噬菌体呈现技术在人抗体库中的研究策略
作者：王希良 黄云辉{k, http://www.100md.com
单位：王希良(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；黄云辉(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；朱锡华(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038){k, http://www.100md.com
关键词：噬菌体抗体库；基因突变；转基因{k, http://www.100md.com
免疫学杂志000420 朱锡华 审校{k, http://www.100md.com
[摘 要] 噬菌体呈现抗体库技术被誉为抗体技术的第三次革命，发展构建库容量大、特异性高和敏感强的人源性抗体库是噬菌体呈现技术的关键。本文就如何提高转化效益、实验策略及抗体应用的研究等方面作一综述。{k, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.11-33 [文献标识码] A{k, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)04-0309-04{k, http://www.100md.com
Strategies for selection of human antibodies by phage display{k, http://www.100md.com
WANG Xi-liang， HUANG Yun-hui{k, http://www.100md.com
(Department of Immunology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China){k, http://www.100md.com
[Abstract] Antibody phage display technology has been described as the third revolution in antibody technology.The key of this technology was the construction of large，highly specific and sensitive antibody libraries.This review addresses recent progress in the construction，experimental approaches，and applications of human antibody phage display libraries.
[Key words] antibody phage display libraries；gene mutation；transgener6, http://www.100md.com
噬菌体呈现人抗体库(human phage display)是近年发明的一项新技术，由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了越来越多的生命科学者投入这一研究，使得噬菌体呈现抗体库技术得以发展，由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线[1]。噬菌体呈现人抗体是单克隆抗体发展史上的里程碑，现将噬菌体呈现技术在人抗体库构建的研究策略加以综述。r6, http://www.100md.com
1 噬菌体呈现人抗体库的原理及种类r6, http://www.100md.com
1.1 原理 噬菌体抗体是在膜表面表达有抗体分子Fab或ScFv，这种膜表达是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成，其特点是它既可以识别相应抗原与其相结合，又能够感染宿主菌进行再扩增，将B细胞全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌抗体的群体，则成为噬菌体抗体呈现技术[2]。噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项实验技术的发展：一是PCR技术的发展使人们可以用一组引物，通过RT-PCR直接从总RNA克隆出全套免疫球蛋白可变区基因，从而使抗体库的构建简单易行。二是从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功。三是噬菌体表面表达技术的建立，即将肽链通过与单链噬菌体外壳蛋白融合表达在单链噬菌体的表面。利用其可以再扩增的特性，将靶分子固相化，通过亲和吸附—洗脱—扩增，可筛选到靶分子的配体肽链。可经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终获得高亲和力的特异性抗体[3]。r6, http://www.100md.com
1.2 种类 根据人抗体基因的来源和组成不同可分为[4]：①天然抗体基因库，该抗体基因片段来自于未免疫的供体。特点是该抗体库基本上代表了天然抗体在供体内的抗体谱，但亲和力较低。②免疫抗体库，抗体基因来自于经抗原免疫过的供体，特点是它具有较强的抗原特异性和亲和力，但抗体的多样性低。③半合成抗体库，抗体重链可变区基因片段中的CDR1和CDR2来自于人胚系49种VH基因片段，而CDR3则是人工合成编码5～8或6～15个氨基酸的随机引物来置换Fab抗体中Fd片段的CDR3，构建半合成噬菌体抗体库。其特点是增大了库容量可达到1012，但由于该库中抗体基因没有经过体内免疫系统的选择，因此抗体的亲和力普遍较低。④转基因鼠抗体库，是把人抗体基因转入鼠，获得完全的人抗体，解决了鼠源性问题，将是今后人源性抗体研究和应用的发展方向。
2 噬菌体人抗体库的构建6x+3&, http://www.100md.com
