小鼠2-5A合成酶cDNA克隆及全序列测定
作者：彭日荷 姚泉洪 黄晓敏 范惠琴 张大兵 蒋琳
单位：上海市农业科学院植物保护研究所，上海市遗传育种重点实验室，上海 201106)
关键词：小鼠；2-5A合成酶基因；克隆；序列测定
中国病毒学000112 摘 要：通过饲喂放线菌酮，提取小鼠肝脏的总RNA，反转录合成cDNA第一链，利用RT-PCR扩增出1100bp大小的片段，将其克隆入载体pBluescript，采取双链质粒直接测序，获得的序列与国外报道小鼠2-5A合成酶基因序列具99.8%的同源性。氨基酸序列分析表明，小鼠2-5A合成酶与人2-5A合成酶具68%同源性，并在其C端发现亲水基团和糖基化位点。
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0073-05
, 百拇医药
Molecular Cloning and Sequencing of
Murine 2-5A Synthetase cDNA
PENG Ri-he, YAO Quan-hong, HUANG Xiao-min,FAN Hui-qing, ZHANG Da-bing, JIANG Lin
(Institute of Plant Protection in Shanghai Academy of Agricu ltural Science, Shanghai Key Laboratory of Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China)
Abstract：The 2-5 oligoadenylate system provides a universal response in mammals. 2-5A synthetase polymerizes ATP to a series of 2-5 oligoadenylate (2-5A). 2-5A activates a latent endoribonuclease (RNase L) which degrades viral RNA. In this paper the result of cloning and sequencing of the murine 2-5 oligoadenylate gene was reported. There are three different points between the nu cleotide sequence of the cloned murine 2-5 oligoadenylate gene.The amino acid homology of murine 2-5A synthetase with human 2-5A synthetase was 68%. The C- terminal portion of murine 2-5 A synthetase containes a hydrophilic region and a possible glycosylationsite.
, 百拇医药
Key words：Murine; 2-5A synthetase; Cloning; Sequence analysis▲
在哺乳动物体内，干扰素具有广泛的生物功能，它能抗癌，抗病毒，对细胞分裂、分化、细 胞膜的透性以及免疫系统都有影响[1]。当细胞受到病毒侵染后，诱导产生干扰素 ，干扰素刺激细胞诱生多种抑制mRNA翻译的酶类，其中2-5A合成酶和RNAase L 与干扰素的 关 系最为密切[2]。2-5A合成酶只有在dsRNA存在下才具有活性，它催化由ATP合成2 ′-5′寡聚腺苷酸(2-5A)，2-5A再激活细胞内的RNAase L，从而降解病毒和细胞内的RNA s[3，4]。
我们根据小鼠2-5A合成酶基因序列设计引物[5]，利用RT-PCR方法，从小鼠的肝 脏中扩增并克隆该基因，采用双链DNA荧光法测定了其序列。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌种
宿主菌DH5α、质粒pBluescript为本室所保存。
1.2 化学试剂和酶类
反转录酶、限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶、质粒纯化柱为Promega公司产品，DNA 聚合酶Tag PlusⅡ购自加拿大Sangon公司，DNA序列测定试剂盒为美国ABI公司产品，其它主 要化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂。PCR引物由中国科学院上海植物生理所合成。
1.3 总RNA的提取
昆明种10周龄雌性小鼠，体重为25～30g，每只饲喂80μg/mL的放线菌酮约50μL，同 时在皮下注射人α干扰素(IFNα2b)1000 IU，2h后，取肝脏放置研钵中边加液氮边研细， 直至粉末状，总RNA的提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法[6]。
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1.4 基因PCR扩增
以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，参照Promega公司cDNA合成产品说明。在AMV反转录酶作 用下合成cDNA第一链后，以此为模板进行PCR扩增，两端引物分别为：
5′端： AAAGGATCCAACAATGGCGCACGGACTCAGGAG
3′端： AAAGAGCTCTTACAGCAGGATACATGTCC
