人外周血树突细胞的分离与提纯
作者：郑秋红 郑天荣 卢林 陈晖 谢云青
单位：福建省肿瘤医院肿瘤分子生物研究室，福州 350014
关键词：树突细胞；细胞培养；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；白细胞介素4
福建医科大学学报000207
摘要:目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞(DC)。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞，培养2 h后，取粘附细胞，在无血清培养基中加入不同的细胞因子，于培养的第1,6,8天对形态、表型和功能分别进行测定,并在光镜、电镜下观察DC诱导及生长情况，定期检测DC的纯度与得率。结果 体外培养6～8天，可获得高纯度大量的DC，较高表达HLA-DR、CD40、CD83和CD86，能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血中获得较大量的、纯度较高的DC。
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中图分类号:R392.24;R392.12 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0115-05
Isolation and Purification of Dendritic Cells from Human Peripheral Blood
ZHENG Qiu-hong,ZHENG Tian-rong,Lu Lin,et al
(Department Tumours Molecular Biology,Fujian Tumor Hospital,Fuzhou 350014,China)
ABSTRACT:Objective Proliferation and isolation of dendritic cells from human peripheral blood.Methods Monocytes isolated from human peripheral blood,culture for 2 hours.The adherent cells were cultured with different cytokines respectively in serum-free culture.The cells were examined by phenotype/FACS for 1,6 and 8 days respectively,and the cell growth was inspected under a light microscope and electronmicroscope at regular interval and determined function assay.Results During 6 days to 8 days,a large number of DC with high purity were generated.DC expressed HLA-DR,CD40,CD86 and CD83 costimulating moleculars highly on cell surface and could stimulate proliferation of allogeneic T lymphocytes.Conclusion In serum-free culture,a numbers of dendritic cells was obtained from the human peripheral blood.
, http://www.100md.com
KEY WORDS:dendritic cell;cell culture;granulocyte/macrophage colony stimulating factor;interleukin-4
树突细胞(dendritic cells,DC)是已知的功能最强的抗原呈递细胞，它可以直接激活纯真T细胞，在诱导T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起着重要作用[1，2]。近年来，对于DC的生物学特点及参与免疫应答的机制研究较多，特别是它在肿瘤免疫中的重要地位越来越受到重视[3]，目前已知DC的分化发育来源不是单一的[4，5]。在DC的体外扩增培养中，联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和白细胞介素4(hIL-4)可以促进DC的生成[6]。1999年1月～1999年12月，笔者从正常人外周血中分离单个核细胞，在无血清培养的条件下，体外研究DC增殖、分化、成熟的形态学及功能特征，以期为进一步安全应用于临床、开展DC瘤苗的肿瘤免疫治疗建立初步基础。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)与人肿瘤坏死因子(TNF-α)购自邦定生物医学公司，hIL-4购自英国Pepro Tech公司，抗人CD40、抗人CD83、抗人CD86、同亚型对照抗体-小鼠IgG1单克隆抗体均购自美国PharMingen公司，抗人HLA-DR单抗隆抗体及异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠IgG荧光二抗购自北欧Serotec公司，淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海试剂二厂；RPMI 1640培养基及无血清培养基购自上海Life Technologies公司。正常人AB血清及健康人外周血由福州市中心血站提供。
