用液相色谱-离子阱质谱联用法检测兔体液中阿普唑仑及其主要代谢产物
作者：郭继芬 孙璐 钟大放
单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室，沈阳 110015
关键词：阿普唑仑；液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用法；代谢物；生物样品
沈阳药科大学学报000517 摘 要 建立鉴别体液中阿普唑仑及其主要代谢物的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用(LC/MSn)法.采用LC/MSn联用技术，检测家兔灌胃给药后血样和尿样中阿普唑仑原形药及其羟基化代谢物、葡萄糖苷酸型结合物，得到了它们的色谱、质谱以及特征碎片离子信息.阿普唑仑的最低检测限小于1 ng.本法专属性强，可推广至其他生物检材的测定，尤其适用于需快速响应的临床和法医毒物分析.
分类号 R914.1
Identification of Alprazolam and Its Major Metabolites in Body Fluids by Liquid Chromatography-electrospray Ion Trap Mass Spectrometry
, http://www.100md.com
Guo Jifen, Sun Lu, Zhong Dafang
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract A method was described for the characterization of alprazolam and its major metabolites by liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry, involving α-hydroxyalprazolam, 4-hydroxyalprazolam and their glucuronide conjugates. After a single 40 mg/kg dose to a rabbit, blood and urine samples were extracted and then injected into an ODS column with a mobile phase of 70% methanol and 30% water for LC/MSn analysis. The structures of alprazolam in blood and urine were identified by direct comparison of the observed mass spectra and the chromatographic retention time with those of the reference substance. Its metabolites were deduced by the characteristic ions in the selected-ion monitoring as well as full scan MS2 mode. It was demonstrated that the method could be applied to the toxicological detection in forensic medicine due to its advantage of high specificity and sensitivity(the detection limit of alprazolam was below 1 ng).
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Key words alprazolam;LC/MSn;metabolites;biological samples
Fig.1 The stru-cture of alprazolam
阿普唑仑(alprazolam)是一含有三环结构的三氮唑苯二氮类药物(结构式见图1)，常用于镇静、催眠和抗焦虑〔1〕.该药剂量很低，在因服用过量而中毒、交通事故、麻醉抢劫案件中常涉及此药，故建立检测体液中阿普唑仑或其代谢物的分析方法实属必要. 文献报道〔2,3〕，阿普唑仑在体内经历广泛代谢，其中α-羟基阿普唑仑和4-羟基阿普唑仑是两个主要的活性代谢物，这些I相代谢物进一步在体内形成葡萄糖苷酸结合物.目前用于阿普唑仑及其代谢物测定的方法多为GC法〔4〕、HPLC法〔5，6〕和GC/MS法〔7〕.前两者不能给出相对分子质量信息，专属性差；GC/MS法需衍生化，操作较繁琐，不适于检测强极性的结合型代谢物.作者首次建立了同时检测体液中阿普唑仑及其代谢物的LC/MSn法，为快速检测该药提供了可靠的手段.
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1 材料与方法
1.1 仪器与试药
美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，配有ESI(电喷雾离子化)源及LCQ 1.2数据处理系统；日本岛津公司高效液相色谱仪(包括LC—10AD泵，Rheodyne 7125进样阀).
阿普唑仑片(0.4 mg/片，批号为970629)为华中医药集团驻马店地区制药厂生产；流动相所用有机溶剂为色谱纯；其余化学品均为市售分析纯.
1.2 实验动物
健康家兔1只，雄性，体重(2.5±0.5)kg，沈阳药科大学实验动物中心提供.
1.3 对照品溶液的配制
取5片阿普唑仑片，精密称重后研细，称取约2片重片粉置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声溶解10 min，过滤，取续滤液2.0 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度作为储备液，用流动相稀释为含一定浓度阿普唑仑的对照品溶液.
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1.4 生物样品的预处理
家兔按40 mg/kg灌胃给药，于24 h后处死，解剖取血样及尿样.血样用碳酸钠溶液(2 mol/L)调pH9左右，用氯仿提取，分取有机层，于30℃氮气下吹干；尿样约5 mL直接加热蒸干.于测定前将残留物用200 μL流动相溶解，用于LC/(+)ESI-MSn分析.
