红毛五加多糖诱导胃癌细胞凋亡研究
作者：吕晓英 曾令福 杨培全 李由 王维祥 肖能国
单位：成都军区军事医学研究所，昆明 650032
关键词：红毛五加多糖；胃癌；凋亡
中国新药杂志000306 摘要 目的：研究红毛五加多糖抑癌机制。方法：采用DNA电泳。结果：该多糖作用胃癌细胞后提取DNA电泳呈现梯状图谱。结论：该多糖有诱导胃癌细胞凋亡作用。
APOPTOSIS OF GASTRIC CANCER CELLS INDUCED BY AGP
Lu Xiaoying Zeng Lingfu Yang Peiquan
(Institute of Military Medical Sciences, Chengdu Military Command, Kunming 650032)
, 百拇医药
ABSTRACT OBJECTIVE:To explore the antitumor mechanism of AGP (Acanthopanax giraldii Harms Var Hispidus Hoo polysaccharides).METHODS:DNA agarose electrophoresis technique was adopted. RESULTS:The apoptosis of cancer cells was induced by the treatment of AGP.CONCLUSION:The antitumor mechanism of AGP is related to drug-induced apoptosis of cancer cells and its antitumor activity depends on the molecular weight and molecular composition of the agent.
KEY WORDS AGP; Gastric cancer; Apoptosis
, 百拇医药
以往有关红毛五加多糖(AGP)抑制肿瘤机制探讨主要是提高机体免疫力和对细胞超微结构的影响等方面的研究[1～5]。但从细胞凋亡的角度来探讨该多糖体外抑癌机制的研究，目前还未见报道。
材料与方法
1 材料
AGP是红毛五加茎皮的水提液经分离纯化得到的多糖成分。AGPⅡ：相对分子质量为83 000，由D-半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及一未知单糖组成；AGPⅢ：相对分子质量为42 000，由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及一未知单糖组成。
细胞株为人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，由华西医科大学肿瘤研究所提供。
主要试剂和仪器：PK(Sigma公司，美国)；Rnase(Sigma公司，美国)；CO2孵箱(日本平泽制作所产品，TE—HERMARK Ⅱ型)。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 实验分组 空白对照组：不加任何样品的全培养液，培养72h；维生素C对照组：在培养液中的终浓度为1.0×10-4mol/L，培养72h；维生素C顺铂阳性对照组：顺铂在培养液中的终浓度为3.3×10-5mol/L，培养36h；顺铂坏死对照组：顺铂在培养液中的终浓度为3.3×10-4mol/L，培养36h；AGP组：AGP在培养液中的终浓度为1.0×10-4mol/L，分别培养36，48，60，72h。
2.2 细胞DNA提取及电泳 细胞经磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤及离心后弃上清液，加2ml裂解缓冲液，振荡混匀。加入125μl的10%SDS，加蛋白酶K使终浓度为100μg/ml，65℃水浴至少30min。完全裂解后加1/10 (v/v)醋酸钠和2倍体积的95%冷乙醇冰水浴1～2h。离心收集上清液，加等体积TE平衡饱和酚抽提DNA，收集上清液，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)重复抽提。取上清液用异丙醇沉淀DNA。20μl的TE溶解DNA，取10μl DNA与等量载体缓冲液混匀，加入2%琼脂糖凝胶加样孔中(含EB终浓度0.5μg/ml)，在6v/cm电泳6～8h，紫外灯下观察DNA电泳带型，摄片。
, 百拇医药
结 果
在1.0×10-4mol/L浓度，AGPⅡ作用36h，AGPⅢ作用48h 后的细胞，提取DNA进行电泳，呈现梯状电泳模式，且随着作用时间延长，梯状渐趋明显，与顺铂对照组在3.3×10-5mol/L浓度作用36h呈现结果一致。而坏死细胞DNA经电泳后只形成连续的条带，无DNA梯状图谱。维生素C对照组与空白对照组无此现象。AGPⅡ的作用较AGPⅢ更为明显，见图1及图2。
图1 AGPⅡ作用时间与凋亡诱导效率的关系
