
10.257
5.324
5.864
4.027
5.076
P值
, 百拇医药
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
表2 两组各18只兔眼视神经轴突定量图像分析结果 组别
视神经轴突定量指标(±s)
视神经轴突直径(μm)
视神经轴突数(根)
视神经轴突占视神经面积百分比(%)
, 百拇医药
对照组
1.279 0±0.099 7
151 166.223 3±25 026.333 0
34.781 2±6.601 6
川芎嗪组
1.053 3±0.029 9
210 133.313 3± 4 065.352 3
50.653 3±5.217 2
t值
9.212
9.267
, 百拇医药
8.004
P 值
<0.05
<0.05
<0.05
连用3周，对照组不做任何处理。
3.眼压测量:固定动物，0.5%地卡因滴眼，开睑，用Schiotz眼压计(苏州医疗器械厂生产)测量眼压，每日2或3次，如眼压<50 mm Hg，则用上述方法调整。
4.球结膜微循环检测:分别于高眼压持续7、10、20及30 d，将兔固定、麻醉、开睑，用WX-9A型微循环检测仪观测兔眼球结膜微血管形态、血流速度、血小板、红细胞聚集及管周状态等项指标。应用田牛加权积分法进行图像自动分析[2]。检测室温18～22℃。
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5.视神经标本制作及观察：将两组动物分别等分为3小组，于高眼压持续10、20、30 d，以气体栓塞法处死,摘取眼球,自球后1 mm范围内横切视神经取标本。各小组随机选择一只兔眼，用戌二醛固定，制作成电镜标本，经TEM-1200透射电镜观察视神经轴突超微结构改变。余各小组5只兔眼以中性甲醛固定，常规石蜡切片,HE染色,光镜观察视神经轴突情况,并行计算机图像分析[3]。
6.统计处理：所观察的微循环各项指标及视神经轴突数目、直径和占视神经面积的百分比均行两样本均数间的t检验。
结果
一、球结膜微循环观察
对照组在高眼压持续7～30 d中，球结膜微血管逐渐变细，多数微血管逐渐出现分枝断流、干涸，管周明显渗出、出血，管型边缘渐趋模糊，管内血流速度减慢，最后可见红细胞、血小板明显聚集及瘀血等重度微循环障碍表现(图1)。而川芎嗪治疗组，球结膜微血管明显增粗，分枝断流重新出现,管周渗出、出血减轻,管型边缘变清晰,血流速度加快,红细胞聚集、瘀血消失，血流通畅(图2)。两组各项指标经统计学处理，差异有显著性(P<0.01)(表1)。
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二、视神经轴突定量图像分析结果及光镜观察
对照组视神经明显肿胀，轴突数目逐渐减少，直径增大，轴突占视神经面积百分比降低。而川芎嗪治疗组，轴突数目明显增多，直径小(表2)。视神经轴突光镜下形态见图3～6。
三、视神经轴突透射电镜观察
高眼压持续过程中，对照组视神经轴突髓鞘排列紊乱，核周间隙增宽，核异染色质中有小泡，常染色质较少(图7，8)。而川芎嗪治疗组轴突髓鞘排列渐趋整齐，线粒体膜清晰，高尔基体、粗面内质网轻度肿胀，尚存正常结构(图9、10)。
讨论
一、青光眼视神经损害的发生机制
目前青光眼已成为主要的不可逆性致盲眼病之一。持续性高眼压在一定时间内是造成视神经损害的主要机制。Quigley等[4]研究发现，当眼压升高到一定程度，可干扰视神经轴突内正常细胞的生理功能，造成细胞内物质蓄积及轴突的肿胀变性。我们的研究结果显示，持续性高眼压可使兔眼球结膜微循环障碍、视神经轴突肿胀数目减少，并出现髓鞘排列紊乱，核周间隙增宽，核异染色质中有小泡，常染色质较少。从而推测持续性高眼压以及由此引起的微循环障碍通过损伤视神经轴突而最终导致视神经功能的损害[5]。
, 百拇医药