1.5 LC/MSn分析
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱(5 μm粒径，150 mm×4.6 mm I.D.，天津凯德公司)；流动相：甲醇-水(体积比，70∶30)；流速：0.4 mL/min；柱温：室温；进样量：20 μL.
质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)；正离子检测；源电压：4.25 kV；鞘气(N2)流速：60流量单位(a.u.)；辅助气(N2)流速：5 a.u.；毛细管温度：180℃；毛细管电压：6.50 V；管透镜补偿电压：36.00 V；相对碰撞能：25%.
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采用一级全扫描、选择离子监测(SIM)和二级全扫描质谱(Full Scan MS2)三种方式同时测定.
2 结果
阿普唑仑对照品溶液经LC/MSn检测，最低检测限在1 ng以下，所得一级全扫描色谱和质谱信息见图2，由于其结构中含有一个氯原子，在质谱图上可见特征的[M+2+H]+同位素峰(m/z 311)，且与[M+H]+峰(m/z 309)成对出现(丰度比约为3∶1)，为定性分析及碎片归属提供了极为有用的依据.选择轻同位素准分子离子m/z 309进行二级质谱分析，生成碎片离子m/z 281 [M+H-28]+和碎片m/z 274 [M+H-35]+(图3).前者为脱去一分子N2的相应碎片，其同位素丰度比接近3∶1，证明碎片中仍含有一个氯原子；后者质谱图中未出现含Cl的特征同位素峰，为脱去一个Cl原子的相应碎片.
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家兔灌胃给药后，血样和尿样提取物经LC/MSn检测，所得色谱图和选择离子监测(SIM)及选择离子二级全扫描质谱图(Full Scan MS2)，与阿普唑仑对照品检测结果比较，完全一致，证明检材中含有阿普唑仑原形药. 同时在一级谱上检测到准分子离子为m/z 325的两个色谱峰，分子质量比母体药物多16 u，且有较强的M+2同位素峰.选择离子m/z 325进行二级全扫描质谱分析，两色谱峰对应的化合物均生成脱去一分子N2[M+H-28]+(m/z 297)和脱去一个Cl原子[M+H-35]+(m/z 290)的碎片离子(图4)，该质谱断裂规律与母体药物一致，推测这两个色谱峰分别为阿普唑仑的α-羟基和4-羟基代谢物.
在给药后家兔尿样的一级质谱图上还可检测到准分子离子为m/z 501的两个色谱峰，色谱保留时间比羟基阿普唑仑短，相对分子质量比羟基阿普唑仑多176 u，推测为阿普唑仑两种羟基代谢物的葡萄糖苷酸结合物.对母离子m/z 501进行二级质谱分析，发现两色谱峰对应的化合物皆脱去176 u，生成碎片离子m/z 325(图5).碎片离子m/z 325对应葡萄糖苷酸结合物中羟基阿普唑仑部分；中性碎片176 u则对应于结合物中葡萄糖苷酸部分.
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Fig.2 SIM chromatogram and corresponding mass spectrum of alprazolam
Fig.3 Full scan MS2 chromatogram and corresponding mass spectrum of alprazolam (m/z 309→)
Fig.4 Full scan MS2 chromatogram and corresponding mass spectrum of hydroxyalprazolam(m/z 325→)
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Fig.5 Full scan MS2 chromatogram and corresponding mass spectrum of glucuronide conjugate of hydroxyalprazolam(m/z 501→)
3 讨论
作者采用LC/MSn方法，通过色谱保留时间和多级质谱信息，并与对照品比较来测定血样和尿样中阿普唑仑原形药，确保了定性结果的真实可靠.另外，尿样经LC/MSn分析，可直接检测I相代谢产物和Ⅱ相代谢产物，整个分析测试时间不超过15 min.
