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编号:10288992
变性高效液相色谱法检测基因单核苷酸多态性
http://www.100md.com 《中华检验医学杂志》 2000年第6期
     作者:许琪 李瑞雪 王艳萍 沈岩

    单位:许琪 王艳萍 沈岩(中国医学科学院基础医学研究所,中国协和医科大学基础医学院,医学分子生物学国家重点实验室,国家人类基因组北方研究中心 北京,100005);李瑞雪(CENE基因有限公司)

    关键词:

    中华检验医学杂志000613 我们采用变性高效液相色谱(dHPLC)技术检测单核苷酸多态性(SNP)。根据Cargill提供的思路是:聚合酶链反应(PCR)扩增出包含多态性位点的片段,变性后缓慢复性,当样品为杂合子时,将出现4种组分:2种同源双链和2种异源杂合双链,所以在最佳分离条件下,可能出现4个吸收峰。

    人儿茶酚胺甲基转移酶基因密码子136和158处分别存在CTC→CTG和GTG→ATG的多态性;5-羟色胺受体2a基因74位和102位碱基处分别存在C→A及T→C的多态性。我们用dHPLC与酶切2种方法分别对上述2个基因的4个多态性位点进行了研究。
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    一、材料和方法

    1.标本来源:60名志愿者无关个体,分别提取DNA。

    2.PCR反应:总体积为含10 μl pfu缓冲液100 μl(德国),25 μmol三磷酸脱氧核糖核苷(dNTR,德国),引物各20 pmol,序列参照HodaF和Erdmann J的报道,由赛百盛公司合成,pfu DNA聚合酶2 IU(德国)及0.1 μg模板DNA。反应条件为94℃ 30 s,64℃(儿茶酚胺甲基转移酶)或58℃(5-羟色胺受体2a) 30 s,72℃ 30 s,35个循环。

    3.酶切:儿茶酚胺甲基转移酶基因136位与158位多态性的识别酶分别为Bcl Ⅰ(50℃)与Nla Ⅲ(37℃),5-羟色胺受体2a基因74位与102位多态性的识别酶分别为BStN Ⅰ(60℃)与Hpa Ⅱ(37℃)。

    4.dHPLC检测与分析:PCR产物94℃变性5 min后,以 -1℃/s的速度缓慢复性至4℃。将样品置于WAVETM色谱仪(美国)的96孔板上,输入DNA序列,根据软件计算提示选择最佳运行温度,以流速为0.9 ml/min运行样品。
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    二、结果

    1.在儿茶酚胺甲基转移酶基因中,经酶切共发现6种基因型,分别为:CTC136CTC/ATG158ATG、CTG136CTG/GTG-158ATG、CTC136CTC/GTG158ATG、CTC136CTG/GTG158GTG、CTC136CTG/GTG158ATG、CTC136CTC/GTG158GTG;在dHPLC上可见到4种典型图谱,分别为上述前4种基因型,而第3与第5种基因型及第4与第6种基因型的dHPLC图谱相似。即:当第158位的基因型相同,而第136位为CTC136CTC与CTC136CTG 2种基因型在dHPLC上很难区分。

    2.在5-羟色胺受体2a基因中,经酶切共发现3种基因型,分别为:C74C/T102C、C74C/C102C、C74C/T102T;在dHPLC可见到2种典型图谱,1种是C74C/T102C,而另2种基因型:C74C/C102C与C74C/T102T的图形相似。
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    三、讨论

    dHPLC检测SNP的原理是:通过带正电荷的流动相将带负电荷的DNA分子吸附到固定相上,在运行温度接近DNA片段Tm值时,包含错配位点的杂合双链区域比无错配的同源配对区更易被洗脱, DNA分子将根据其与固定相亲和力的强弱被先后洗脱下来,从而达到分离的目的。

    儿茶酚胺甲基转移酶与5-羟色胺是精神分裂症研究中关键的物质,儿茶酚胺甲基转移酶基因和5-羟色胺受体2a基因的SNP研究将对该病病因研究提供重要的遗传信息。

    在本研究结果中,儿茶酚胺甲基转移酶基因中136位的CTC/CTC与CTC/CTG在dHPLC图谱上相似的原因,可能是由于这一位点附近的GC含量较高,在64℃与65℃运行时DNA双链难以打开,而当运行温度进一步提高到66℃以上时,DNA双链又均变成单链,所以难以区分。这一问题有可能通过改变流动相与洗脱液成分配比、使用N7-dGTP、加“GC夹”等方法解决。5-羟色胺受体2a基因中C74C/C102C与C74C/T102T均为纯合子,不会形成异源杂合双链,所以在dHPLC检测中仅为吸收峰保留时间上的微小差异,而在图谱形状上无明显不同。这一问题可以通过向样品中掺入一定量的某种纯合子扩增产物(C74C/C102C或C74C/T102T)来解决,即:若掺入者与被检测者的基因型相同,则图谱不会改变;若掺入者与被检测者的基因型不同,将形成异源杂合双链,使图谱形状改变。
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    虽然在上述情况下dHPLC无法象酶切检测那样对已知SNP实现100%检出,但它在寻找未知SNP方面具有明显优势。首先,酶切无法用于搜寻未知位点的碱基改变,而且并不是所有的SNP都能找到相应的酶切开;其次,变性梯度凝胶电泳和单链构型多态性均耗时长、检出率低;测序的成本又较高。而dHPLC检测一个样品仅需几分钟,且全自动化操作,因此可以先通过dHPLC对大样本进行粗筛,再对其中峰型特异者测序确认,这样可以降低成本、提高工作效率。

    基金项目:国家自然科学基金(编号:39625007)、国家重点基础性研究973项目基金(编号:G1998051000)、美国中华医学基金(编号95-617)资助

    (收稿日期:2000-03-17), 百拇医药