2.1 扩增人抗体Fab基因片段 取业已经抗原接种或被免疫的人外周血淋巴细胞、脾、扁桃腺、淋巴结组织或骨髓细胞，提取总RNA或基因组DNA。理论上每个静止期B细胞可产生100个拷贝的Ig mRNA，而增殖期的浆细胞可产生300个。因此，免疫接种可明显提高Ig mRNA及编码抗原结合部位V区基因的数量。通过RT-PCR扩增获得建库所需的全套抗体基因。抗体基因扩增的5’端引物的设计通常是根据成熟抗体V区外显子的框架1区(FR1)或前导区的保守序列，3’端主要依据抗体绞链区(J区)的保守序列。依据各种抗体基因家族序列而设计一组引物，分别对抗体cDNA或DNA扩增后，再将扩增产物予以混合。有时还采用简并引物扩增，以获得引物与模板间的最大互补性[5]。若制备ScFv抗体基因片段，须设计接头(linkers)DNA，如[Gly4-Ser]3的编码寡核苷酸，制备VH-linker-VL基因连接物，进行下一步的基因克隆与表达。6x+3&, http://www.100md.com
2.2 人抗体基因的克隆 噬菌体抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的，这些载体除含有LacZ启动子、核糖体结合位点、pe1B前导序列及供外源基因插入的多克隆位点外，还含有丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因。pcomb3是一个噬菌体建库所需的常用载体，它是由Lerner小组在1991年构建而成，是将Huse 1989年构建的λ HC2和λ LC2的两个λ载体经Sac1和EcoR2双酶切，连接后成为pcomb3组合噬菌体载体。pcomb3除保留了原载体中的pelB前导序列和供外源基因插入的多克隆位点外，还引入来自M13 Mp18噬菌体LacZ启动子、操纵子及用于控制轻链基因的帽子结合位点等，进一步拼接编码M13噬菌体外壳蛋白的gⅢ基因，并在克隆位点上加来自于pbluescript的填充片段即构成了4029bp的pcomb3。使用这些载体构建抗体基因库时，获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后，克隆进载体相应酶切位点。克隆的方法一般先克隆一类抗体基因，然后再克隆另一类抗体基因，经过随机重排组合将这些基因插入到噬菌体或噬粒表达载体多克隆位点中，所克隆进载体中的重、轻链基因间的配对也存在着很大的随机性，这就进一步丰富了抗体库的内涵，增加了抗体库的多样性。
2.3 表达人抗体基因 在噬菌体抗体库中，由于克隆抗体基因的载体中引入了M13噬菌体外壳蛋白基因，使得抗体与噬菌体外壳蛋白基因融合，并借助外壳蛋白而呈现在噬菌体颗粒的表面。pcomb3构建的噬菌体Fab抗体与噬菌体gⅢ基因融合的抗体重链Fd基因和轻链(κ或λ)基因，由于分别置于各自的LacZ启动子、操纵子序列的控制下进行表达，故能借助于噬菌体外壳蛋白基因中的pelB前导序列各自进入细菌的质周腔中，在此完成重链、轻链的自发折叠而形成Fab抗体(Fd+κ或λ)。pelB前导序列在进入质周腔前被切下去，而质周腔中的Fab抗体则借助重链与cpⅢ形成的融合分子锚定在细菌内膜上，经辅助噬菌体(如VCSM13)感染后，Fab抗体便被包装入噬菌体内，借助于cpⅢ而呈现在噬菌体表面。由于噬菌体还含有天然的cpⅢ蛋白，可以再次感染宿主菌，故抗药噬菌体菌落即为重组成功的噬菌体，形成含有全套人抗体谱的噬菌体抗体文库，库中每一个噬菌体相当于B细胞表达一种特异人单克隆抗体，而多个噬菌体的集合则成为多克隆抗体。利用噬菌体表面的Fab抗体对抗原的结合活性及噬菌体对宿主菌的感染性，可以用固相化抗原方便地对噬菌体抗体库进行淘筛。l74}jf, 百拇医药
除了呈现在噬菌体表面外，Fab抗体还能以可溶性抗体的形式进行表达[6]。Lerner小组在构建pcomb3载体时，将噬菌体外壳蛋白gⅢ基因(或gⅧ基因)的两端设计了spe1和Nhe1两个酶切位点，通过这两个内切酶即可将外壳蛋白基因切除，利用Spe1和Nhe1酶解后产生的互补粘性端，自连后成为环状质粒，转化宿主菌并经IPTG诱导即在细菌的质周腔或培养上清液中得到Fab抗体。Winter小组则采取另一种技术路线解决了这一问题，他们在构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与gⅢ基因之间引入了一个琥珀终止密码子，抗体基因的重组子若转化含有琥珀抑制基因XLBlue的宿主菌，抗体基因和gⅢ基因成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白cpⅢ而呈现在噬菌体表面。如将重组子转化不带有琥珀抑制基因HB2151的宿主菌，由于抗体基因与gⅢ基因之间的终止密码子抑制了gⅢ基因的表达，便产生可溶性的Fab抗体。l74}jf, 百拇医药
2.4 筛选特异性人抗体片段 在人体内B淋巴细胞在抗原提呈作用下，增殖分化为分泌抗体的浆细胞，并在抗原的选择压力下发生突变，产生出具有不同亲和力的抗体。噬菌体呈现抗体库技术模拟了机体免疫系统的这种选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选，同时由于噬菌体对大肠杆菌的感染性，噬菌体抗体库技术能够以淘筛的方式，为快速选择特异性抗体提供了简便而高效的操作系统，具体的步骤：①噬菌体吸附靶抗原。②反复洗涤去除非特异性结合。③洗脱并收集与抗原结合的噬菌体。④再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体淘筛。经过一轮这样的“吸附—洗脱—扩增”的淘筛，可使特异性抗体的噬菌体富集20～1000倍，若每一轮淘筛只按50倍的富集率计算，经过4轮淘筛，可使噬菌体抗体的富集率达108以上，筛选出占库容量仅为1/108的噬菌体抗体，噬菌体抗体库技术借助这种高效筛选系统，能够方便地对库容量在108以上的抗体进行筛选，这种极强的筛选能力是早期的抗体库技术所望尘莫及的[7]。除此之外，也有用固相淘筛、捕获淘选、完整细胞淘筛、组织淘筛及器官淘筛等方法获得结合抗体成功的报道，但各有侧重，为噬菌体抗体的淘筛增添新的途径[8]。