然而越来越多的证据表明[6-7]，眼压升高并不是导致青光眼视功能损害的惟一因素，尤其是治疗后，青光眼患者的眼压趋于正常，而视功能仍有进行性损害。近年来的研究发现，在原发性开角型青光眼发生、发展过程中，存在着血液流变学的改变，即血流缓慢、停滞或阻断。一旦眼压与视盘血供的平衡被打破，超过了视网膜血液循环自动调节能力，即可造成青光眼性视功能损害[8-11]。
二、川芎嗪对视神经轴突损伤的保护作用及其保护机制
川芎嗪的化学名为四甲基吡嗪，能够抑制血小板聚集，促进血小板解聚，降低血小板活性，具有良好的抗栓效应。对高粘血症、高凝血症、微循环障碍及体内血栓形成等具有较好的治疗作用[12-14] 。
本实验结果表明，川芎嗪可明显改善兔眼球结膜微循环，使血流再通，血小板解聚，并减少出血、渗出;使视神经轴突肿胀减轻，数目增多；并能减轻视神经轴突髓鞘、线粒体、高尔基体、粗面内质网等结构的损伤程度，使之恢复正常。
, 百拇医药
本实验均于兔眼压持续>50 mm Hg以上情况下进行，因此可排除眼压因素的干扰，根据我们的临床观察及本实验的检测结果[15]，我们推测川芎嗪可通过改善眼部微循环状况，使濒临变性、死亡的轴突得到最大限度的恢复，从而起到保护视神经的作用，阻止青光眼患者的视功能在眼压控制后继续受损。确切机制尚待更深入探讨。
(本文图1～10见插页第29页)
参考文献
1，陈青山，魏淳.青光眼Ⅱ号对兔实验性高眼压的影响.中国中医眼科杂志,1999,9:7-8.
2，田牛，主编.微循环方法学. 北京：原子能出版社，1987. 37-43.
3，徐亮，张士元,李平余,等.青光眼视盘图像分析系统. 中华眼科杂志,1992,28:89-93.
, 百拇医药
4，Quigley HA, Dunkelberger GR ,Green WR. Chronic human glaucoma causing selectivity greater loss of larger optic nerve fibers. Ophthalmology, 1988, 95:357-363.
5，傅培.青光眼视神经损害的研究进展. 国外医学眼科学分册,1994,18:155-162.
6，Foulds WS. “Blood is thicker than water”, some hemorheological aspects of ocular diseases.Eye,1987,1:343-363.
7，Sponsel WE, Depaul KL, Kaufma PL. Correlation of visual function and retinal leukocyte velocity in glaucoma.Am J Ophthalmology,1990,109:49-54.
, http://www.100md.com
8，Difntenfass L. Autoregulation of blood viscosity in health and disease. Vasc Surg, 1980,14:227-237.
9，吴云鹏, 梁子钧.生物流变学.北京 : 高等教育出版社,1968.163-165.
10，Maumenee AE. Cause of optic nerve damage in glaucoma. Ophthalmology, 1983, 90: 741-752.
11，徐岩,梁树今，李丽艳. 高眼压对猫视神经和筛板结构的影响. 中华眼科杂志, 1988, 24: 286-288.
12，周金黄,主编.中药药理学.上海:上海科学出版社,1985.190-192.
13，陈可冀,张之南,梁子钧,等主编.中西医结合研究丛书.上海:上海科学技术出版社, 1990. 509-523.
14，李公宝,郭宝强.四甲基吡嗪抗血小板活性及抗栓治疗.中国微循环杂志,1997,5:110-112.
15，李兴英,李公宝,杨连洲.原发性开角型青光眼微循环改变及临床意义.中国微循环杂志, 1998,2:168-170.
