60Co源致中度骨髓型急性放射病人的生殖能力远后效应的观察
作者：仲伟国 赵亚南 刘本俶 牟贤龙
单位：(200433 上海，第二军医大学附属长海医院皮肤科)
关键词：
60Co源致中度骨髓型急性放射病人的生殖能力远后效应的观察 辐射对生物的作用有两个明显的特点[1]：1.低吸收能量引起高生物效应：2.作用的短暂性和效应的长期性。电离辐射的远后效应通常指照射后6个月以上出现的效应[2]，可延续或在照射的数月、几年乃至几十年后才出现。当出现在受照射者本人身上时，称为躯体效应；如发生在受照者后代的效应，称为遗传效应。急性放射病是核事故中较常见的损伤。急性放射损伤对生殖系统有明显影响，主要是对生精细胞产生破坏作用，对睾丸间质细胞则损害不大[3]。本文通过对一例60Co源致中度骨髓型急性放射病人受照后8年的生殖能力进行研究，探讨急性放射病人生殖功能的恢复能力。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.研究对象
(1)研究组：“武”，男性，28岁，已婚。1990年6月25日，20岁时受60Co源全身急性均匀性辐射。60Co源的放射性活度为8.5×1014 Bq，射线性质为γ射线，受照时间为5.8 min，吸收剂量率为0.3～1.3 Gy/min，物理剂量估算为2.5 Gy；生物剂量估算：①外周血淋巴细胞染色体畸变分析结果为双+环率53%，提示剂量为2.5(2.1～2.9)Gy；②胞浆分裂阻滞微核法结果为微核率47.1%，提示剂量为2.8 Gy。伤情诊断为中度骨髓型急性放射病。受照后1年内精液常规检查未见精子，3.5年后查精子总数49.0×106/ml，活动率10%，5.5年后查精子总数143.0×106/ml，活动率25%，活动力差，形态大致正常。1998年7月结婚，妻子在婚后半年妊娠，现已妊娠5个月，孕期无先兆流产等异常情况，尚未发现胎儿发育畸形。
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(2)对照组：已婚有生育力男子，与研究组同时采集新鲜精液。
2.方法
(1)精液常规检查
(2)改良LSAB法(Labeled Streptoavidin biotin Method)检测精子顶体膜结构完整性[4，5]。
①精液处理及精子涂片和固定：手淫法采集新鲜精液置37℃水浴箱内液化30 min，1000 rpm离心5 min，取沉淀加入精子营养液[6]洗涤2次，并调整精子密度为120×106/ml，待用。用PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)制成精子悬液(密度60.0×106/ml)，取该悬液10 μl涂在玻片上自然干燥，用丙酮固定10 min。
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②精子顶体改良LSAB法染色处理：PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)冲洗已固定的涂片，加入1∶100稀释的生物素标记的豌豆凝集素(biotin-PSA，美国Vector公司)，置37 ℃湿盒60 min，PBS液冲洗，加入预先制备的1∶120稀释的链霉亲和素和生物化酶试剂(LSAB Kit，美国ZYMED公司)，置37℃湿盒60 min，PBS液冲洗，加入DAB/H2O2显色液20 min，PBS液冲洗，干燥后，中性树胶封固，1 000倍光学显微镜下观察精子顶体形态并计数。
③结果判断标准：活精子中，顶体完整者顶体区呈棕褐色，顶体后区无着色，顶体不完整者则顶体区无棕褐色着色。计数100个活精子中顶体完整着色的精子数。
(3)明胶底物膜法检测精子顶体蛋白酶活性[7，8]。
①明胶底物膜的制作：吸取3.5%明胶液(50℃)滴于玻片一端，制成一薄膜，室温干燥18 h，在0.05%戊二醛中固定2 min，巴比妥醋酸缓冲液(pH 7.4)冲洗2次，每次20 s，在蒸馏水中快速冲洗4次，室温干燥1 h以上。将玻片放入0.5%台盼蓝水溶液中染色1 min，室温干燥1 h以上，选涂膜、染色均匀者保存备用。
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②精液处理及实验步骤：手淫法采集新鲜精液放入37℃水浴箱内液化30 min，分两组，一组为原精液组，一组为去精浆精液组，用PBS缓冲液(0.10 mol/L，pH 7.4)洗涤2次，1000 rpm/min离心5 min，均调整精子密度为50×106/ml，分别取原精液和去精浆的精子悬液20 μl均匀涂于明胶膜上置湿盒内放入37℃孵育3 h，自然干燥，中性树胶封固。