扩增条件为94℃变性40s，57℃退火90s，72℃延伸120s，共进行30个循环。
1.5 DNA序列分析
采取双链质粒直接测序方法，双脱氧核苷酸终止法测定序列。用ABI PRISM Dye Terminator DNA测序试剂盒，用Promega质粒纯化柱提纯质粒，在ABI 373型DNA自动化荧光测序仪上进 行双链DNA序列测定。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR产物鉴定及克隆
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检查，扩增片段大小约为1100bp(图1)，剩余产物经酚∶ 氯 仿(1∶1)提抽，乙醇沉淀回收后，Klenow酶补平，pBluescript载体EcoR V酶切，两片段连 接，转化DH5α，获带2-5A合成酶基因的克隆(图2)。
图1 RT-PCR扩增2-5A合成酶 基因电泳鉴定
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 2-5A
synthetase amplified by RT-PCR
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L: Murine liver tissue M: λ DNA EcoRI/HindⅢ
图2 重组质粒的 酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
digested by restriction enonuclease
L: recombinant plasmid M: λ DNA EcoRI/HindⅢ
2.2 2-5A合成酶cDNA序列
结果见图3，共测出小鼠2-5A合成酶基因1100bp。结果显示，基因编码区序列与国外报 导的序列存在三处差异(11：A→C； 227：G→A；1068：T→C)。同源性达99.8%。另外在A TG前面引入植物最佳翻译序列AACA。
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图3 小鼠2-5A合成酶基因核苷酸 序列
Fig.3 The nucleotide sequence of the murine 2-5A synthetase
2.3 小鼠2-5A合成酶一级结构分析
图4为小鼠2-5A合成酶(P25A)和人2-5A合成酶(E16)[7](PHU25A)一级结构分析。 比较发现，它们的氨基酸序列同源性为68%，其中N端都含有三个保守区域(13～25； 58～83 ； 199～225)，N端与2′-5′ADP、NTP和dsRNA结合有关，但是两种2-5A合成酶的C端的差 异很大，人2-5A合成酶(E16)C端(346～363)为疏水区域，而小鼠2-5A合成酶C端含有一个 亲 水区域(Glu-Gln-Val-Glu-Glu) (356～361)，此外小鼠2-5A合成酶C还有一个糖基化 位点 (Asn-Trp-Thr) (362～364)，可能与该酶在体内的半衰期有关。
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图4 小鼠2-5A合成酶(P25A)和人2 -5A合成酶(PHU25A)氨基酸序列比较
Fig.4 The differences of amino acids between murine 2-5A synthetase (P25A) and human 2-5A synthetase (PHU25A)
3 讨论
干扰素诱导哺乳动物对病毒的抗性，其机制尚未完全阐明。但是已经验证2-5A合成酶系统 在调节细胞内RNA代谢以及抵抗外源病毒侵染方面起着关键作用。2-5A合成酶系统是一个诱 导系统，只有在双链RNA存在的情况下，该系统才有功能。
尽管植物体内是否存在2-5A合成酶系统还不能肯定，然而Truve用小鼠2-5A合成酶基 因转 化马铃薯，转化植株获得了对TMV、PVX等多种病毒的免疫抗性[8]。植物病毒多为 单股正链RNA病毒，在其复制过程中都要经过双链RNA阶段，因而利用2-5A合成酶系统转化 植物可望获得广谱抗病毒植株。和其它植物抗病毒基因工程策略不同，2-5A合成酶系统不 是来源于植物或病毒本身，抗病毒植物不容易退化，另外非常低水平的病毒复制就可以诱导 植物细胞死亡，从而不利于病毒的传播[9]。我们将2-5A合成酶基因5′端突变， 加上植物最佳翻译序列AACA，并构建了该基因的植物表达系统，进一步的转化工作正在进行 ，希望最终能用于多种蔬菜和花卉的抗病毒品种的选育。■
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基金项目：上海市科委资助项目，编号96JG05075
作者简介：彭日荷(1969-)，男，汉族，江西省泰和县，副研究员，硕士学位。主要从事植物基因克隆及表达调控研究。
参考文献：
[1]刘新垣.干扰素的功能表达机制[J].国外医学分子生物学分册，1981，6，251～261
[2]Zhou A, Hassel AB, Silverman HR et al. Expression cloning of 2-5A-d ependent RNAase: a uniquely regulated mediator of interferon action [J]. Cell, 1993,72:753～765
[3]Lengyel P. Biochemstry of interferons and their action [J]. Annu Rev Bi ochem, 1982,51:251～282
, 百拇医药