1.2 树突细胞体外培养 新鲜分离的正常人抗凝外周全血，经淋巴细胞分离液(Ficoll)梯度离心(500×g,15 min)，取界面细胞，置于50 ml离心管中，用Hank's溶液悬浮细胞600×g，8 min洗涤细胞2～3次，用RPMI 1640完全培养基悬浮细胞以(1～2)×107/ml的细胞浓度加入六孔培养板中，37℃ 5% CO2孵箱培养2 h，吸掉上清，用培养液洗去非粘附细胞，获得贴壁细胞，再加入AIMV培养基，按rhGM-CSF 1000 U/ml，rhIL-4 500～1000 U/ml终浓度加入细胞因子，进行培养。
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1.3 树突细胞的得率与纯度 对经过rhGM-CSF和hIL-4细胞因子诱导培养1,3,6和8天的DC于倒置显微镜下观察，进行了DC的得率与纯度的计算[7]。
1.4 细胞表面表型检测 用流式细胞标记液PBA(PBS+0.5%BSA+0.02%叠氮钠)悬浮细胞1×106/ml加入离心管(100 μl/管),再加入PBA稀释的一抗100 μl，单抗标记浓度为5 μg/ml,，置4℃标记30 min之后，PBS洗细胞2次，加入羊抗鼠IgG荧光二抗200 μl/管，悬浮细胞，二抗标记浓度为2 μg/ml，4℃暗处标记30 min，PBS洗2次，细胞悬于含有1%多聚甲醛的PBS荧光染色细胞保存液中。流式细胞仪(Bryte HS型,美国Bio-RAD公司)表型分析。
1.5 混合淋巴细胞反应 取其他健康人外周血经淋巴细胞分离液分离后，取界面细胞，37℃ 5%孵箱培养2 h，取非粘附细胞，用含10%人AB血清的1640培养基悬浮，按400 U/ml加入IL-2，于37℃ 5% CO2孵箱培养，作为同种异体淋巴细胞。DC分为两组:一组为常规培养8天的DC，另一组为在培养6天时加入50 ng/ml TNF-α刺激2天的DC。刺激细胞∶效应细胞1∶04,1∶20,1∶200,1∶2000,1∶20000和1∶200000的比例加入96孔培养板，终体积为200 μl ，于37℃ 5% CO2孵箱培养120 h,于培养前加入3H-TDR(1 μCi/孔)。收集细胞，液闪计数仪检测cpm值，结果用3孔均值表示。
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1.6 电镜分析 DC悬液用PBS洗2次，4%戊二醛固定后，PBS洗1次，制成悬液，梯度酒精脱水，用1∶1的纯乙醇和叔丁醇浸透1 h，真空干燥、喷金，扫描电镜观察摄片。另取DC悬液离心，细胞沉淀用4%戊二醛固定，梯度酒精脱水，经超薄切片铅轴染色，透射电镜观察摄片。
2 结 果
2.1 DC体外培养形态 获取人外周血单个核细胞(PBMC)，贴壁培养2 h，获得粘附细胞;加不同细胞因子培养24 h，可见贴壁细胞聚集现象(图1A)，体积小，多为圆形，有少量半悬浮细胞；2～3天半悬浮细胞逐渐增加，体积变大，形状不规则；6～8天大部分细胞脱壁悬浮。显微镜观察，可见伸展的毛刺状突起，为典型的DC形态(图1B)。
图1 DC群体外培养不同时期的形态
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A:培养1天(×100) B:培养6天(×200) 相差显微镜
2.2 DC的扩增效率及表型检测 诱导培养的细胞1,3,6和8天在倒置显微镜下观察，高倍镜下计数形态典型的DC和单个核细胞，发现DC的得率从1天的1.91%增至8天的14.4%，8天收获的DC达到93.17%的纯度(图2)。分别于1,6和8天进行流式细胞仪分析检测，与DC相关的CD40、HLA-DR、CD86、CD83逐渐增高(图3)。
图2 不同培养天数DC的得率与纯度
图3 培养不同天数的DC表面表型检测
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A:第0天;B:第6天;C:第8天.
图4 树突细胞电镜超微结构
A:扫描电镜下的树突细胞 ×7700 B:扫描电镜下的巨噬细胞 ×9000 C，D:透射电镜下的树突细胞 ×4729
2.3 扫描电镜观察 取培养8天的DC进行电镜观察，显示DC表面粗糙，形态多呈不规则状，有大量皱折和不规则突起，与巨噬细胞表面的小棘和脊状突起迥然不同(图4A，4B)。透射电镜显示具有典型形态特征的DC，由胞膜伸展的长短不一的突起，构成不规则的外形，细胞质中富含线粒体，较少溶酶体，此外，还可见较多的吞饮大泡和小泡(图4C,4D)。
2.4 混合淋巴细胞培养 将人外周血所得培养8天的两组DC作为刺激细胞，在一定的比例范围内与同种异体淋巴细胞混合，均可产生增殖反应，结果显示，经过TNF-α处理后的DC，激发能力明显增强(P<0.05)，表明所制备的DC具有极强的抗原呈递功能，最明显的刺激效果均发生在DC浓度相对较高的比例(图5)。
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3 讨 论
近年来，随着大量肿瘤抗原的发现，以肿瘤疫苗为基础的主动性免疫治疗和T细胞介导的抗肿瘤免疫应答成为肿瘤治疗新的热点。抗原的识别、加工、提呈及T细胞的致敏、激活和扩增依赖于抗原呈递细胞(APC)的参与和作用。DC是以奇特的外形、高表达MHCⅡ类分子、共刺激分子、粘附分子、分泌高水平Th1型细胞因子IL-12以及具有强烈的激发混合淋巴细胞反应及抗原提呈能力而被确认为是机体内“专职”的抗原呈递细胞。随着近年人们对抗原呈递细胞分子机制、TCR识别机制、T细胞激活分子机制等的深入认识，抗原呈递细胞特别是DC的研究日益受到重视。
图5 DC激发同种混合淋巴细胞反应的能力
1:DC 2:TNF-a预激的DC.