泳道1，2分别为空白对照与维生素C对照；泳道3～6AGPⅡ作用时间分别为36，48，60和72h；泳道7,8分别为CDDP坏死对照和阳性对照；M示DNA大小标志(pBR322/Msp I)(下同)。
, 百拇医药
图2 AGPⅢ作用时间与凋亡诱导效率的关系
讨 论
1972年Kerr等[6]根据凋亡细胞所特有的形态学特征，首次提出细胞凋亡(apoptosis)的概念。与细胞凋亡形态改变相对应的生化基础，是DNA双螺旋结构由核小体间连接区断裂，形成以180～200bp为基本单位的核苷酸片段，经琼脂糖凝胶电泳后呈现DNA梯状图谱(DNA ladder)[7]，是细胞凋亡的生化改变。DNA电泳能定性检测出细胞凋亡的发生。本实验从生化改变的研究表明，AGP有诱导肿瘤细胞SGC-7901凋亡的作用。其作用效果虽没有抗癌药物顺铂的作用强烈，但因其毒性极小、来源广泛、提取简便及经济而应受到重视[8～11]。提示AGP在防治癌症方面具有重要的开发实用价值，其中AGPⅡ的作用较AGPⅢ更为明显，提示其抗癌效果与分子量和分子组成有关。
参考文献
, http://www.100md.com
1，王满霞，张莅峡，刘泓.红毛王加茎皮多糖对体外培养人白血病粒细胞超微结构影响的观察.中国中医基础医学杂志，1995，1(3)∶29
2，王满霞，张莅峡，刘泓，等.红毛五加茎皮多糖对体外培养人白血病粒细胞生物学效应的研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1994，3(1)∶72
3，江之泉，章崇杰，汪成孝，等.红毛五加多糖对小鼠免疫功能的增强作用.华西药学杂志，1994，9(4)∶211
4，李兴玉，魏虎来，张吉旺，等.红毛五加抗辐射损伤的观察.甘肃中医学院学报，1989，6(3)∶62
5，张莅峡，胡庆和，刘泓，等.红毛五加多糖对机体免疫功能的影响.中药材，1994，17(5)∶36
6，Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phemomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26(4)∶239
, http://www.100md.com
7，Wyllie AH.Glucocorticoid-induced thymocyte apopotosis is associated with endonuclease activation .Nature,1980,284(10)∶555
8，沈映君，冷怀瑛，黄国钧，等.红毛五加皮的药理研究.成都中医学院学报，1983，6(4)∶43
9，黄国钧，冷怀瑛，杨世芝，等.中药红毛五加皮抗缺氧作用的实验研究.成都中医学院学报，1984，7(1)∶53
10，李成林.红毛五加抗应激作用的实验研究.中药药理与临床，1991，7(2)∶29
11，施亚琴，杨培全，周俊国，等.红毛五加多糖的提取及含量测定.华西药学杂志，1994，9(2)∶73
收稿：1999-08-18
修回：1999-12-15, http://www.100md.com
单位：成都军区军事医学研究所，昆明 650032
关键词：红毛五加多糖；胃癌；凋亡
中国新药杂志000306 摘要 目的：研究红毛五加多糖抑癌机制。方法：采用DNA电泳。结果：该多糖作用胃癌细胞后提取DNA电泳呈现梯状图谱。结论：该多糖有诱导胃癌细胞凋亡作用。
APOPTOSIS OF GASTRIC CANCER CELLS INDUCED BY AGP
Lu Xiaoying Zeng Lingfu Yang Peiquan
(Institute of Military Medical Sciences, Chengdu Military Command, Kunming 650032)
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ABSTRACT OBJECTIVE:To explore the antitumor mechanism of AGP (Acanthopanax giraldii Harms Var Hispidus Hoo polysaccharides).METHODS:DNA agarose electrophoresis technique was adopted. RESULTS:The apoptosis of cancer cells was induced by the treatment of AGP.CONCLUSION:The antitumor mechanism of AGP is related to drug-induced apoptosis of cancer cells and its antitumor activity depends on the molecular weight and molecular composition of the agent.
