神经元蛋白14-3-3β cDNA克隆及在原核细胞中的表达
作者：张福萍 董小平 赵 霞 赵同兴 洪 涛
单位：100052 北京, 中国预防医学科学院病毒学研究所
关键词：克-亚二氏综合征；蛋白质类；；DNA；互补；；原核细胞；克隆；分子
中华皮肤科杂志990412
伐昔洛韦(valaciclovir)是阿昔洛韦(aciclovir)的左旋缬氨酸酯，是阿昔洛韦的前体药物，经人体口服吸收后能够迅速且几乎完全转化为阿昔洛韦和人体必需氨基酸——缬氨酸，从而大大地提高了阿昔洛韦的生物利用度[1]，阿昔洛韦有确切的抗疱疹病毒活性，这已为临床和实验所证明[2]。为了评价盐酸伐昔洛韦的细胞毒性和体外抗单纯疱疹病毒(HSV)活性，我们用细胞培养法做了其细胞毒性试验和体外抗HSV药效试验，并与阿昔洛韦作了比较，现报道如下。
, 百拇医药
一、材料与方法
(一)材料：
细胞：Vero细胞，自中国科学院上海细胞生物所细胞库引进。
病毒株：HSV国际标准毒株HSV1Sam株，由南京医科大学病毒室引进；HSV2333株自卫生部生物制品药品检定所引进，由本所药研室惠赠。HSV临床分离株HSV1D1株、D2株，HSV2G1株、G2株均分离自本所门诊口唇单纯疱疹和生殖器疱疹患者。
药物：盐酸伐昔洛韦(分子量为360.8)与阿昔洛韦(分子量为225.2)，均由丽珠制药厂惠赠，用二甲基亚砜将盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦配制成浓度为10mg/mL的母液，-20℃保存备用。
(二)实验方法：参照文献[3，4]进行。
1.病毒毒力的测定：用细胞维持培养基(含2%小牛血清的RPMI1640培养基)将病毒原液作连续10倍稀释成5～7种稀释度的病毒培养液，接种于在96孔培养板上基本形成(75%融合)单层的Vero细胞中，每孔0.1mL，每稀释度3孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养1周，每日观察特征性细胞病变(CPE)：局灶性细胞变圆、气球样变，可有巨细胞及融合细胞出现。CPE记录方法[4]：0为无CPE，1+为1%～25%的细胞出现CPE，2+为26%～50%的细胞出现CPE，3+为51%～75%的细胞出现CPE，4+为76%～100%的细胞出现CPE。按Reed-Muench法[4]计算病毒的半数感染量(TCID50)。
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2.药物的细胞毒性试验：用维持培养基将药物母液作连续2倍稀释成10个稀释度的药液，加至在96孔板上基本形成单层的Vero细胞中，每孔0.1mL，每稀释度3孔。并设置未加药液细胞作正常对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养1周，每日观察CPE：即弥漫性细胞变圆、肿胀、溶解。CPE记录方法同前。按Reed-Muench法计算半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
3.体外抗HSV药效试验：用维持培养基将最大无毒浓度药液连续2倍稀释成10个稀释度的药液。待Vero细胞在96孔板上基本长成单层后，每孔均接种10TCID50/0.1mL的病毒液，37℃吸附1h后弃去上清液，再加入以上2倍稀释的药液，每孔0.1mL，每稀释度3孔。并设置未感染细胞、未加药液感染细胞作阴性和阳性对照。然后置37℃、5%CO2培养箱中培养1周，每日观察CPE。CPE记录方法同前。按Reed-Muench法计算半数有效浓度(IC50)。以上实验均重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。
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(三)统计学分析方法：采用t检验进行实验数据的分析和比较。
二、结果
(一)病毒毒力：HSV-1标准株Sam株、临床分离株D1株、D2株的半数感染量(TCID50)分别为2.6×10-5、1.2×10-5、1.2×10-5。HSV-2标准株333株、临床分离株G1株、G2株的TCID50分别为3.2×10-5、2.4×10-4、2.5×10-4。
(二)药物的细胞毒性：盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对Vero细胞的TC50分别为292.71μmol/L(105.61μg/mL)和319.92μmol/L(72.05μg/mL)，TC0分别为86.61μmol/L(31.25μg/mL)和69.38μmol/L(15.63μg/mL)。盐酸伐昔洛韦的TC50为其TC0的3.4倍，阿昔洛韦的TC50为其TC0的4.6倍。