由于细菌转化率的原因，限制了噬菌体抗体库的容量，要构建有足够库容量的抗体库，常成为噬菌体抗体库的技术难点。WATERHOUSE为此设计了一种体内组合抗体重、轻链基因的方法，即先将含有重链的质粒转化大肠杆菌，再用含轻链基因的噬菌体去感染已转化的大肠杆菌，由于处于生长对数期的细菌易被噬菌体感染，这些借助噬菌体感染而进入细菌内的轻链基因都可以与重链基因重组，这种体内进行的重链和轻链基因重组的方式，可望建成库容量为1011的噬菌体抗体库，这已接近于经培养增殖后的细菌数量。但实际上，分别克隆有抗体重链基因和轻链基因的噬菌粒，一般不易同时被包装入一个噬菌体内。于是，WATERHOUSE构建了一个含有特异性Lox-cre位点的噬菌体P1重组系统，能够在噬菌体感染的大肠杆菌内，将位于两个不同载体上的重链基因和轻链基因整合起来，而实现VH和VL基因的重组。WATERHOUSE将克隆有鼠抗phox抗体重链VH基因的质粒pUC19-210x作为供体，而将已克隆有鼠抗phox抗体轻链VL基因和鼠抗TNF α单抗重链VH基因的噬菌体作为受体。在检测的96个克隆中，有68个克隆发生供体重链基因与受体轻链基因间的重组，这样呈现在噬菌体表面的重组抗体只与phox抗原发生ELISA结合反应。WATERHOUSE认为，噬菌体P1重组系统的建立，为增大噬菌体库容量提供了有效途径，使构建的噬菌体抗体库容量更接近于天然抗体库。同时，抗体重、轻链基因在噬菌体P1重组系统中的随机组合，必将大大促进抗体的亲和力突变，为选择高亲和力的抗体提供了方便[9]。^@\.c, 百拇医药
呈现在噬菌体表面的抗体可以是单价，也可以是多价。由于在一个噬菌体内gⅢ基因只有3～5个拷贝，因此，与gⅢ基因融合后表达在噬菌体表面的抗体表现为低价的，当gⅢ基因与抗体基因融合后即失去了感染能力，需要辅助噬菌体提供cpⅢ蛋白才能再次感染宿主菌。此时，往往是cpⅢ蛋白和融合的抗体-cpⅢ蛋白竞争性进入一个噬菌体，故常使呈现在噬菌体表面的抗体为单价。CPⅧ为M13噬菌体的主要外壳蛋白，其基因拷贝数多为3000左右，同gⅢ基因一样，gⅧ基因也常与抗体基因融合而呈现在噬菌体表面，但呈现的抗体常为多价的，在噬菌体表面可以呈现24个不间的抗体片段。一般讲，单价噬菌体抗体常用以选择高亲和力抗体。而多价的噬菌体抗体适合选择低亲和力的抗体。因此，目前在噬菌体抗体库技术中，更多的采用噬菌体cpⅢ选择感染来呈现抗体片段[10]。^@\.c, 百拇医药
3 噬菌体呈现人抗体库的特点和优势
3.1 噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库，不需要免疫人和动物 在噬菌体抗体库中，一方面免疫球蛋白的重链和轻链基因是以人外周血淋巴细胞、骨髓细胞或脾细胞中Ig cDNA为模板进行扩增，它含有人抗体各种基因信息的全部mRNA，为全套抗体基因的获得提供了良好材料。另一方面在构建噬菌体抗体库时，抗体重链基因和轻链基因在体外的重组，造成重、轻链间的配对具有很大的随机性，相同的轻链能与不同的重链或相同的重链能与不同的轻链组合在一起， 这种随机的组合方式进一步丰富了抗体对抗原识别的多样性，一般认为，107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99%。因此，构建一个库容量为108的组合噬菌体抗体库，理论上认为基本上包括了所有的抗体分子。0.s-7v, 百拇医药
3.2 抗体工程菌比杂交瘤细胞稳定、易保存，适应于大规模工业化生产 DNA操作是在细菌中增殖，比杂交瘤技术简单快速，制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需要数月，而噬菌体抗体库技术最短只需几周的时间。噬菌体抗体能够较为容易地对108以上的噬菌体抗体库进行筛选，特别是，首先通过淘筛的富集作用，在一个全套抗体的重、轻链组合噬菌体抗体库中，往往能够筛选到多种具有不同抗原结合活性的特异性抗体，这些抗体的产生不仅不需要细胞的融合，甚至可以不经免疫的个体细胞中提取RNA或DNA，利用分子克隆技术直接从基因水平制备出期待的抗体。MARKS等人报道，从未经免疫的人外周血B淋巴细胞中扩增出人抗体VH和VL基因片段，连接成单链抗体基因，重组人噬菌体载体构建了人的“天然”抗体库，从这一抗体库中筛选到十几种不同的特异性单链抗体，包括一些抗甲状腺球蛋白、精蛋白、TNF、癌胚抗原、CD4、血细胞抗原及自身抗体等分子。在人B细胞中估计有10%～30%产生针对自身抗原的抗体，但因机体免疫耐受则不能反应和增殖，机体处于正常状态下是不易产生的[11]。可见噬菌体抗体库技术可使人们随心所欲地制造抗体的愿望成为现实。0.s-7v, 百拇医药
3.3 能够模拟抗体亲和力成熟过程，获得不同亲和力的抗体 一般认为，机体在初次免疫时，产生的抗体多为低亲和力的，随着抗原的反复刺激作用，便产生多次免疫应答，往往造成免疫细胞的抗体基因发生突变，产生出高亲和力的抗体。在构建噬菌体抗体库时，抗体重链与轻链基因的重组，就模拟了机体内抗体亲和力的成熟过程。在噬菌体抗体库中，抗体重链与轻链间的配对存在着很大的随意性，这往往能改变B细胞中原有的抗体重、轻链间的配对方式，产生出不同亲和力的抗体。应用含gⅢ基因或gⅧ基因的两套载体，就可以对这些不同亲和力抗体加以筛选。一般来说，从未经免疫的个体构建的“天然”抗体库，其抗体的亲和力较低，多为10-4/M。噬菌体抗体库技术可以利用分子生物学的方法，使抗体库内原有的抗体基因发生突变和重组，以改善抗体的亲和力[12]。
通过链置换改变亲和力，链置换在体内是不存在的，它可造成抗体库内抗体的重链基因和轻链基因重新配对，以改善抗体的亲和力，这就是噬菌体抗体库技术用来获得高亲和力抗体的一种常用方法。MARKS从构建的噬菌体抗体库中筛选到亲和力为3×1016/M的phox特异性单链抗体，将该抗体中的轻链更替，即用不同的轻链基因与原抗体的重链基因重组，改变了抗体中原有的重链与轻链的配对方式，这些经过轻链更替后的抗体库中，筛选到亲和力为6×107/M的特异性抗体，使亲和力提高了20倍。MARKS进一步将抗体重链中的CDR1和CDR2区基因更换，并与轻链配对后建库得到了亲和力109/M的抗体，比原库抗体的亲和力提高了320倍，相当于经多次免疫后从鼠杂交瘤制备的抗体。almkq, http://www.100md.com
噬菌体抗体库技术可采用PCR错配或随机致突变技术改变亲和力，这是有目的的进行氨基酸替换，适用于已知抗体序列中某些氨基酸影响亲和力，又是模仿机体内体细胞的突变过程，造成抗体基因的突变而改善抗体的亲和力，重组噬菌体在增殖中会自然随机突变。最新估计每个碱基对在一次分裂时的自然突变率为1/10 000～1/30 000，人工诱变则可用拓构聚合酶在体外，将克隆有抗体重、轻链基因的噬菌粒转化大肠杆菌突变后，可望通过重、轻链基因的自发突变获得高亲和力的抗体。错配PCR技术可造成基因中碱基序列随机突变，提高抗体的亲和力在100～1000倍。由于噬菌体抗体库技术独特的高效筛选系统，使这项技术在噬菌体抗体库中发挥了巨大作用。从天然抗体库中筛选到的低亲和力抗体，经PCR错配技术造成抗体基因中的碱基突变，导致抗体重、轻链基因的体外重排，主要集中在超变区及相连的框架接点，将这些突变、重排后的抗体基因再次构建成次级噬菌体抗体库，利用“吸附—洗脱—扩增”的过程，从中筛选到亲和力增高的突变抗体。GRAM和HANKS采用这一方法，获得了比原抗体亲和力提高数十倍的突变抗体。目前认为，经突变后的抗体重链、轻链基因重组后，导致抗体的重链和轻链随机地进行组合，由此而形成的抗体多样性，甚至可以超过机体免疫系统本身所具有的多样性[13]。由于噬菌体抗体基因主要来源于抗体的可变区，在抗原结合位点CDR区造成的突变，对抗体亲和力的改变具有更加直接的影响，可见噬菌体抗体库技术对提高抗体的亲和力具有巨大的潜力。almkq, http://www.100md.com