KEY WORDS AGP; Gastric cancer; Apoptosis
, 百拇医药
以往有关红毛五加多糖(AGP)抑制肿瘤机制探讨主要是提高机体免疫力和对细胞超微结构的影响等方面的研究[1～5]。但从细胞凋亡的角度来探讨该多糖体外抑癌机制的研究，目前还未见报道。
材料与方法
1 材料
AGP是红毛五加茎皮的水提液经分离纯化得到的多糖成分。AGPⅡ：相对分子质量为83 000，由D-半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及一未知单糖组成；AGPⅢ：相对分子质量为42 000，由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖及一未知单糖组成。
细胞株为人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901，由华西医科大学肿瘤研究所提供。
主要试剂和仪器：PK(Sigma公司，美国)；Rnase(Sigma公司，美国)；CO2孵箱(日本平泽制作所产品，TE—HERMARK Ⅱ型)。
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2 方法
2.1 实验分组 空白对照组：不加任何样品的全培养液，培养72h；维生素C对照组：在培养液中的终浓度为1.0×10-4mol/L，培养72h；维生素C顺铂阳性对照组：顺铂在培养液中的终浓度为3.3×10-5mol/L，培养36h；顺铂坏死对照组：顺铂在培养液中的终浓度为3.3×10-4mol/L，培养36h；AGP组：AGP在培养液中的终浓度为1.0×10-4mol/L，分别培养36，48，60，72h。
2.2 细胞DNA提取及电泳 细胞经磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤及离心后弃上清液，加2ml裂解缓冲液，振荡混匀。加入125μl的10%SDS，加蛋白酶K使终浓度为100μg/ml，65℃水浴至少30min。完全裂解后加1/10 (v/v)醋酸钠和2倍体积的95%冷乙醇冰水浴1～2h。离心收集上清液，加等体积TE平衡饱和酚抽提DNA，收集上清液，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)重复抽提。取上清液用异丙醇沉淀DNA。20μl的TE溶解DNA，取10μl DNA与等量载体缓冲液混匀，加入2%琼脂糖凝胶加样孔中(含EB终浓度0.5μg/ml)，在6v/cm电泳6～8h，紫外灯下观察DNA电泳带型，摄片。
, 百拇医药
结 果
在1.0×10-4mol/L浓度，AGPⅡ作用36h，AGPⅢ作用48h 后的细胞，提取DNA进行电泳，呈现梯状电泳模式，且随着作用时间延长，梯状渐趋明显，与顺铂对照组在3.3×10-5mol/L浓度作用36h呈现结果一致。而坏死细胞DNA经电泳后只形成连续的条带，无DNA梯状图谱。维生素C对照组与空白对照组无此现象。AGPⅡ的作用较AGPⅢ更为明显，见图1及图2。
图1 AGPⅡ作用时间与凋亡诱导效率的关系
泳道1，2分别为空白对照与维生素C对照；泳道3～6AGPⅡ作用时间分别为36，48，60和72h；泳道7,8分别为CDDP坏死对照和阳性对照；M示DNA大小标志(pBR322/Msp I)(下同)。
, 百拇医药
图2 AGPⅢ作用时间与凋亡诱导效率的关系
讨 论
1972年Kerr等[6]根据凋亡细胞所特有的形态学特征，首次提出细胞凋亡(apoptosis)的概念。与细胞凋亡形态改变相对应的生化基础，是DNA双螺旋结构由核小体间连接区断裂，形成以180～200bp为基本单位的核苷酸片段，经琼脂糖凝胶电泳后呈现DNA梯状图谱(DNA ladder)[7]，是细胞凋亡的生化改变。DNA电泳能定性检测出细胞凋亡的发生。本实验从生化改变的研究表明，AGP有诱导肿瘤细胞SGC-7901凋亡的作用。其作用效果虽没有抗癌药物顺铂的作用强烈，但因其毒性极小、来源广泛、提取简便及经济而应受到重视[8～11]。提示AGP在防治癌症方面具有重要的开发实用价值，其中AGPⅡ的作用较AGPⅢ更为明显，提示其抗癌效果与分子量和分子组成有关。
参考文献
, http://www.100md.com
1，王满霞，张莅峡，刘泓.红毛王加茎皮多糖对体外培养人白血病粒细胞超微结构影响的观察.中国中医基础医学杂志，1995，1(3)∶29
2，王满霞，张莅峡，刘泓，等.红毛五加茎皮多糖对体外培养人白血病粒细胞生物学效应的研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1994，3(1)∶72
3，江之泉，章崇杰，汪成孝，等.红毛五加多糖对小鼠免疫功能的增强作用.华西药学杂志，1994，9(4)∶211
4，李兴玉，魏虎来，张吉旺，等.红毛五加抗辐射损伤的观察.甘肃中医学院学报，1989，6(3)∶62
5，张莅峡，胡庆和，刘泓，等.红毛五加多糖对机体免疫功能的影响.中药材，1994，17(5)∶36
6，Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phemomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26(4)∶239
, http://www.100md.com
7，Wyllie AH.Glucocorticoid-induced thymocyte apopotosis is associated with endonuclease activation .Nature,1980,284(10)∶555
8，沈映君，冷怀瑛，黄国钧，等.红毛五加皮的药理研究.成都中医学院学报，1983，6(4)∶43
9，黄国钧，冷怀瑛，杨世芝，等.中药红毛五加皮抗缺氧作用的实验研究.成都中医学院学报，1984，7(1)∶53
10，李成林.红毛五加抗应激作用的实验研究.中药药理与临床，1991，7(2)∶29
11，施亚琴，杨培全，周俊国，等.红毛五加多糖的提取及含量测定.华西药学杂志，1994，9(2)∶73
收稿：1999-08-18
修回：1999-12-15, http://www.100md.com