大量的动物实验表面应用肿瘤抗原体外冲击致敏DC，少量回输即可诱导机体产生极强的抗肿瘤免疫[8～10]。近年来，国外DC的临床应用已逐步展开。1996年国外首次应用抗独特型抗体体外冲击致敏来源于B细胞淋巴瘤患者外周血的自体DC，并过继回输的方法，部分病例已收到了良好疗效[11]。Murphy小组选择前列腺特异性膜抗原的HLA-A0201特异性抗原多肽(PSM-P)体外冲击致敏外周血来源的自体DC，回输治疗了51例对激素疗法无效的前列腺癌患者，认为该疗法具有一定临床应用可行性[12]。
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笔者曾从正常人外周血获取单个核细胞，联合应用GM-CSF和IL-4细胞因子诱生了大量的DC[13]。为了更安全应用于临床，避免在疫苗接种中的过敏反应，笔者改用无血清培养基对DC进行培养；同时，通过使用相差显微镜、电镜、流式细胞仪等方法，对DC进行了更为透彻的分析与观察。采用无血清培养基培养的、经过6～8天诱生培养的DC与笔者以往的实验结果相比，在相同剂量细胞因子诱导下，同样可以得到较高的纯度(93.71%±18.4%)与得率(14.4%±3.12%)。此外，通过对培养1～8天的DC进行了动态的FACS分析证实，得到了一群纯度大于80%(CD86/CD40[14])、较高程度表达CD40、CD86和HLA-DR分子、体外可强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖的DC群,其中代表DC成熟的特征性标志CD83为10.6%。笔者认为,在经过无血清培养基培养的树突细胞群中，既有成熟细胞也有不成熟的DC。这一结论与Morse的观点相似[15]。由于不成熟DC能够更有效加工和提呈抗原，而成熟DC对T细胞刺激更好，因此能同时孵育出成熟与不成熟的DC在临床上的应用效果将会更好。
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目前，肿瘤抗原体外冲击的DC疫苗回输治疗肿瘤方法已经引起人们极大的兴趣。本文旨在建立更为完善的DC的分离、培养及鉴定的实验条件，为今后肿瘤患者临床应用DC疫苗提供良好的基础。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(97067)
作者简介:郑秋红(1962～)，女，主治医师.
参考文献：
[1]Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271～296.
[2]Dubois B,Vanbervliet B,Favette J,et al.Dendritic cells enhance growth and differentiation of CD40-activated B lymphocytes[J].J Exp Med,1997,185:941～951.
, 百拇医药
[3]Stingl G，Bergstresser PR.Dendritic cells: a major story unfold[J].Immunol Today,1995,16:330～333.
[4]Young JW,Szabols P,Moore MAS.Identification of dendritic cell colony-forming units among normal human CD34+ bone marrow progenitors that are expanded by c-kit-ligand and yield pure dendritic cell colonies in the presence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and tumor necrosis factor α[J].J Exp Med,1995,182:1111～1119.
, 百拇医药
[5]Res P,Martinez-Caceres E,Jaleco AC,et al.CD34+CD38 dim cells in the human thymus can differentiate into T natural killer,and dendritic cells but are distinct from plunripotent stem cells[J].Blood,1996,87:5196～5206.
[6]Romani N,Reider D,Hener M,et al.Generation of mature dendritic cells from human blood:an improved method with special regard to clinical applicability[J].J Immunol Methods,1996,196(2):137～151.
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[7]徐 琪，邵 莹，张乃宁，等.肿瘤患者自体树突细胞的建立[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1999,6(3)212.
[8]Boczkowshi D,Nair SK,Snyder D,et al.Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo[J].J Exp Med,1996,184:465～472.