4 噬菌体呈现人抗体在鼠体内的构建almkq, http://www.100md.com
获得高亲和力特异性抗体是构建噬菌体呈现人抗体库的关键，现有的链置换、错配PCR及随机致突变技术均模仿机体内体细胞的突变过程，造成抗体基因的突变来改善抗体的亲和力，难度大，制约着人抗体的发展。近年倍受关注的是：①重度联合免疫缺陷(sever combined immunodeficient disease，SCID)，小鼠通过噬菌体呈现抗体库技术路线生产人源性抗体正在兴起，它是将人外周血淋巴细胞或淋巴结细胞及脾细胞移植入SCID小鼠腹腔，在SCID鼠体内建立人的免疫系统，经抗原免疫后，取其外周血淋巴细胞和脾细胞，通过人源噬菌体呈现抗体库技术，获得特异性人源性抗体[14]。②建立人抗体的转基因小鼠(transgenic mouse)，它是基因组工程、转基因动物和杂交瘤技术有机结合，是一项极为复杂的生物工程，首先是用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因，继而将含人抗体轻、重链基因组的小鼠与SCID小鼠杂交，从中选择双转基因/双缺失的纯合小鼠， 这种转基因小鼠体内含有人抗体基因谱，相当于一个生产人抗体的工厂，当小鼠受到靶抗原的刺激则体内的B细胞将产生免疫应答反应，分泌相应的人抗体。通过噬菌体呈现技术路线生产人源性抗体。目前Cell Genesys和Genpharm两个生物工程公司采用不同研究策略，都从人免疫球蛋白转基因小鼠体内获得了人抗体，并对抗体的特异性、亲和力以及生物效应进行了初步分析，结果均显示人源性抗体转基因小鼠能够对人抗原和其他抗原产生免疫反应，表明生产的人抗体具有较高的亲和力和一定程度的多样性。解决了抗体鼠源性和亲和力，成为最有前途的人用抗体，他们生产的部分人抗体已进入临床验证试用阶段。
5 结论与展望([, 百拇医药
噬菌体呈现人抗体库技术已显示它的应用前景，它不仅能够生产具有识别功能的人源性ScFv、Fab双特异性抗体、微型抗体等，而且能够筛选和生产具有催化和切割功能的人抗体酶，这些形态不同、功能各异的人抗体为人类疾病的诊断和治疗带来了希望。但噬菌体呈现人源性抗体库技术目前仍处于发展成熟阶段，有许多问题亟待解决，如获得抗体分子的亲和力和是否还存在免疫原性及毒性作用等。总之，随着人类基因组计划完成及转基因动物的完善和成熟，生产供临床用的人源性抗体将会成为可能，为某些严重危害人类健康的疾病带来希望。([, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(9808059)；重庆“九五”医药卫生攻关课题(98006)([, 百拇医药
[作者简介] 王希良(1963-)，男，河北景县人，副教授，博士，主要从事基因工程抗体和基因疫苗的研究，现在北京军事医学科学院5所3室做博士后，北京 100850。([, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-06-30； [修回日期] 1999-11-29(王希良 黄云辉)
单位：王希良(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；黄云辉(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)；朱锡华(第三军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038){k, http://www.100md.com
关键词：噬菌体抗体库；基因突变；转基因{k, http://www.100md.com
免疫学杂志000420 朱锡华 审校{k, http://www.100md.com
[摘 要] 噬菌体呈现抗体库技术被誉为抗体技术的第三次革命，发展构建库容量大、特异性高和敏感强的人源性抗体库是噬菌体呈现技术的关键。本文就如何提高转化效益、实验策略及抗体应用的研究等方面作一综述。{k, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.11-33 [文献标识码] A{k, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)04-0309-04{k, http://www.100md.com
Strategies for selection of human antibodies by phage display{k, http://www.100md.com
WANG Xi-liang， HUANG Yun-hui{k, http://www.100md.com
(Department of Immunology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China){k, http://www.100md.com
[Abstract] Antibody phage display technology has been described as the third revolution in antibody technology.The key of this technology was the construction of large，highly specific and sensitive antibody libraries.This review addresses recent progress in the construction，experimental approaches，and applications of human antibody phage display libraries.