③结果判断标准：光镜观察，凡精子头部周围出现白色亮区(晕区)者为阳性反应。计数100个精子，求出其阳性反应率，并测出50个阳性反应区的直径，计算出每组的平均值。
3.统计学方法
各组数据以均数±标准差表示，采用配对计量资料比较的方差齐性检验及t检验。
二、结果
, 百拇医药 1.精液常规检查：
体积3 ml，pH 7.2，液化时间<30 min，活动率73%，活动为Ⅲ级，精子数189×106/ml，畸形率10%～15%，圆细胞2～5/HP。
2.改良LSAB法检测精子顶体膜结构完整性
对照组和研究组精子顶体完整着色率(%)分别为86.1667±5.5287和81.3750±10.1691(P>0.05)。
3.明胶底物膜法检测精子顶体蛋白酶活性
(1)原精液组：
对照组和研究组顶体平均阳性反应率(%)分别为93.5000±0.7071和86.3333±2.8048(P<0.05)，晕区平均直径(微米)分别为25.4856±2.9224和19.4281±3.7306(P>0.05)。
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(2)去精浆精液组：
对照组和研究组顶体平均阳性反应率(%)分别为89.5000±0.7071和86.0000±3.6515(P>0.05)，晕区平均直径(微米)分别为25.1904±4.3930和19.5511±4.6413(P>0.05)。
三、讨论
性腺是人体对电离辐射较敏感的器官，男性全身或局部受一定剂量照射后，可出现精子数减少，活动度降低及畸形精子增加，从而影响生育能力，变化的程度与受照剂量有平行关系[2]。1.0 Gy以下精子数减少，生育力降低；2.0～3.0 Gy精子数缺乏，暂时不育约12～15个月；4.0～5.0 Gy暂时不育约18～24个月；5.0～6.0 Gy可能永久不育。该病人受照剂量为2.5 Gy，受照后1年内精液常规检查未见精子，3.5年后查精子总数49.0×106/ml，与有关文献相符。受照后8年精液检查结果显示：精子数量、质量均有明显改善，虽低于正常值但具有受精能力，该病人妻子已妊娠，也表明其生殖能力的恢复。
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改良LSAB法是根据精子顶体膜上存在α-D甘露糖基[4]的特点，以生物素标记的豌豆凝集素为探针与之结合，借鉴免疫组化中的LSAB法[5]原理，使链霉亲和素与标记豌豆凝集素的生物素相连，加入显色剂后，在精子顶体膜及赤道板上出现棕褐色反应。明胶底物膜法是根据精子顶体蛋白酶是一种类胰蛋白酶具有水解明胶的特性[7]而创立的方法，通过光学显微镜观察晕区的阳性反应率和晕区直径，前者反映了具有顶体蛋白酶活性的精子的百分率，后者则反映了单个精子顶体蛋白酶活性的强弱，本实验结果显示该病人的精子顶体膜完整性与正常人无显著差别，精子顶体蛋白酶活性基本与正常人无显著差别，表明在受精过程中起主要作用的顶体蛋白酶的活性无明显变化或者说已经完全恢复正常。至于原精液组中顶体平均阳性反应率有显著差别(P<0.05)可能是病人与对照组精浆内天然顶体蛋白酶抑制剂含量的不同所致，经PBS液洗去精浆后两者无差别(P>0.05)，因病例数少尚不能确定是个体差异所致还是辐射后所致。
遗传性损害是电离辐射引起的重要的远后效应，这是由于性腺受照射而引起的。精原细胞对电离辐射最为敏感，初级和次级精母细胞次之，再后为精细胞和精子。电离辐射在这些细胞或前体中引起突变，从而对胚胎或子代产生影响[9]。在完成以上检查后该病人结婚，目前妻子已妊娠5个月，尚无先兆流产及胚胎发育畸形等异常情况。由于该病人受照后8年才结婚，故无法确定其恢复生殖能力的准确时间，本研究说明其受照后8年具有正常的生殖能力。我科计划对此进行全面跟踪研究，以便探讨急性放射性损伤对子代远期遗传效应的影响。
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参考文献
[1]叶根耀，黄士敏，王桂林.电离辐射对人体的远后效应.中华放射医学与防护杂志.1997,17：441-445
[2]郭力生，葛忠良主编.核辐射事故的医学处理.北京：原子能出版社，1992，405-428.