(收稿日期：1999-12-26), 百拇医药
单位：李兴英 杨连洲 康凤英 张士胜(山东省潍坊医学院附属医院眼科 261031)；李公宝(山东省潍坊医学院附属医院中心实验室)；韩月香(山东省潍坊医学院附属医院药剂室)
关键词：川芎嗪；视神经；轴突；眼内压；实验；动物
中华眼科杂志000610 【摘要】 目的 探讨川芎嗪对兔持续性高眼压视神经轴突损伤的保护作用。方法 对36只新西兰白兔眼前房注入α-糜蛋白酶，制作成持续性高眼压模型后，随机等分为高眼压对照组和川芎嗪治疗组，治疗组于高眼压持续7 d始肌注川芎嗪，观察不同时间两组动物球结膜微循环变化及视神经轴突光、电镜结构改变。结果 与高眼压对照组相比，川芎嗪组结膜微循环障碍明显减轻(P<0.01)，视神经轴突数目多、直径小，占视神经面积百分比高(P<0.01)，且肿胀的视神经轴突结构基本正常。结论 川芎嗪可通过改善微循环状况，对兔高眼压视神经轴突起保护作用。
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The protective effect of ligustrazine on optic nerve axons in rabbit eyes with continuous elevated IOP
LI Xingying, YANG Lianzhou, KANG Fengying, et al.
(Central laboratory, Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, Shandong 261031, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ligustrazine on optic nerve axons in rabbit eyes with continuous elevated intraocular pressure (IOP). Method Thirty-six NZ rabbits with continuous elevated IOP induced by injection of α-chymotrypsin into anterior chamber were divided into two groups by randomization: treatment and control group. Ten mg/kg ligustrazine injected into the treatment group every day for 3 weeks began on the 7th day after IOP elevated continuously. The changes of conjunctival microcirculation and optic nerve axonal ultrastructure were observed at different time points. Results The destruction of conjunctival microcirculation and axonal ultrastructure was milder in treatment group than that in the control group. In addition, the total number of axons and the percentage of axons in optic nerve area were higher, whereas the axonal diameter was smaller in the treatment group. Conclusion It is suggested that ligustrazine protect optic nerve axons from more damage induced by elevated IOP through improving ocular microcirculation.
, 百拇医药
【Key words】 Ligustrazine； Optic nerve； Axons； Intraocular pressure； Animal, laboratory