[4]Mordechai E, Kon N, Hederson EE et al. Activation of the interferon- inducible enzymes, 2′, 5′-oligoadenylate synthetase and PKR by human T-cell leukemia virus type I rex-response element [J]. Virology, 1995,206:913～922
[5]Eliana MC, Romeo G, Nissim A et al. A full-length murine 2-5A synth etase cDNA transfected in NIH-3T3 cells impairs EMCV but not VSV replication [J]. Virology, 1990,179:228～233
[6]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid gua nidihium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987,16 2:156～159
, 百拇医药
[7]Benech P, Mory Y, Revel M, Chebath J et al. Structure of two forms of the interferon-induced (2′-5′) oligo A synthetase of human cells based onc DNAs and gene sequences [J]. The EMBO Journal, 1985,4(9):2249～2256
[8]Truve E, Aaspollu A, Honkanen J et al. Transgenic potato plants expre ssing mammalian 2-5A oligoadenylate synthetase are protected from potato virus X infection under field coditions. Bio/Technology, 1993,11:1048～1058
[9]Toshiya Ogawa, Tamaki Hori, Isao Ishida et al. Virus-induced cell death in plants expressing the mammalian 2′,5′ oligoadenylate system[J]. Nat Biotechnology, 1997,14(11):1586～1590
收稿日期：1998-09-28
修稿日期：1999-02-05, 百拇医药
单位：上海市农业科学院植物保护研究所，上海市遗传育种重点实验室，上海 201106)
关键词：小鼠；2-5A合成酶基因；克隆；序列测定
中国病毒学000112 摘 要：通过饲喂放线菌酮，提取小鼠肝脏的总RNA，反转录合成cDNA第一链，利用RT-PCR扩增出1100bp大小的片段，将其克隆入载体pBluescript，采取双链质粒直接测序，获得的序列与国外报道小鼠2-5A合成酶基因序列具99.8%的同源性。氨基酸序列分析表明，小鼠2-5A合成酶与人2-5A合成酶具68%同源性，并在其C端发现亲水基团和糖基化位点。
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0073-05
, 百拇医药
Molecular Cloning and Sequencing of
Murine 2-5A Synthetase cDNA
PENG Ri-he, YAO Quan-hong, HUANG Xiao-min,FAN Hui-qing, ZHANG Da-bing, JIANG Lin
(Institute of Plant Protection in Shanghai Academy of Agricu ltural Science, Shanghai Key Laboratory of Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China)
Abstract：The 2-5 oligoadenylate system provides a universal response in mammals. 2-5A synthetase polymerizes ATP to a series of 2-5 oligoadenylate (2-5A). 2-5A activates a latent endoribonuclease (RNase L) which degrades viral RNA. In this paper the result of cloning and sequencing of the murine 2-5 oligoadenylate gene was reported. There are three different points between the nu cleotide sequence of the cloned murine 2-5 oligoadenylate gene.The amino acid homology of murine 2-5A synthetase with human 2-5A synthetase was 68%. The C- terminal portion of murine 2-5 A synthetase containes a hydrophilic region and a possible glycosylationsite.