[3]孙世则等编著.放射损伤临床.北京：原子能出版社，1983，387.
[4]Nicholas L Cross,Patrico Morales,James W,et al.Two simple methods for detecting acrosome-reacted human sperm.Gamet Rese.1986,15:213-226.
[5]倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术应用.北京：科学技术出版社，1993，120-136.
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[6]程治平主编.生殖医学实验技术.北京：人民卫生出版社，1993，92.
[7]Gaddum P,Blandan RJ.Protelytic reaction of mammalian spermatozoa on gelatin membranes.Science.1970,170:749-751.
[8]杨建华.一种新型高效的顶体蛋白酶抑制剂-KF-950.男性学杂志.1994，8：145-146.
[9]傅宝华，刘金荣，吕玉民，等.60Co全身照射诱发人精子染色体畸变的研究.中华放射医学与防护杂志.1995，15：10-13.
(收稿日期:1999-09-08), 百拇医药
单位：(200433 上海，第二军医大学附属长海医院皮肤科)
关键词：
60Co源致中度骨髓型急性放射病人的生殖能力远后效应的观察 辐射对生物的作用有两个明显的特点[1]：1.低吸收能量引起高生物效应：2.作用的短暂性和效应的长期性。电离辐射的远后效应通常指照射后6个月以上出现的效应[2]，可延续或在照射的数月、几年乃至几十年后才出现。当出现在受照射者本人身上时，称为躯体效应；如发生在受照者后代的效应，称为遗传效应。急性放射病是核事故中较常见的损伤。急性放射损伤对生殖系统有明显影响，主要是对生精细胞产生破坏作用，对睾丸间质细胞则损害不大[3]。本文通过对一例60Co源致中度骨髓型急性放射病人受照后8年的生殖能力进行研究，探讨急性放射病人生殖功能的恢复能力。
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一、材料与方法
1.研究对象
(1)研究组：“武”，男性，28岁，已婚。1990年6月25日，20岁时受60Co源全身急性均匀性辐射。60Co源的放射性活度为8.5×1014 Bq，射线性质为γ射线，受照时间为5.8 min，吸收剂量率为0.3～1.3 Gy/min，物理剂量估算为2.5 Gy；生物剂量估算：①外周血淋巴细胞染色体畸变分析结果为双+环率53%，提示剂量为2.5(2.1～2.9)Gy；②胞浆分裂阻滞微核法结果为微核率47.1%，提示剂量为2.8 Gy。伤情诊断为中度骨髓型急性放射病。受照后1年内精液常规检查未见精子，3.5年后查精子总数49.0×106/ml，活动率10%，5.5年后查精子总数143.0×106/ml，活动率25%，活动力差，形态大致正常。1998年7月结婚，妻子在婚后半年妊娠，现已妊娠5个月，孕期无先兆流产等异常情况，尚未发现胎儿发育畸形。
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(2)对照组：已婚有生育力男子，与研究组同时采集新鲜精液。
2.方法
(1)精液常规检查
(2)改良LSAB法(Labeled Streptoavidin biotin Method)检测精子顶体膜结构完整性[4，5]。
①精液处理及精子涂片和固定：手淫法采集新鲜精液置37℃水浴箱内液化30 min，1000 rpm离心5 min，取沉淀加入精子营养液[6]洗涤2次，并调整精子密度为120×106/ml，待用。用PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)制成精子悬液(密度60.0×106/ml)，取该悬液10 μl涂在玻片上自然干燥，用丙酮固定10 min。