作者通过二级质谱分析，发现阿普唑仑与其羟基代谢物都有脱去一分子N2的碎片离子，该断裂特点与三唑仑和艾司唑仑〔8〕的二级质谱断裂情况一致；此外，含Cl原子的分子离子或碎片离子都有特征的一组同位素峰，可作为具有该类结构特征(1,4-苯二氮环的1，2位并入三氮唑环)化合物定性分析的重要依据.
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国家自然科学基金资助项目，No.39930180
参考文献
1，Dawson GW, Jue SG, Brogden RN. Alprazolam:a review of its pharmacodynamic properties and efficacy in the treatment of anxiety and depression.Drugs, 1984,27:132
2，Greenblatt DJ, Wright CE. Clinical pharmacokinetics of alprazolam. Clin Pharmacokinet, 1993,24:453
3，Banks WR, Yamakita H, Digenis GA. Metabolism and distribution of 1-[14C]alprazolam in rats. J Pharm Sci, 1992,81:797
, 百拇医药
4，Gaillard Y, Gay-Montchamp JP, Ollagnier M. Simultaneous screening and quantitation of alpidem, zolpidem, buspirone and benzodiazepines by dual-channel gas chromatography using electron-capture and nitrogen-phosphorus detection after solid-phase extraction. J Chromatogr, 1993,622:197
5，Jin L, Lau CE. Determination of alprazolam and its major metabolites in serum microsamples by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetics in rats. J Chromatogr B, 1994,654:77
, 百拇医药
6，Akerman KK, Jolkkonen J, Parviainen M, et al. Analysis of low-dose benzodiazepines by HPLC with automated solid-phase extraction. Clin Chem, 1996,42:1412
7，Drouet CC, Aubert C, Coassolo P, et al. Capillary gas chromatographic-mass spectrometric method for the identification and quantification of some benzodiazepines and their unconjugated metabolites in plasma. J Chromatogr, 1989,487:295
8，顾景凯,钟大放,姜浩,等.用电喷雾离子阱质谱法分析生物样品中艾司唑仑及其主要代谢物.药物分析杂志,1999,19:150
收稿日期:2000-04-05
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单位：沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室，沈阳 110015
关键词：阿普唑仑；液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用法；代谢物；生物样品
沈阳药科大学学报000517 摘 要 建立鉴别体液中阿普唑仑及其主要代谢物的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用(LC/MSn)法.采用LC/MSn联用技术，检测家兔灌胃给药后血样和尿样中阿普唑仑原形药及其羟基化代谢物、葡萄糖苷酸型结合物，得到了它们的色谱、质谱以及特征碎片离子信息.阿普唑仑的最低检测限小于1 ng.本法专属性强，可推广至其他生物检材的测定，尤其适用于需快速响应的临床和法医毒物分析.
分类号 R914.1
Identification of Alprazolam and Its Major Metabolites in Body Fluids by Liquid Chromatography-electrospray Ion Trap Mass Spectrometry
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Guo Jifen, Sun Lu, Zhong Dafang
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract A method was described for the characterization of alprazolam and its major metabolites by liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry, involving α-hydroxyalprazolam, 4-hydroxyalprazolam and their glucuronide conjugates. After a single 40 mg/kg dose to a rabbit, blood and urine samples were extracted and then injected into an ODS column with a mobile phase of 70% methanol and 30% water for LC/MSn analysis. The structures of alprazolam in blood and urine were identified by direct comparison of the observed mass spectra and the chromatographic retention time with those of the reference substance. Its metabolites were deduced by the characteristic ions in the selected-ion monitoring as well as full scan MS2 mode. It was demonstrated that the method could be applied to the toxicological detection in forensic medicine due to its advantage of high specificity and sensitivity(the detection limit of alprazolam was below 1 ng).