青光眼经手术治疗后，多数患者眼压能控制在正常水平，但部分患者视神经损害可继续发展。因此，除降低眼压外，如何保护视神经已成为青光眼防治的重要课题。以往的研究表明，血液流变学改变是原发性开角型青光眼的重要发病因素[1]。因此，从改善微循环角度探讨药物对视神经损害的保护作用，无疑将为青光眼的治疗提供新的途径。目前国内外尚未见报道有关高眼压损伤视神经的保护药物，为此，我们制作了兔持续性高眼压模型，研究了川芎嗪在不同时间对兔眼球结膜微循环的影响，并于光、电镜下观察视神经轴突的改变，以期为青光眼的治疗提供新手段。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药 1.动物：本院动物中心标准健康新西兰大白兔36只，体重2.0～3.0 kg，雌雄不限。
2.药物：无锡市第七制药厂生产的盐酸川芎嗪注射液。
二、方法
1.模型制作：将兔固定于实验架内，0.5%地卡因滴眼2或3次，开睑器开睑，由角膜缘透明区向前房内注入0.5 ml 1∶1 000 α-糜蛋白酶，30 min后测眼压，使眼压持续>50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，如眼压<50 mm Hg可补充注入0.2 ml。
2.动物分组:将36只大白兔随机等分为高眼压对照组和川芎嗪治疗组。治疗组于高眼压持续第7 d开始肌肉注射川芎嗪注射液10 mg/kg，每日2次，表1 两组各18只兔眼球结膜微循环指标积分值变化 组别
球结膜微循环指标积分值(
±s), 百拇医药
流速mm/s
微血管形态
血流状态
红细胞聚集
综合积分
高眼压组
204.84±74.21
1.53±0.87
4.31±1.85
2.4±1.2
8.24±3.93
川芎嗪组
, 百拇医药
480.15±86.34
0.38±0.29
1.56±0.73
1.2±0.4
3.24±1.42
t值
10.257
5.324
5.864
4.027
5.076
P值
, 百拇医药
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
表2 两组各18只兔眼视神经轴突定量图像分析结果 组别
视神经轴突定量指标(
±s)视神经轴突直径(μm)
视神经轴突数(根)
视神经轴突占视神经面积百分比(%)
, 百拇医药
对照组
1.279 0±0.099 7
151 166.223 3±25 026.333 0
34.781 2±6.601 6
川芎嗪组
1.053 3±0.029 9
210 133.313 3± 4 065.352 3
50.653 3±5.217 2
t值
9.212
9.267
, 百拇医药
8.004
P 值
<0.05
<0.05
<0.05
连用3周，对照组不做任何处理。
3.眼压测量:固定动物，0.5%地卡因滴眼，开睑，用Schiotz眼压计(苏州医疗器械厂生产)测量眼压，每日2或3次，如眼压<50 mm Hg，则用上述方法调整。
4.球结膜微循环检测:分别于高眼压持续7、10、20及30 d，将兔固定、麻醉、开睑，用WX-9A型微循环检测仪观测兔眼球结膜微血管形态、血流速度、血小板、红细胞聚集及管周状态等项指标。应用田牛加权积分法进行图像自动分析[2]。检测室温18～22℃。
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5.视神经标本制作及观察：将两组动物分别等分为3小组，于高眼压持续10、20、30 d，以气体栓塞法处死,摘取眼球,自球后1 mm范围内横切视神经取标本。各小组随机选择一只兔眼，用戌二醛固定，制作成电镜标本，经TEM-1200透射电镜观察视神经轴突超微结构改变。余各小组5只兔眼以中性甲醛固定，常规石蜡切片,HE染色,光镜观察视神经轴突情况,并行计算机图像分析[3]。
6.统计处理：所观察的微循环各项指标及视神经轴突数目、直径和占视神经面积的百分比均行两样本均数间的t检验。
结果
一、球结膜微循环观察
对照组在高眼压持续7～30 d中，球结膜微血管逐渐变细，多数微血管逐渐出现分枝断流、干涸，管周明显渗出、出血，管型边缘渐趋模糊，管内血流速度减慢，最后可见红细胞、血小板明显聚集及瘀血等重度微循环障碍表现(图1)。而川芎嗪治疗组，球结膜微血管明显增粗，分枝断流重新出现,管周渗出、出血减轻,管型边缘变清晰,血流速度加快,红细胞聚集、瘀血消失，血流通畅(图2)。两组各项指标经统计学处理，差异有显著性(P<0.01)(表1)。
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二、视神经轴突定量图像分析结果及光镜观察
对照组视神经明显肿胀，轴突数目逐渐减少，直径增大，轴突占视神经面积百分比降低。而川芎嗪治疗组，轴突数目明显增多，直径小(表2)。视神经轴突光镜下形态见图3～6。
三、视神经轴突透射电镜观察
高眼压持续过程中，对照组视神经轴突髓鞘排列紊乱，核周间隙增宽，核异染色质中有小泡，常染色质较少(图7，8)。而川芎嗪治疗组轴突髓鞘排列渐趋整齐，线粒体膜清晰，高尔基体、粗面内质网轻度肿胀，尚存正常结构(图9、10)。