[Key words] antibody phage display libraries；gene mutation；transgener6, http://www.100md.com
噬菌体呈现人抗体库(human phage display)是近年发明的一项新技术，由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了越来越多的生命科学者投入这一研究，使得噬菌体呈现抗体库技术得以发展，由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线[1]。噬菌体呈现人抗体是单克隆抗体发展史上的里程碑，现将噬菌体呈现技术在人抗体库构建的研究策略加以综述。r6, http://www.100md.com
1 噬菌体呈现人抗体库的原理及种类r6, http://www.100md.com
1.1 原理 噬菌体抗体是在膜表面表达有抗体分子Fab或ScFv，这种膜表达是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成，其特点是它既可以识别相应抗原与其相结合，又能够感染宿主菌进行再扩增，将B细胞全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌抗体的群体，则成为噬菌体抗体呈现技术[2]。噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项实验技术的发展：一是PCR技术的发展使人们可以用一组引物，通过RT-PCR直接从总RNA克隆出全套免疫球蛋白可变区基因，从而使抗体库的构建简单易行。二是从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功。三是噬菌体表面表达技术的建立，即将肽链通过与单链噬菌体外壳蛋白融合表达在单链噬菌体的表面。利用其可以再扩增的特性，将靶分子固相化，通过亲和吸附—洗脱—扩增，可筛选到靶分子的配体肽链。可经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终获得高亲和力的特异性抗体[3]。r6, http://www.100md.com
1.2 种类 根据人抗体基因的来源和组成不同可分为[4]：①天然抗体基因库，该抗体基因片段来自于未免疫的供体。特点是该抗体库基本上代表了天然抗体在供体内的抗体谱，但亲和力较低。②免疫抗体库，抗体基因来自于经抗原免疫过的供体，特点是它具有较强的抗原特异性和亲和力，但抗体的多样性低。③半合成抗体库，抗体重链可变区基因片段中的CDR1和CDR2来自于人胚系49种VH基因片段，而CDR3则是人工合成编码5～8或6～15个氨基酸的随机引物来置换Fab抗体中Fd片段的CDR3，构建半合成噬菌体抗体库。其特点是增大了库容量可达到1012，但由于该库中抗体基因没有经过体内免疫系统的选择，因此抗体的亲和力普遍较低。④转基因鼠抗体库，是把人抗体基因转入鼠，获得完全的人抗体，解决了鼠源性问题，将是今后人源性抗体研究和应用的发展方向。
2 噬菌体人抗体库的构建6x+3&, http://www.100md.com
2.1 扩增人抗体Fab基因片段 取业已经抗原接种或被免疫的人外周血淋巴细胞、脾、扁桃腺、淋巴结组织或骨髓细胞，提取总RNA或基因组DNA。理论上每个静止期B细胞可产生100个拷贝的Ig mRNA，而增殖期的浆细胞可产生300个。因此，免疫接种可明显提高Ig mRNA及编码抗原结合部位V区基因的数量。通过RT-PCR扩增获得建库所需的全套抗体基因。抗体基因扩增的5’端引物的设计通常是根据成熟抗体V区外显子的框架1区(FR1)或前导区的保守序列，3’端主要依据抗体绞链区(J区)的保守序列。依据各种抗体基因家族序列而设计一组引物，分别对抗体cDNA或DNA扩增后，再将扩增产物予以混合。有时还采用简并引物扩增，以获得引物与模板间的最大互补性[5]。若制备ScFv抗体基因片段，须设计接头(linkers)DNA，如[Gly4-Ser]3的编码寡核苷酸，制备VH-linker-VL基因连接物，进行下一步的基因克隆与表达。6x+3&, http://www.100md.com
2.2 人抗体基因的克隆 噬菌体抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的，这些载体除含有LacZ启动子、核糖体结合位点、pe1B前导序列及供外源基因插入的多克隆位点外，还含有丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因。pcomb3是一个噬菌体建库所需的常用载体，它是由Lerner小组在1991年构建而成，是将Huse 1989年构建的λ HC2和λ LC2的两个λ载体经Sac1和EcoR2双酶切，连接后成为pcomb3组合噬菌体载体。pcomb3除保留了原载体中的pelB前导序列和供外源基因插入的多克隆位点外，还引入来自M13 Mp18噬菌体LacZ启动子、操纵子及用于控制轻链基因的帽子结合位点等，进一步拼接编码M13噬菌体外壳蛋白的gⅢ基因，并在克隆位点上加来自于pbluescript的填充片段即构成了4029bp的pcomb3。使用这些载体构建抗体基因库时，获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后，克隆进载体相应酶切位点。克隆的方法一般先克隆一类抗体基因，然后再克隆另一类抗体基因，经过随机重排组合将这些基因插入到噬菌体或噬粒表达载体多克隆位点中，所克隆进载体中的重、轻链基因间的配对也存在着很大的随机性，这就进一步丰富了抗体库的内涵，增加了抗体库的多样性。