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Key words：Murine; 2-5A synthetase; Cloning; Sequence analysis▲
在哺乳动物体内，干扰素具有广泛的生物功能，它能抗癌，抗病毒，对细胞分裂、分化、细 胞膜的透性以及免疫系统都有影响[1]。当细胞受到病毒侵染后，诱导产生干扰素 ，干扰素刺激细胞诱生多种抑制mRNA翻译的酶类，其中2-5A合成酶和RNAase L 与干扰素的 关 系最为密切[2]。2-5A合成酶只有在dsRNA存在下才具有活性，它催化由ATP合成2 ′-5′寡聚腺苷酸(2-5A)，2-5A再激活细胞内的RNAase L，从而降解病毒和细胞内的RNA s[3，4]。
我们根据小鼠2-5A合成酶基因序列设计引物[5]，利用RT-PCR方法，从小鼠的肝 脏中扩增并克隆该基因，采用双链DNA荧光法测定了其序列。
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1 材料和方法
1.1 质粒、菌种
宿主菌DH5α、质粒pBluescript为本室所保存。
1.2 化学试剂和酶类
反转录酶、限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶、质粒纯化柱为Promega公司产品，DNA 聚合酶Tag PlusⅡ购自加拿大Sangon公司，DNA序列测定试剂盒为美国ABI公司产品，其它主 要化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂。PCR引物由中国科学院上海植物生理所合成。
1.3 总RNA的提取
昆明种10周龄雌性小鼠，体重为25～30g，每只饲喂80μg/mL的放线菌酮约50μL，同 时在皮下注射人α干扰素(IFNα2b)1000 IU，2h后，取肝脏放置研钵中边加液氮边研细， 直至粉末状，总RNA的提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法[6]。
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1.4 基因PCR扩增
以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，参照Promega公司cDNA合成产品说明。在AMV反转录酶作 用下合成cDNA第一链后，以此为模板进行PCR扩增，两端引物分别为：
5′端： AAAGGATCCAACAATGGCGCACGGACTCAGGAG
3′端： AAAGAGCTCTTACAGCAGGATACATGTCC
扩增条件为94℃变性40s，57℃退火90s，72℃延伸120s，共进行30个循环。
1.5 DNA序列分析
采取双链质粒直接测序方法，双脱氧核苷酸终止法测定序列。用ABI PRISM Dye Terminator DNA测序试剂盒，用Promega质粒纯化柱提纯质粒，在ABI 373型DNA自动化荧光测序仪上进 行双链DNA序列测定。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR产物鉴定及克隆
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检查，扩增片段大小约为1100bp(图1)，剩余产物经酚∶ 氯 仿(1∶1)提抽，乙醇沉淀回收后，Klenow酶补平，pBluescript载体EcoR V酶切，两片段连 接，转化DH5α，获带2-5A合成酶基因的克隆(图2)。
图1 RT-PCR扩增2-5A合成酶 基因电泳鉴定
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 2-5A
synthetase amplified by RT-PCR
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L: Murine liver tissue M: λ DNA EcoRI/HindⅢ
图2 重组质粒的 酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
digested by restriction enonuclease
L: recombinant plasmid M: λ DNA EcoRI/HindⅢ
2.2 2-5A合成酶cDNA序列
结果见图3，共测出小鼠2-5A合成酶基因1100bp。结果显示，基因编码区序列与国外报 导的序列存在三处差异(11：A→C； 227：G→A；1068：T→C)。同源性达99.8%。另外在A TG前面引入植物最佳翻译序列AACA。
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图3 小鼠2-5A合成酶基因核苷酸 序列
Fig.3 The nucleotide sequence of the murine 2-5A synthetase
2.3 小鼠2-5A合成酶一级结构分析
图4为小鼠2-5A合成酶(P25A)和人2-5A合成酶(E16)[7](PHU25A)一级结构分析。 比较发现，它们的氨基酸序列同源性为68%，其中N端都含有三个保守区域(13～25； 58～83 ； 199～225)，N端与2′-5′ADP、NTP和dsRNA结合有关，但是两种2-5A合成酶的C端的差 异很大，人2-5A合成酶(E16)C端(346～363)为疏水区域，而小鼠2-5A合成酶C端含有一个 亲 水区域(Glu-Gln-Val-Glu-Glu) (356～361)，此外小鼠2-5A合成酶C还有一个糖基化 位点 (Asn-Trp-Thr) (362～364)，可能与该酶在体内的半衰期有关。