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(三)药物的体外抗HSV活性：盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对HSV-1的平均IC50分别为(0.111±0.100)μmol/L和(0.147±0.107)μmol/L(t=0.914,P>0.05)，治疗指数分别为2640和2123；对HSV-2的平均IC50分别为(0.169±0.102)μmol/L和(0.253±0.138)μmol/L(t=1.244,P>0.05)，治疗指数分别为1731和1229，对各病毒株的IC50和治疗指数见表1。
表1 盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对6株HSV毒株的抗病毒活性
病毒株
IC50(μmol/L)
治疗指数
伐昔洛韦
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阿昔洛韦
伐昔洛韦
阿昔洛韦
HSV-1
Sam株
0.225
0.271
1304
1148
D1株
0.061
0.086
4800
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3687
D2株
0.044
0.087
6601
3503
HSV-2
333株
0.280
0.410
1046
761
G1株
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0.080
0.136
3642
2260
G2株
0.147
0.212
1993
1459
注：治疗指数=TC50/IC50
三、讨论
我们发现，盐酸伐昔洛韦对Vero细胞的TC0与TC50均较阿昔洛韦为大，这提示盐酸伐昔洛韦对Vero细胞的细胞毒性小于阿昔洛韦。对6株HSV病毒株的体外抗病毒药效试验发现，盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对HSV-1的IC50分别为0.044～0.225μmol/L(平均0.111μmol/L)和0.086～0.271μmol/L(平均0.147μmol/L)，对HSV-2的IC50分别为0.080～0.280μmol/L(平均为0.169μmol/L)和0.136～0.410μmol/L(平均为0.253μmol/L)，前者小于后者，但两者间均无统计学差异，这表明两者的抗HSV活性相当。由于伐昔洛 韦经人体口服吸收后在肝脏内迅速水解转化为阿昔洛韦，使后者的生物利用度较直接口服阿昔洛韦时提高3～5倍[5]，伐昔洛韦的口服给药次数较阿昔洛韦减少，口服剂量亦相对较小，但却能达到远高于阿昔洛韦体外抗HSV的IC50血药 浓度，其安全性亦为临床应 用所证实[1，5]。我们的体外试验结果表明，与阿昔洛韦相比较，盐酸伐昔洛韦的细胞毒性较小，而体外抗HSV活性相当。我们认为 盐酸伐昔洛韦是一种安全有效的抗单纯疱疹病毒药物，有良好的应用前景。
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参考文献
1 Perry CM, Faulds D. Valaciclovir: a review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in herpesvirus infection. Drugs, 1996，52: 754- 772.
2 Whitley R, Gnann JW. Acyclovir: a decade later. N Engl J Med, 1992,327: 782- 789.
3 郭茂福.抗病毒药物的筛选方法.见徐淑云，卞如濂，陈修，主编 .药理学实验方法.第2版.北京：人民卫生出版社，1991.1397-1416.
4 Cunningham CH. Quantal and enumerative titration of virus in cell cultures.In:Kruse PF, Patterson MK. Tissue culture: methods and applications. New York: Academic Press, 1973.527- 532.
5 Soul-Lawton J, Seaber E, On N, et al. Absolute bioavailability and metabolic disposition of valaciclovir, the L-valyl ester of acyclovir, following oral administration to humans. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39:2759- 2764.