讨论
一、青光眼视神经损害的发生机制
目前青光眼已成为主要的不可逆性致盲眼病之一。持续性高眼压在一定时间内是造成视神经损害的主要机制。Quigley等[4]研究发现，当眼压升高到一定程度，可干扰视神经轴突内正常细胞的生理功能，造成细胞内物质蓄积及轴突的肿胀变性。我们的研究结果显示，持续性高眼压可使兔眼球结膜微循环障碍、视神经轴突肿胀数目减少，并出现髓鞘排列紊乱，核周间隙增宽，核异染色质中有小泡，常染色质较少。从而推测持续性高眼压以及由此引起的微循环障碍通过损伤视神经轴突而最终导致视神经功能的损害[5]。
, 百拇医药
然而越来越多的证据表明[6-7]，眼压升高并不是导致青光眼视功能损害的惟一因素，尤其是治疗后，青光眼患者的眼压趋于正常，而视功能仍有进行性损害。近年来的研究发现，在原发性开角型青光眼发生、发展过程中，存在着血液流变学的改变，即血流缓慢、停滞或阻断。一旦眼压与视盘血供的平衡被打破，超过了视网膜血液循环自动调节能力，即可造成青光眼性视功能损害[8-11]。
二、川芎嗪对视神经轴突损伤的保护作用及其保护机制
川芎嗪的化学名为四甲基吡嗪，能够抑制血小板聚集，促进血小板解聚，降低血小板活性，具有良好的抗栓效应。对高粘血症、高凝血症、微循环障碍及体内血栓形成等具有较好的治疗作用[12-14] 。
本实验结果表明，川芎嗪可明显改善兔眼球结膜微循环，使血流再通，血小板解聚，并减少出血、渗出;使视神经轴突肿胀减轻，数目增多；并能减轻视神经轴突髓鞘、线粒体、高尔基体、粗面内质网等结构的损伤程度，使之恢复正常。
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本实验均于兔眼压持续>50 mm Hg以上情况下进行，因此可排除眼压因素的干扰，根据我们的临床观察及本实验的检测结果[15]，我们推测川芎嗪可通过改善眼部微循环状况，使濒临变性、死亡的轴突得到最大限度的恢复，从而起到保护视神经的作用，阻止青光眼患者的视功能在眼压控制后继续受损。确切机制尚待更深入探讨。
(本文图1～10见插页第29页)
参考文献
1，陈青山，魏淳.青光眼Ⅱ号对兔实验性高眼压的影响.中国中医眼科杂志,1999,9:7-8.
2，田牛，主编.微循环方法学. 北京：原子能出版社，1987. 37-43.
3，徐亮，张士元,李平余,等.青光眼视盘图像分析系统. 中华眼科杂志,1992,28:89-93.
, 百拇医药
4，Quigley HA, Dunkelberger GR ,Green WR. Chronic human glaucoma causing selectivity greater loss of larger optic nerve fibers. Ophthalmology, 1988, 95:357-363.
5，傅培.青光眼视神经损害的研究进展. 国外医学眼科学分册,1994,18:155-162.
6，Foulds WS. “Blood is thicker than water”, some hemorheological aspects of ocular diseases.Eye,1987,1:343-363.
7，Sponsel WE, Depaul KL, Kaufma PL. Correlation of visual function and retinal leukocyte velocity in glaucoma.Am J Ophthalmology,1990,109:49-54.
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9，吴云鹏, 梁子钧.生物流变学.北京 : 高等教育出版社,1968.163-165.
10，Maumenee AE. Cause of optic nerve damage in glaucoma. Ophthalmology, 1983, 90: 741-752.
11，徐岩,梁树今，李丽艳. 高眼压对猫视神经和筛板结构的影响. 中华眼科杂志, 1988, 24: 286-288.
12，周金黄,主编.中药药理学.上海:上海科学出版社,1985.190-192.
13，陈可冀,张之南,梁子钧,等主编.中西医结合研究丛书.上海:上海科学技术出版社, 1990. 509-523.
14，李公宝,郭宝强.四甲基吡嗪抗血小板活性及抗栓治疗.中国微循环杂志,1997,5:110-112.
15，李兴英,李公宝,杨连洲.原发性开角型青光眼微循环改变及临床意义.中国微循环杂志, 1998,2:168-170.
(收稿日期：1999-12-26), 百拇医药