[9]Zitvogel L,Mayordomo JI,Tjandrawan T,et al.Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on T cells,B7 costimulation,and T helper cell associated cytokine[J].J Exp Med,1996,183:87～97.
, 百拇医药
[10]Song LS,Lee V,Surh CD,et al.Antigen presentation in retroviral vector-mediated gene transfer in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:1943～1948.
[11]Hsu FJ,Benike C,Fagnoni F,et al.Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells[J].Nat Med,1996,2:52～58.
[12]Salgaller ML,Tjoa BA,Lodger PA,et al.Dendritic cell-based immuntherapy of prostate cancer[J].Crit Rev Immunol,1998,18(1,2):109～119.
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[13]苏 华,郑秋红,何 维.人外周血及脐血树突细胞的体外分离培养[J].基础医学与临床,1999,19(4):92～96.
[14]邵 莹，徐 琪，李 慧，等.MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体DC及激活CTL杀伤性的研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志,1999,6(3):215.
[15]Morse MD,Michael A,liang-li Zhou MD et al.Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte -acrophage-colony-stimulator factor,interlukin-4,and tumor necrosis factor-alpha for cancer[J].Immunother Ann Surg,1997,226(1):6～16.
收稿日期:2000-01-11, http://www.100md.com
单位：福建省肿瘤医院肿瘤分子生物研究室，福州 350014
关键词：树突细胞；细胞培养；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；白细胞介素4
福建医科大学学报000207
摘要:目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞(DC)。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞，培养2 h后，取粘附细胞，在无血清培养基中加入不同的细胞因子，于培养的第1,6,8天对形态、表型和功能分别进行测定,并在光镜、电镜下观察DC诱导及生长情况，定期检测DC的纯度与得率。结果 体外培养6～8天，可获得高纯度大量的DC，较高表达HLA-DR、CD40、CD83和CD86，能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血中获得较大量的、纯度较高的DC。
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中图分类号:R392.24;R392.12 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0115-05
Isolation and Purification of Dendritic Cells from Human Peripheral Blood
ZHENG Qiu-hong,ZHENG Tian-rong,Lu Lin,et al
(Department Tumours Molecular Biology,Fujian Tumor Hospital,Fuzhou 350014,China)
ABSTRACT:Objective Proliferation and isolation of dendritic cells from human peripheral blood.Methods Monocytes isolated from human peripheral blood,culture for 2 hours.The adherent cells were cultured with different cytokines respectively in serum-free culture.The cells were examined by phenotype/FACS for 1,6 and 8 days respectively,and the cell growth was inspected under a light microscope and electronmicroscope at regular interval and determined function assay.Results During 6 days to 8 days,a large number of DC with high purity were generated.DC expressed HLA-DR,CD40,CD86 and CD83 costimulating moleculars highly on cell surface and could stimulate proliferation of allogeneic T lymphocytes.Conclusion In serum-free culture,a numbers of dendritic cells was obtained from the human peripheral blood.