2.3 表达人抗体基因 在噬菌体抗体库中，由于克隆抗体基因的载体中引入了M13噬菌体外壳蛋白基因，使得抗体与噬菌体外壳蛋白基因融合，并借助外壳蛋白而呈现在噬菌体颗粒的表面。pcomb3构建的噬菌体Fab抗体与噬菌体gⅢ基因融合的抗体重链Fd基因和轻链(κ或λ)基因，由于分别置于各自的LacZ启动子、操纵子序列的控制下进行表达，故能借助于噬菌体外壳蛋白基因中的pelB前导序列各自进入细菌的质周腔中，在此完成重链、轻链的自发折叠而形成Fab抗体(Fd+κ或λ)。pelB前导序列在进入质周腔前被切下去，而质周腔中的Fab抗体则借助重链与cpⅢ形成的融合分子锚定在细菌内膜上，经辅助噬菌体(如VCSM13)感染后，Fab抗体便被包装入噬菌体内，借助于cpⅢ而呈现在噬菌体表面。由于噬菌体还含有天然的cpⅢ蛋白，可以再次感染宿主菌，故抗药噬菌体菌落即为重组成功的噬菌体，形成含有全套人抗体谱的噬菌体抗体文库，库中每一个噬菌体相当于B细胞表达一种特异人单克隆抗体，而多个噬菌体的集合则成为多克隆抗体。利用噬菌体表面的Fab抗体对抗原的结合活性及噬菌体对宿主菌的感染性，可以用固相化抗原方便地对噬菌体抗体库进行淘筛。l74}jf, 百拇医药
除了呈现在噬菌体表面外，Fab抗体还能以可溶性抗体的形式进行表达[6]。Lerner小组在构建pcomb3载体时，将噬菌体外壳蛋白gⅢ基因(或gⅧ基因)的两端设计了spe1和Nhe1两个酶切位点，通过这两个内切酶即可将外壳蛋白基因切除，利用Spe1和Nhe1酶解后产生的互补粘性端，自连后成为环状质粒，转化宿主菌并经IPTG诱导即在细菌的质周腔或培养上清液中得到Fab抗体。Winter小组则采取另一种技术路线解决了这一问题，他们在构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与gⅢ基因之间引入了一个琥珀终止密码子，抗体基因的重组子若转化含有琥珀抑制基因XLBlue的宿主菌，抗体基因和gⅢ基因成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白cpⅢ而呈现在噬菌体表面。如将重组子转化不带有琥珀抑制基因HB2151的宿主菌，由于抗体基因与gⅢ基因之间的终止密码子抑制了gⅢ基因的表达，便产生可溶性的Fab抗体。l74}jf, 百拇医药
2.4 筛选特异性人抗体片段 在人体内B淋巴细胞在抗原提呈作用下，增殖分化为分泌抗体的浆细胞，并在抗原的选择压力下发生突变，产生出具有不同亲和力的抗体。噬菌体呈现抗体库技术模拟了机体免疫系统的这种选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选，同时由于噬菌体对大肠杆菌的感染性，噬菌体抗体库技术能够以淘筛的方式，为快速选择特异性抗体提供了简便而高效的操作系统，具体的步骤：①噬菌体吸附靶抗原。②反复洗涤去除非特异性结合。③洗脱并收集与抗原结合的噬菌体。④再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体淘筛。经过一轮这样的“吸附—洗脱—扩增”的淘筛，可使特异性抗体的噬菌体富集20～1000倍，若每一轮淘筛只按50倍的富集率计算，经过4轮淘筛，可使噬菌体抗体的富集率达108以上，筛选出占库容量仅为1/108的噬菌体抗体，噬菌体抗体库技术借助这种高效筛选系统，能够方便地对库容量在108以上的抗体进行筛选，这种极强的筛选能力是早期的抗体库技术所望尘莫及的[7]。除此之外，也有用固相淘筛、捕获淘选、完整细胞淘筛、组织淘筛及器官淘筛等方法获得结合抗体成功的报道，但各有侧重，为噬菌体抗体的淘筛增添新的途径[8]。
由于细菌转化率的原因，限制了噬菌体抗体库的容量，要构建有足够库容量的抗体库，常成为噬菌体抗体库的技术难点。WATERHOUSE为此设计了一种体内组合抗体重、轻链基因的方法，即先将含有重链的质粒转化大肠杆菌，再用含轻链基因的噬菌体去感染已转化的大肠杆菌，由于处于生长对数期的细菌易被噬菌体感染，这些借助噬菌体感染而进入细菌内的轻链基因都可以与重链基因重组，这种体内进行的重链和轻链基因重组的方式，可望建成库容量为1011的噬菌体抗体库，这已接近于经培养增殖后的细菌数量。但实际上，分别克隆有抗体重链基因和轻链基因的噬菌粒，一般不易同时被包装入一个噬菌体内。于是，WATERHOUSE构建了一个含有特异性Lox-cre位点的噬菌体P1重组系统，能够在噬菌体感染的大肠杆菌内，将位于两个不同载体上的重链基因和轻链基因整合起来，而实现VH和VL基因的重组。