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Key words alprazolam;LC/MSn;metabolites;biological samples
Fig.1 The stru-cture of alprazolam
阿普唑仑(alprazolam)是一含有三环结构的三氮唑苯二氮类药物(结构式见图1)，常用于镇静、催眠和抗焦虑〔1〕.该药剂量很低，在因服用过量而中毒、交通事故、麻醉抢劫案件中常涉及此药，故建立检测体液中阿普唑仑或其代谢物的分析方法实属必要. 文献报道〔2,3〕，阿普唑仑在体内经历广泛代谢，其中α-羟基阿普唑仑和4-羟基阿普唑仑是两个主要的活性代谢物，这些I相代谢物进一步在体内形成葡萄糖苷酸结合物.目前用于阿普唑仑及其代谢物测定的方法多为GC法〔4〕、HPLC法〔5，6〕和GC/MS法〔7〕.前两者不能给出相对分子质量信息，专属性差；GC/MS法需衍生化，操作较繁琐，不适于检测强极性的结合型代谢物.作者首次建立了同时检测体液中阿普唑仑及其代谢物的LC/MSn法，为快速检测该药提供了可靠的手段.
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1 材料与方法
1.1 仪器与试药
美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，配有ESI(电喷雾离子化)源及LCQ 1.2数据处理系统；日本岛津公司高效液相色谱仪(包括LC—10AD泵，Rheodyne 7125进样阀).
阿普唑仑片(0.4 mg/片，批号为970629)为华中医药集团驻马店地区制药厂生产；流动相所用有机溶剂为色谱纯；其余化学品均为市售分析纯.
1.2 实验动物
健康家兔1只，雄性，体重(2.5±0.5)kg，沈阳药科大学实验动物中心提供.
1.3 对照品溶液的配制
取5片阿普唑仑片，精密称重后研细，称取约2片重片粉置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声溶解10 min，过滤，取续滤液2.0 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度作为储备液，用流动相稀释为含一定浓度阿普唑仑的对照品溶液.
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1.4 生物样品的预处理
家兔按40 mg/kg灌胃给药，于24 h后处死，解剖取血样及尿样.血样用碳酸钠溶液(2 mol/L)调pH9左右，用氯仿提取，分取有机层，于30℃氮气下吹干；尿样约5 mL直接加热蒸干.于测定前将残留物用200 μL流动相溶解，用于LC/(+)ESI-MSn分析.
1.5 LC/MSn分析
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱(5 μm粒径，150 mm×4.6 mm I.D.，天津凯德公司)；流动相：甲醇-水(体积比，70∶30)；流速：0.4 mL/min；柱温：室温；进样量：20 μL.
质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)；正离子检测；源电压：4.25 kV；鞘气(N2)流速：60流量单位(a.u.)；辅助气(N2)流速：5 a.u.；毛细管温度：180℃；毛细管电压：6.50 V；管透镜补偿电压：36.00 V；相对碰撞能：25%.
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采用一级全扫描、选择离子监测(SIM)和二级全扫描质谱(Full Scan MS2)三种方式同时测定.
2 结果
阿普唑仑对照品溶液经LC/MSn检测，最低检测限在1 ng以下，所得一级全扫描色谱和质谱信息见图2，由于其结构中含有一个氯原子，在质谱图上可见特征的[M+2+H]+同位素峰(m/z 311)，且与[M+H]+峰(m/z 309)成对出现(丰度比约为3∶1)，为定性分析及碎片归属提供了极为有用的依据.选择轻同位素准分子离子m/z 309进行二级质谱分析，生成碎片离子m/z 281 [M+H-28]+和碎片m/z 274 [M+H-35]+(图3).前者为脱去一分子N2的相应碎片，其同位素丰度比接近3∶1，证明碎片中仍含有一个氯原子；后者质谱图中未出现含Cl的特征同位素峰，为脱去一个Cl原子的相应碎片.