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②精子顶体改良LSAB法染色处理：PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)冲洗已固定的涂片，加入1∶100稀释的生物素标记的豌豆凝集素(biotin-PSA，美国Vector公司)，置37 ℃湿盒60 min，PBS液冲洗，加入预先制备的1∶120稀释的链霉亲和素和生物化酶试剂(LSAB Kit，美国ZYMED公司)，置37℃湿盒60 min，PBS液冲洗，加入DAB/H2O2显色液20 min，PBS液冲洗，干燥后，中性树胶封固，1 000倍光学显微镜下观察精子顶体形态并计数。
③结果判断标准：活精子中，顶体完整者顶体区呈棕褐色，顶体后区无着色，顶体不完整者则顶体区无棕褐色着色。计数100个活精子中顶体完整着色的精子数。
(3)明胶底物膜法检测精子顶体蛋白酶活性[7，8]。
①明胶底物膜的制作：吸取3.5%明胶液(50℃)滴于玻片一端，制成一薄膜，室温干燥18 h，在0.05%戊二醛中固定2 min，巴比妥醋酸缓冲液(pH 7.4)冲洗2次，每次20 s，在蒸馏水中快速冲洗4次，室温干燥1 h以上。将玻片放入0.5%台盼蓝水溶液中染色1 min，室温干燥1 h以上，选涂膜、染色均匀者保存备用。
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②精液处理及实验步骤：手淫法采集新鲜精液放入37℃水浴箱内液化30 min，分两组，一组为原精液组，一组为去精浆精液组，用PBS缓冲液(0.10 mol/L，pH 7.4)洗涤2次，1000 rpm/min离心5 min，均调整精子密度为50×106/ml，分别取原精液和去精浆的精子悬液20 μl均匀涂于明胶膜上置湿盒内放入37℃孵育3 h，自然干燥，中性树胶封固。
③结果判断标准：光镜观察，凡精子头部周围出现白色亮区(晕区)者为阳性反应。计数100个精子，求出其阳性反应率，并测出50个阳性反应区的直径，计算出每组的平均值。
3.统计学方法
各组数据以均数±标准差表示，采用配对计量资料比较的方差齐性检验及t检验。
二、结果
, 百拇医药 1.精液常规检查：
体积3 ml，pH 7.2，液化时间<30 min，活动率73%，活动为Ⅲ级，精子数189×106/ml，畸形率10%～15%，圆细胞2～5/HP。
2.改良LSAB法检测精子顶体膜结构完整性
对照组和研究组精子顶体完整着色率(%)分别为86.1667±5.5287和81.3750±10.1691(P>0.05)。
3.明胶底物膜法检测精子顶体蛋白酶活性
(1)原精液组：
对照组和研究组顶体平均阳性反应率(%)分别为93.5000±0.7071和86.3333±2.8048(P<0.05)，晕区平均直径(微米)分别为25.4856±2.9224和19.4281±3.7306(P>0.05)。
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(2)去精浆精液组：
对照组和研究组顶体平均阳性反应率(%)分别为89.5000±0.7071和86.0000±3.6515(P>0.05)，晕区平均直径(微米)分别为25.1904±4.3930和19.5511±4.6413(P>0.05)。
三、讨论