收稿：1998-08-17修回：1998-11-19, 百拇医药
单位：100052 北京, 中国预防医学科学院病毒学研究所
关键词：克-亚二氏综合征；蛋白质类；；DNA；互补；；原核细胞；克隆；分子
中华皮肤科杂志990412
伐昔洛韦(valaciclovir)是阿昔洛韦(aciclovir)的左旋缬氨酸酯，是阿昔洛韦的前体药物，经人体口服吸收后能够迅速且几乎完全转化为阿昔洛韦和人体必需氨基酸——缬氨酸，从而大大地提高了阿昔洛韦的生物利用度[1]，阿昔洛韦有确切的抗疱疹病毒活性，这已为临床和实验所证明[2]。为了评价盐酸伐昔洛韦的细胞毒性和体外抗单纯疱疹病毒(HSV)活性，我们用细胞培养法做了其细胞毒性试验和体外抗HSV药效试验，并与阿昔洛韦作了比较，现报道如下。
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一、材料与方法
(一)材料：
细胞：Vero细胞，自中国科学院上海细胞生物所细胞库引进。
病毒株：HSV国际标准毒株HSV1Sam株，由南京医科大学病毒室引进；HSV2333株自卫生部生物制品药品检定所引进，由本所药研室惠赠。HSV临床分离株HSV1D1株、D2株，HSV2G1株、G2株均分离自本所门诊口唇单纯疱疹和生殖器疱疹患者。
药物：盐酸伐昔洛韦(分子量为360.8)与阿昔洛韦(分子量为225.2)，均由丽珠制药厂惠赠，用二甲基亚砜将盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦配制成浓度为10mg/mL的母液，-20℃保存备用。
(二)实验方法：参照文献[3，4]进行。
1.病毒毒力的测定：用细胞维持培养基(含2%小牛血清的RPMI1640培养基)将病毒原液作连续10倍稀释成5～7种稀释度的病毒培养液，接种于在96孔培养板上基本形成(75%融合)单层的Vero细胞中，每孔0.1mL，每稀释度3孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养1周，每日观察特征性细胞病变(CPE)：局灶性细胞变圆、气球样变，可有巨细胞及融合细胞出现。CPE记录方法[4]：0为无CPE，1+为1%～25%的细胞出现CPE，2+为26%～50%的细胞出现CPE，3+为51%～75%的细胞出现CPE，4+为76%～100%的细胞出现CPE。按Reed-Muench法[4]计算病毒的半数感染量(TCID50)。
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2.药物的细胞毒性试验：用维持培养基将药物母液作连续2倍稀释成10个稀释度的药液，加至在96孔板上基本形成单层的Vero细胞中，每孔0.1mL，每稀释度3孔。并设置未加药液细胞作正常对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养1周，每日观察CPE：即弥漫性细胞变圆、肿胀、溶解。CPE记录方法同前。按Reed-Muench法计算半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
3.体外抗HSV药效试验：用维持培养基将最大无毒浓度药液连续2倍稀释成10个稀释度的药液。待Vero细胞在96孔板上基本长成单层后，每孔均接种10TCID50/0.1mL的病毒液，37℃吸附1h后弃去上清液，再加入以上2倍稀释的药液，每孔0.1mL，每稀释度3孔。并设置未感染细胞、未加药液感染细胞作阴性和阳性对照。然后置37℃、5%CO2培养箱中培养1周，每日观察CPE。CPE记录方法同前。按Reed-Muench法计算半数有效浓度(IC50)。以上实验均重复3次，取3次实验的平均值作为实验结果。
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(三)统计学分析方法：采用t检验进行实验数据的分析和比较。
二、结果
(一)病毒毒力：HSV-1标准株Sam株、临床分离株D1株、D2株的半数感染量(TCID50)分别为2.6×10-5、1.2×10-5、1.2×10-5。HSV-2标准株333株、临床分离株G1株、G2株的TCID50分别为3.2×10-5、2.4×10-4、2.5×10-4。
(二)药物的细胞毒性：盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对Vero细胞的TC50分别为292.71μmol/L(105.61μg/mL)和319.92μmol/L(72.05μg/mL)，TC0分别为86.61μmol/L(31.25μg/mL)和69.38μmol/L(15.63μg/mL)。盐酸伐昔洛韦的TC50为其TC0的3.4倍，阿昔洛韦的TC50为其TC0的4.6倍。