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家兔灌胃给药后，血样和尿样提取物经LC/MSn检测，所得色谱图和选择离子监测(SIM)及选择离子二级全扫描质谱图(Full Scan MS2)，与阿普唑仑对照品检测结果比较，完全一致，证明检材中含有阿普唑仑原形药. 同时在一级谱上检测到准分子离子为m/z 325的两个色谱峰，分子质量比母体药物多16 u，且有较强的M+2同位素峰.选择离子m/z 325进行二级全扫描质谱分析，两色谱峰对应的化合物均生成脱去一分子N2[M+H-28]+(m/z 297)和脱去一个Cl原子[M+H-35]+(m/z 290)的碎片离子(图4)，该质谱断裂规律与母体药物一致，推测这两个色谱峰分别为阿普唑仑的α-羟基和4-羟基代谢物.
在给药后家兔尿样的一级质谱图上还可检测到准分子离子为m/z 501的两个色谱峰，色谱保留时间比羟基阿普唑仑短，相对分子质量比羟基阿普唑仑多176 u，推测为阿普唑仑两种羟基代谢物的葡萄糖苷酸结合物.对母离子m/z 501进行二级质谱分析，发现两色谱峰对应的化合物皆脱去176 u，生成碎片离子m/z 325(图5).碎片离子m/z 325对应葡萄糖苷酸结合物中羟基阿普唑仑部分；中性碎片176 u则对应于结合物中葡萄糖苷酸部分.
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Fig.2 SIM chromatogram and corresponding mass spectrum of alprazolam
Fig.3 Full scan MS2 chromatogram and corresponding mass spectrum of alprazolam (m/z 309→)
Fig.4 Full scan MS2 chromatogram and corresponding mass spectrum of hydroxyalprazolam(m/z 325→)
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Fig.5 Full scan MS2 chromatogram and corresponding mass spectrum of glucuronide conjugate of hydroxyalprazolam(m/z 501→)
3 讨论
作者采用LC/MSn方法，通过色谱保留时间和多级质谱信息，并与对照品比较来测定血样和尿样中阿普唑仑原形药，确保了定性结果的真实可靠.另外，尿样经LC/MSn分析，可直接检测I相代谢产物和Ⅱ相代谢产物，整个分析测试时间不超过15 min.
作者通过二级质谱分析，发现阿普唑仑与其羟基代谢物都有脱去一分子N2的碎片离子，该断裂特点与三唑仑和艾司唑仑〔8〕的二级质谱断裂情况一致；此外，含Cl原子的分子离子或碎片离子都有特征的一组同位素峰，可作为具有该类结构特征(1,4-苯二氮环的1，2位并入三氮唑环)化合物定性分析的重要依据.
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国家自然科学基金资助项目，No.39930180
参考文献
1，Dawson GW, Jue SG, Brogden RN. Alprazolam:a review of its pharmacodynamic properties and efficacy in the treatment of anxiety and depression.Drugs, 1984,27:132
2，Greenblatt DJ, Wright CE. Clinical pharmacokinetics of alprazolam. Clin Pharmacokinet, 1993,24:453
3，Banks WR, Yamakita H, Digenis GA. Metabolism and distribution of 1-[14C]alprazolam in rats. J Pharm Sci, 1992,81:797
, 百拇医药
4，Gaillard Y, Gay-Montchamp JP, Ollagnier M. Simultaneous screening and quantitation of alpidem, zolpidem, buspirone and benzodiazepines by dual-channel gas chromatography using electron-capture and nitrogen-phosphorus detection after solid-phase extraction. J Chromatogr, 1993,622:197
5，Jin L, Lau CE. Determination of alprazolam and its major metabolites in serum microsamples by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetics in rats. J Chromatogr B, 1994,654:77
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6，Akerman KK, Jolkkonen J, Parviainen M, et al. Analysis of low-dose benzodiazepines by HPLC with automated solid-phase extraction. Clin Chem, 1996,42:1412
7，Drouet CC, Aubert C, Coassolo P, et al. Capillary gas chromatographic-mass spectrometric method for the identification and quantification of some benzodiazepines and their unconjugated metabolites in plasma. J Chromatogr, 1989,487:295
8，顾景凯,钟大放,姜浩,等.用电喷雾离子阱质谱法分析生物样品中艾司唑仑及其主要代谢物.药物分析杂志,1999,19:150
收稿日期:2000-04-05
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