WATERHOUSE将克隆有鼠抗phox抗体重链VH基因的质粒pUC19-210x作为供体，而将已克隆有鼠抗phox抗体轻链VL基因和鼠抗TNF α单抗重链VH基因的噬菌体作为受体。在检测的96个克隆中，有68个克隆发生供体重链基因与受体轻链基因间的重组，这样呈现在噬菌体表面的重组抗体只与phox抗原发生ELISA结合反应。WATERHOUSE认为，噬菌体P1重组系统的建立，为增大噬菌体库容量提供了有效途径，使构建的噬菌体抗体库容量更接近于天然抗体库。同时，抗体重、轻链基因在噬菌体P1重组系统中的随机组合，必将大大促进抗体的亲和力突变，为选择高亲和力的抗体提供了方便[9]。^@\.c, 百拇医药
呈现在噬菌体表面的抗体可以是单价，也可以是多价。由于在一个噬菌体内gⅢ基因只有3～5个拷贝，因此，与gⅢ基因融合后表达在噬菌体表面的抗体表现为低价的，当gⅢ基因与抗体基因融合后即失去了感染能力，需要辅助噬菌体提供cpⅢ蛋白才能再次感染宿主菌。此时，往往是cpⅢ蛋白和融合的抗体-cpⅢ蛋白竞争性进入一个噬菌体，故常使呈现在噬菌体表面的抗体为单价。CPⅧ为M13噬菌体的主要外壳蛋白，其基因拷贝数多为3000左右，同gⅢ基因一样，gⅧ基因也常与抗体基因融合而呈现在噬菌体表面，但呈现的抗体常为多价的，在噬菌体表面可以呈现24个不间的抗体片段。一般讲，单价噬菌体抗体常用以选择高亲和力抗体。而多价的噬菌体抗体适合选择低亲和力的抗体。因此，目前在噬菌体抗体库技术中，更多的采用噬菌体cpⅢ选择感染来呈现抗体片段[10]。^@\.c, 百拇医药
3 噬菌体呈现人抗体库的特点和优势
3.1 噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库，不需要免疫人和动物 在噬菌体抗体库中，一方面免疫球蛋白的重链和轻链基因是以人外周血淋巴细胞、骨髓细胞或脾细胞中Ig cDNA为模板进行扩增，它含有人抗体各种基因信息的全部mRNA，为全套抗体基因的获得提供了良好材料。另一方面在构建噬菌体抗体库时，抗体重链基因和轻链基因在体外的重组，造成重、轻链间的配对具有很大的随机性，相同的轻链能与不同的重链或相同的重链能与不同的轻链组合在一起， 这种随机的组合方式进一步丰富了抗体对抗原识别的多样性，一般认为，107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99%。因此，构建一个库容量为108的组合噬菌体抗体库，理论上认为基本上包括了所有的抗体分子。0.s-7v, 百拇医药
3.2 抗体工程菌比杂交瘤细胞稳定、易保存，适应于大规模工业化生产 DNA操作是在细菌中增殖，比杂交瘤技术简单快速，制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需要数月，而噬菌体抗体库技术最短只需几周的时间。噬菌体抗体能够较为容易地对108以上的噬菌体抗体库进行筛选，特别是，首先通过淘筛的富集作用，在一个全套抗体的重、轻链组合噬菌体抗体库中，往往能够筛选到多种具有不同抗原结合活性的特异性抗体，这些抗体的产生不仅不需要细胞的融合，甚至可以不经免疫的个体细胞中提取RNA或DNA，利用分子克隆技术直接从基因水平制备出期待的抗体。MARKS等人报道，从未经免疫的人外周血B淋巴细胞中扩增出人抗体VH和VL基因片段，连接成单链抗体基因，重组人噬菌体载体构建了人的“天然”抗体库，从这一抗体库中筛选到十几种不同的特异性单链抗体，包括一些抗甲状腺球蛋白、精蛋白、TNF、癌胚抗原、CD4、血细胞抗原及自身抗体等分子。在人B细胞中估计有10%～30%产生针对自身抗原的抗体，但因机体免疫耐受则不能反应和增殖，机体处于正常状态下是不易产生的[11]。可见噬菌体抗体库技术可使人们随心所欲地制造抗体的愿望成为现实。0.s-7v, 百拇医药
3.3 能够模拟抗体亲和力成熟过程，获得不同亲和力的抗体 一般认为，机体在初次免疫时，产生的抗体多为低亲和力的，随着抗原的反复刺激作用，便产生多次免疫应答，往往造成免疫细胞的抗体基因发生突变，产生出高亲和力的抗体。在构建噬菌体抗体库时，抗体重链与轻链基因的重组，就模拟了机体内抗体亲和力的成熟过程。在噬菌体抗体库中，抗体重链与轻链间的配对存在着很大的随意性，这往往能改变B细胞中原有的抗体重、轻链间的配对方式，产生出不同亲和力的抗体。应用含gⅢ基因或gⅧ基因的两套载体，就可以对这些不同亲和力抗体加以筛选。一般来说，从未经免疫的个体构建的“天然”抗体库，其抗体的亲和力较低，多为10-4/M。噬菌体抗体库技术可以利用分子生物学的方法，使抗体库内原有的抗体基因发生突变和重组，以改善抗体的亲和力[12]。