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KEY WORDS:dendritic cell;cell culture;granulocyte/macrophage colony stimulating factor;interleukin-4
树突细胞(dendritic cells,DC)是已知的功能最强的抗原呈递细胞，它可以直接激活纯真T细胞，在诱导T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起着重要作用[1，2]。近年来，对于DC的生物学特点及参与免疫应答的机制研究较多，特别是它在肿瘤免疫中的重要地位越来越受到重视[3]，目前已知DC的分化发育来源不是单一的[4，5]。在DC的体外扩增培养中，联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)和白细胞介素4(hIL-4)可以促进DC的生成[6]。1999年1月～1999年12月，笔者从正常人外周血中分离单个核细胞，在无血清培养的条件下，体外研究DC增殖、分化、成熟的形态学及功能特征，以期为进一步安全应用于临床、开展DC瘤苗的肿瘤免疫治疗建立初步基础。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)与人肿瘤坏死因子(TNF-α)购自邦定生物医学公司，hIL-4购自英国Pepro Tech公司，抗人CD40、抗人CD83、抗人CD86、同亚型对照抗体-小鼠IgG1单克隆抗体均购自美国PharMingen公司，抗人HLA-DR单抗隆抗体及异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠IgG荧光二抗购自北欧Serotec公司，淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海试剂二厂；RPMI 1640培养基及无血清培养基购自上海Life Technologies公司。正常人AB血清及健康人外周血由福州市中心血站提供。
1.2 树突细胞体外培养 新鲜分离的正常人抗凝外周全血，经淋巴细胞分离液(Ficoll)梯度离心(500×g,15 min)，取界面细胞，置于50 ml离心管中，用Hank's溶液悬浮细胞600×g，8 min洗涤细胞2～3次，用RPMI 1640完全培养基悬浮细胞以(1～2)×107/ml的细胞浓度加入六孔培养板中，37℃ 5% CO2孵箱培养2 h，吸掉上清，用培养液洗去非粘附细胞，获得贴壁细胞，再加入AIMV培养基，按rhGM-CSF 1000 U/ml，rhIL-4 500～1000 U/ml终浓度加入细胞因子，进行培养。
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1.3 树突细胞的得率与纯度 对经过rhGM-CSF和hIL-4细胞因子诱导培养1,3,6和8天的DC于倒置显微镜下观察，进行了DC的得率与纯度的计算[7]。
1.4 细胞表面表型检测 用流式细胞标记液PBA(PBS+0.5%BSA+0.02%叠氮钠)悬浮细胞1×106/ml加入离心管(100 μl/管),再加入PBA稀释的一抗100 μl，单抗标记浓度为5 μg/ml,，置4℃标记30 min之后，PBS洗细胞2次，加入羊抗鼠IgG荧光二抗200 μl/管，悬浮细胞，二抗标记浓度为2 μg/ml，4℃暗处标记30 min，PBS洗2次，细胞悬于含有1%多聚甲醛的PBS荧光染色细胞保存液中。流式细胞仪(Bryte HS型,美国Bio-RAD公司)表型分析。
1.5 混合淋巴细胞反应 取其他健康人外周血经淋巴细胞分离液分离后，取界面细胞，37℃ 5%孵箱培养2 h，取非粘附细胞，用含10%人AB血清的1640培养基悬浮，按400 U/ml加入IL-2，于37℃ 5% CO2孵箱培养，作为同种异体淋巴细胞。DC分为两组:一组为常规培养8天的DC，另一组为在培养6天时加入50 ng/ml TNF-α刺激2天的DC。刺激细胞∶效应细胞1∶04,1∶20,1∶200,1∶2000,1∶20000和1∶200000的比例加入96孔培养板，终体积为200 μl ，于37℃ 5% CO2孵箱培养120 h,于培养前加入3H-TDR(1 μCi/孔)。收集细胞，液闪计数仪检测cpm值，结果用3孔均值表示。
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1.6 电镜分析 DC悬液用PBS洗2次，4%戊二醛固定后，PBS洗1次，制成悬液，梯度酒精脱水，用1∶1的纯乙醇和叔丁醇浸透1 h，真空干燥、喷金，扫描电镜观察摄片。另取DC悬液离心，细胞沉淀用4%戊二醛固定，梯度酒精脱水，经超薄切片铅轴染色，透射电镜观察摄片。
2 结 果
2.1 DC体外培养形态 获取人外周血单个核细胞(PBMC)，贴壁培养2 h，获得粘附细胞;加不同细胞因子培养24 h，可见贴壁细胞聚集现象(图1A)，体积小，多为圆形，有少量半悬浮细胞；2～3天半悬浮细胞逐渐增加，体积变大，形状不规则；6～8天大部分细胞脱壁悬浮。显微镜观察，可见伸展的毛刺状突起，为典型的DC形态(图1B)。
图1 DC群体外培养不同时期的形态
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A:培养1天(×100) B:培养6天(×200) 相差显微镜
2.2 DC的扩增效率及表型检测 诱导培养的细胞1,3,6和8天在倒置显微镜下观察，高倍镜下计数形态典型的DC和单个核细胞，发现DC的得率从1天的1.91%增至8天的14.4%，8天收获的DC达到93.17%的纯度(图2)。分别于1,6和8天进行流式细胞仪分析检测，与DC相关的CD40、HLA-DR、CD86、CD83逐渐增高(图3)。
图2 不同培养天数DC的得率与纯度
图3 培养不同天数的DC表面表型检测
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A:第0天;B:第6天;C:第8天.