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图4 小鼠2-5A合成酶(P25A)和人2 -5A合成酶(PHU25A)氨基酸序列比较
Fig.4 The differences of amino acids between murine 2-5A synthetase (P25A) and human 2-5A synthetase (PHU25A)
3 讨论
干扰素诱导哺乳动物对病毒的抗性，其机制尚未完全阐明。但是已经验证2-5A合成酶系统 在调节细胞内RNA代谢以及抵抗外源病毒侵染方面起着关键作用。2-5A合成酶系统是一个诱 导系统，只有在双链RNA存在的情况下，该系统才有功能。
尽管植物体内是否存在2-5A合成酶系统还不能肯定，然而Truve用小鼠2-5A合成酶基 因转 化马铃薯，转化植株获得了对TMV、PVX等多种病毒的免疫抗性[8]。植物病毒多为 单股正链RNA病毒，在其复制过程中都要经过双链RNA阶段，因而利用2-5A合成酶系统转化 植物可望获得广谱抗病毒植株。和其它植物抗病毒基因工程策略不同，2-5A合成酶系统不 是来源于植物或病毒本身，抗病毒植物不容易退化，另外非常低水平的病毒复制就可以诱导 植物细胞死亡，从而不利于病毒的传播[9]。我们将2-5A合成酶基因5′端突变， 加上植物最佳翻译序列AACA，并构建了该基因的植物表达系统，进一步的转化工作正在进行 ，希望最终能用于多种蔬菜和花卉的抗病毒品种的选育。■
, http://www.100md.com
基金项目：上海市科委资助项目，编号96JG05075
作者简介：彭日荷(1969-)，男，汉族，江西省泰和县，副研究员，硕士学位。主要从事植物基因克隆及表达调控研究。
参考文献：
[1]刘新垣.干扰素的功能表达机制[J].国外医学分子生物学分册，1981，6，251～261
[2]Zhou A, Hassel AB, Silverman HR et al. Expression cloning of 2-5A-d ependent RNAase: a uniquely regulated mediator of interferon action [J]. Cell, 1993,72:753～765
[3]Lengyel P. Biochemstry of interferons and their action [J]. Annu Rev Bi ochem, 1982,51:251～282
, 百拇医药
[4]Mordechai E, Kon N, Hederson EE et al. Activation of the interferon- inducible enzymes, 2′, 5′-oligoadenylate synthetase and PKR by human T-cell leukemia virus type I rex-response element [J]. Virology, 1995,206:913～922
[5]Eliana MC, Romeo G, Nissim A et al. A full-length murine 2-5A synth etase cDNA transfected in NIH-3T3 cells impairs EMCV but not VSV replication [J]. Virology, 1990,179:228～233
[6]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid gua nidihium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987,16 2:156～159
, 百拇医药
[7]Benech P, Mory Y, Revel M, Chebath J et al. Structure of two forms of the interferon-induced (2′-5′) oligo A synthetase of human cells based onc DNAs and gene sequences [J]. The EMBO Journal, 1985,4(9):2249～2256
[8]Truve E, Aaspollu A, Honkanen J et al. Transgenic potato plants expre ssing mammalian 2-5A oligoadenylate synthetase are protected from potato virus X infection under field coditions. Bio/Technology, 1993,11:1048～1058
[9]Toshiya Ogawa, Tamaki Hori, Isao Ishida et al. Virus-induced cell death in plants expressing the mammalian 2′,5′ oligoadenylate system[J]. Nat Biotechnology, 1997,14(11):1586～1590
收稿日期：1998-09-28
修稿日期：1999-02-05, 百拇医药