通过链置换改变亲和力，链置换在体内是不存在的，它可造成抗体库内抗体的重链基因和轻链基因重新配对，以改善抗体的亲和力，这就是噬菌体抗体库技术用来获得高亲和力抗体的一种常用方法。MARKS从构建的噬菌体抗体库中筛选到亲和力为3×1016/M的phox特异性单链抗体，将该抗体中的轻链更替，即用不同的轻链基因与原抗体的重链基因重组，改变了抗体中原有的重链与轻链的配对方式，这些经过轻链更替后的抗体库中，筛选到亲和力为6×107/M的特异性抗体，使亲和力提高了20倍。MARKS进一步将抗体重链中的CDR1和CDR2区基因更换，并与轻链配对后建库得到了亲和力109/M的抗体，比原库抗体的亲和力提高了320倍，相当于经多次免疫后从鼠杂交瘤制备的抗体。almkq, http://www.100md.com
噬菌体抗体库技术可采用PCR错配或随机致突变技术改变亲和力，这是有目的的进行氨基酸替换，适用于已知抗体序列中某些氨基酸影响亲和力，又是模仿机体内体细胞的突变过程，造成抗体基因的突变而改善抗体的亲和力，重组噬菌体在增殖中会自然随机突变。最新估计每个碱基对在一次分裂时的自然突变率为1/10 000～1/30 000，人工诱变则可用拓构聚合酶在体外，将克隆有抗体重、轻链基因的噬菌粒转化大肠杆菌突变后，可望通过重、轻链基因的自发突变获得高亲和力的抗体。错配PCR技术可造成基因中碱基序列随机突变，提高抗体的亲和力在100～1000倍。由于噬菌体抗体库技术独特的高效筛选系统，使这项技术在噬菌体抗体库中发挥了巨大作用。从天然抗体库中筛选到的低亲和力抗体，经PCR错配技术造成抗体基因中的碱基突变，导致抗体重、轻链基因的体外重排，主要集中在超变区及相连的框架接点，将这些突变、重排后的抗体基因再次构建成次级噬菌体抗体库，利用“吸附—洗脱—扩增”的过程，从中筛选到亲和力增高的突变抗体。GRAM和HANKS采用这一方法，获得了比原抗体亲和力提高数十倍的突变抗体。目前认为，经突变后的抗体重链、轻链基因重组后，导致抗体的重链和轻链随机地进行组合，由此而形成的抗体多样性，甚至可以超过机体免疫系统本身所具有的多样性[13]。由于噬菌体抗体基因主要来源于抗体的可变区，在抗原结合位点CDR区造成的突变，对抗体亲和力的改变具有更加直接的影响，可见噬菌体抗体库技术对提高抗体的亲和力具有巨大的潜力。almkq, http://www.100md.com
4 噬菌体呈现人抗体在鼠体内的构建almkq, http://www.100md.com
获得高亲和力特异性抗体是构建噬菌体呈现人抗体库的关键，现有的链置换、错配PCR及随机致突变技术均模仿机体内体细胞的突变过程，造成抗体基因的突变来改善抗体的亲和力，难度大，制约着人抗体的发展。近年倍受关注的是：①重度联合免疫缺陷(sever combined immunodeficient disease，SCID)，小鼠通过噬菌体呈现抗体库技术路线生产人源性抗体正在兴起，它是将人外周血淋巴细胞或淋巴结细胞及脾细胞移植入SCID小鼠腹腔，在SCID鼠体内建立人的免疫系统，经抗原免疫后，取其外周血淋巴细胞和脾细胞，通过人源噬菌体呈现抗体库技术，获得特异性人源性抗体[14]。②建立人抗体的转基因小鼠(transgenic mouse)，它是基因组工程、转基因动物和杂交瘤技术有机结合，是一项极为复杂的生物工程，首先是用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因，继而将含人抗体轻、重链基因组的小鼠与SCID小鼠杂交，从中选择双转基因/双缺失的纯合小鼠， 这种转基因小鼠体内含有人抗体基因谱，相当于一个生产人抗体的工厂，当小鼠受到靶抗原的刺激则体内的B细胞将产生免疫应答反应，分泌相应的人抗体。通过噬菌体呈现技术路线生产人源性抗体。目前Cell Genesys和Genpharm两个生物工程公司采用不同研究策略，都从人免疫球蛋白转基因小鼠体内获得了人抗体，并对抗体的特异性、亲和力以及生物效应进行了初步分析，结果均显示人源性抗体转基因小鼠能够对人抗原和其他抗原产生免疫反应，表明生产的人抗体具有较高的亲和力和一定程度的多样性。解决了抗体鼠源性和亲和力，成为最有前途的人用抗体，他们生产的部分人抗体已进入临床验证试用阶段。
5 结论与展望([, 百拇医药
噬菌体呈现人抗体库技术已显示它的应用前景，它不仅能够生产具有识别功能的人源性ScFv、Fab双特异性抗体、微型抗体等，而且能够筛选和生产具有催化和切割功能的人抗体酶，这些形态不同、功能各异的人抗体为人类疾病的诊断和治疗带来了希望。但噬菌体呈现人源性抗体库技术目前仍处于发展成熟阶段，有许多问题亟待解决，如获得抗体分子的亲和力和是否还存在免疫原性及毒性作用等。总之，随着人类基因组计划完成及转基因动物的完善和成熟，生产供临床用的人源性抗体将会成为可能，为某些严重危害人类健康的疾病带来希望。([, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(9808059)；重庆“九五”医药卫生攻关课题(98006)([, 百拇医药
[作者简介] 王希良(1963-)，男，河北景县人，副教授，博士，主要从事基因工程抗体和基因疫苗的研究，现在北京军事医学科学院5所3室做博士后，北京 100850。([, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-06-30； [修回日期] 1999-11-29(王希良 黄云辉)