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(三)药物的体外抗HSV活性：盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对HSV-1的平均IC50分别为(0.111±0.100)μmol/L和(0.147±0.107)μmol/L(t=0.914,P>0.05)，治疗指数分别为2640和2123；对HSV-2的平均IC50分别为(0.169±0.102)μmol/L和(0.253±0.138)μmol/L(t=1.244,P>0.05)，治疗指数分别为1731和1229，对各病毒株的IC50和治疗指数见表1。
表1 盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对6株HSV毒株的抗病毒活性
病毒株
IC50(μmol/L)
治疗指数
伐昔洛韦
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阿昔洛韦
伐昔洛韦
阿昔洛韦
HSV-1
Sam株
0.225
0.271
1304
1148
D1株
0.061
0.086
4800
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3687
D2株
0.044
0.087
6601
3503
HSV-2
333株
0.280
0.410
1046
761
G1株
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0.080
0.136
3642
2260
G2株
0.147
0.212
1993
1459
注：治疗指数=TC50/IC50
三、讨论
我们发现，盐酸伐昔洛韦对Vero细胞的TC0与TC50均较阿昔洛韦为大，这提示盐酸伐昔洛韦对Vero细胞的细胞毒性小于阿昔洛韦。对6株HSV病毒株的体外抗病毒药效试验发现，盐酸伐昔洛韦和阿昔洛韦对HSV-1的IC50分别为0.044～0.225μmol/L(平均0.111μmol/L)和0.086～0.271μmol/L(平均0.147μmol/L)，对HSV-2的IC50分别为0.080～0.280μmol/L(平均为0.169μmol/L)和0.136～0.410μmol/L(平均为0.253μmol/L)，前者小于后者，但两者间均无统计学差异，这表明两者的抗HSV活性相当。由于伐昔洛 韦经人体口服吸收后在肝脏内迅速水解转化为阿昔洛韦，使后者的生物利用度较直接口服阿昔洛韦时提高3～5倍[5]，伐昔洛韦的口服给药次数较阿昔洛韦减少，口服剂量亦相对较小，但却能达到远高于阿昔洛韦体外抗HSV的IC50血药 浓度，其安全性亦为临床应 用所证实[1，5]。我们的体外试验结果表明，与阿昔洛韦相比较，盐酸伐昔洛韦的细胞毒性较小，而体外抗HSV活性相当。我们认为 盐酸伐昔洛韦是一种安全有效的抗单纯疱疹病毒药物，有良好的应用前景。
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参考文献
1 Perry CM, Faulds D. Valaciclovir: a review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in herpesvirus infection. Drugs, 1996，52: 754- 772.
2 Whitley R, Gnann JW. Acyclovir: a decade later. N Engl J Med, 1992,327: 782- 789.
3 郭茂福.抗病毒药物的筛选方法.见徐淑云，卞如濂，陈修，主编 .药理学实验方法.第2版.北京：人民卫生出版社，1991.1397-1416.
4 Cunningham CH. Quantal and enumerative titration of virus in cell cultures.In:Kruse PF, Patterson MK. Tissue culture: methods and applications. New York: Academic Press, 1973.527- 532.
5 Soul-Lawton J, Seaber E, On N, et al. Absolute bioavailability and metabolic disposition of valaciclovir, the L-valyl ester of acyclovir, following oral administration to humans. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39:2759- 2764.
收稿：1998-08-17修回：1998-11-19, 百拇医药