图4 树突细胞电镜超微结构
A:扫描电镜下的树突细胞 ×7700 B:扫描电镜下的巨噬细胞 ×9000 C，D:透射电镜下的树突细胞 ×4729
2.3 扫描电镜观察 取培养8天的DC进行电镜观察，显示DC表面粗糙，形态多呈不规则状，有大量皱折和不规则突起，与巨噬细胞表面的小棘和脊状突起迥然不同(图4A，4B)。透射电镜显示具有典型形态特征的DC，由胞膜伸展的长短不一的突起，构成不规则的外形，细胞质中富含线粒体，较少溶酶体，此外，还可见较多的吞饮大泡和小泡(图4C,4D)。
2.4 混合淋巴细胞培养 将人外周血所得培养8天的两组DC作为刺激细胞，在一定的比例范围内与同种异体淋巴细胞混合，均可产生增殖反应，结果显示，经过TNF-α处理后的DC，激发能力明显增强(P<0.05)，表明所制备的DC具有极强的抗原呈递功能，最明显的刺激效果均发生在DC浓度相对较高的比例(图5)。
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近年来，随着大量肿瘤抗原的发现，以肿瘤疫苗为基础的主动性免疫治疗和T细胞介导的抗肿瘤免疫应答成为肿瘤治疗新的热点。抗原的识别、加工、提呈及T细胞的致敏、激活和扩增依赖于抗原呈递细胞(APC)的参与和作用。DC是以奇特的外形、高表达MHCⅡ类分子、共刺激分子、粘附分子、分泌高水平Th1型细胞因子IL-12以及具有强烈的激发混合淋巴细胞反应及抗原提呈能力而被确认为是机体内“专职”的抗原呈递细胞。随着近年人们对抗原呈递细胞分子机制、TCR识别机制、T细胞激活分子机制等的深入认识，抗原呈递细胞特别是DC的研究日益受到重视。
图5 DC激发同种混合淋巴细胞反应的能力
1:DC 2:TNF-a预激的DC.
大量的动物实验表面应用肿瘤抗原体外冲击致敏DC，少量回输即可诱导机体产生极强的抗肿瘤免疫[8～10]。近年来，国外DC的临床应用已逐步展开。1996年国外首次应用抗独特型抗体体外冲击致敏来源于B细胞淋巴瘤患者外周血的自体DC，并过继回输的方法，部分病例已收到了良好疗效[11]。Murphy小组选择前列腺特异性膜抗原的HLA-A0201特异性抗原多肽(PSM-P)体外冲击致敏外周血来源的自体DC，回输治疗了51例对激素疗法无效的前列腺癌患者，认为该疗法具有一定临床应用可行性[12]。
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笔者曾从正常人外周血获取单个核细胞，联合应用GM-CSF和IL-4细胞因子诱生了大量的DC[13]。为了更安全应用于临床，避免在疫苗接种中的过敏反应，笔者改用无血清培养基对DC进行培养；同时，通过使用相差显微镜、电镜、流式细胞仪等方法，对DC进行了更为透彻的分析与观察。采用无血清培养基培养的、经过6～8天诱生培养的DC与笔者以往的实验结果相比，在相同剂量细胞因子诱导下，同样可以得到较高的纯度(93.71%±18.4%)与得率(14.4%±3.12%)。此外，通过对培养1～8天的DC进行了动态的FACS分析证实，得到了一群纯度大于80%(CD86/CD40[14])、较高程度表达CD40、CD86和HLA-DR分子、体外可强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖的DC群,其中代表DC成熟的特征性标志CD83为10.6%。笔者认为,在经过无血清培养基培养的树突细胞群中，既有成熟细胞也有不成熟的DC。这一结论与Morse的观点相似[15]。由于不成熟DC能够更有效加工和提呈抗原，而成熟DC对T细胞刺激更好，因此能同时孵育出成熟与不成熟的DC在临床上的应用效果将会更好。
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目前，肿瘤抗原体外冲击的DC疫苗回输治疗肿瘤方法已经引起人们极大的兴趣。本文旨在建立更为完善的DC的分离、培养及鉴定的实验条件，为今后肿瘤患者临床应用DC疫苗提供良好的基础。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(97067)
作者简介:郑秋红(1962～)，女，主治医师.
参考文献：
[1]Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271～296.
[2]Dubois B,Vanbervliet B,Favette J,et al.Dendritic cells enhance growth and differentiation of CD40-activated B lymphocytes[J].J Exp Med,1997,185:941～951.
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[3]Stingl G，Bergstresser PR.Dendritic cells: a major story unfold[J].Immunol Today,1995,16:330～333.
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收稿日期:2000-01-11, http://www.100md.com