性腺是人体对电离辐射较敏感的器官，男性全身或局部受一定剂量照射后，可出现精子数减少，活动度降低及畸形精子增加，从而影响生育能力，变化的程度与受照剂量有平行关系[2]。1.0 Gy以下精子数减少，生育力降低；2.0～3.0 Gy精子数缺乏，暂时不育约12～15个月；4.0～5.0 Gy暂时不育约18～24个月；5.0～6.0 Gy可能永久不育。该病人受照剂量为2.5 Gy，受照后1年内精液常规检查未见精子，3.5年后查精子总数49.0×106/ml，与有关文献相符。受照后8年精液检查结果显示：精子数量、质量均有明显改善，虽低于正常值但具有受精能力，该病人妻子已妊娠，也表明其生殖能力的恢复。
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改良LSAB法是根据精子顶体膜上存在α-D甘露糖基[4]的特点，以生物素标记的豌豆凝集素为探针与之结合，借鉴免疫组化中的LSAB法[5]原理，使链霉亲和素与标记豌豆凝集素的生物素相连，加入显色剂后，在精子顶体膜及赤道板上出现棕褐色反应。明胶底物膜法是根据精子顶体蛋白酶是一种类胰蛋白酶具有水解明胶的特性[7]而创立的方法，通过光学显微镜观察晕区的阳性反应率和晕区直径，前者反映了具有顶体蛋白酶活性的精子的百分率，后者则反映了单个精子顶体蛋白酶活性的强弱，本实验结果显示该病人的精子顶体膜完整性与正常人无显著差别，精子顶体蛋白酶活性基本与正常人无显著差别，表明在受精过程中起主要作用的顶体蛋白酶的活性无明显变化或者说已经完全恢复正常。至于原精液组中顶体平均阳性反应率有显著差别(P<0.05)可能是病人与对照组精浆内天然顶体蛋白酶抑制剂含量的不同所致，经PBS液洗去精浆后两者无差别(P>0.05)，因病例数少尚不能确定是个体差异所致还是辐射后所致。
遗传性损害是电离辐射引起的重要的远后效应，这是由于性腺受照射而引起的。精原细胞对电离辐射最为敏感，初级和次级精母细胞次之，再后为精细胞和精子。电离辐射在这些细胞或前体中引起突变，从而对胚胎或子代产生影响[9]。在完成以上检查后该病人结婚，目前妻子已妊娠5个月，尚无先兆流产及胚胎发育畸形等异常情况。由于该病人受照后8年才结婚，故无法确定其恢复生殖能力的准确时间，本研究说明其受照后8年具有正常的生殖能力。我科计划对此进行全面跟踪研究，以便探讨急性放射性损伤对子代远期遗传效应的影响。
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参考文献
[1]叶根耀，黄士敏，王桂林.电离辐射对人体的远后效应.中华放射医学与防护杂志.1997,17：441-445
[2]郭力生，葛忠良主编.核辐射事故的医学处理.北京：原子能出版社，1992，405-428.
[3]孙世则等编著.放射损伤临床.北京：原子能出版社，1983，387.
[4]Nicholas L Cross,Patrico Morales,James W,et al.Two simple methods for detecting acrosome-reacted human sperm.Gamet Rese.1986,15:213-226.
[5]倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术应用.北京：科学技术出版社，1993，120-136.
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[6]程治平主编.生殖医学实验技术.北京：人民卫生出版社，1993，92.
[7]Gaddum P,Blandan RJ.Protelytic reaction of mammalian spermatozoa on gelatin membranes.Science.1970,170:749-751.
[8]杨建华.一种新型高效的顶体蛋白酶抑制剂-KF-950.男性学杂志.1994，8：145-146.
[9]傅宝华，刘金荣，吕玉民，等.60Co全身照射诱发人精子染色体畸变的研究.中华放射医学与防护杂志.1995，15：10-13.
(收稿日期:1999-09-08), 百拇医药