改良的精浆锌快速微量检测法
作者：王望九 汤明礼 李笑梅 陈永华
单位：230038 合肥市，安徽中医学院中西医结合系
关键词：精液；锌；检测法
实用医学杂志000745 摘 要 目的：探讨一种更加快速简便，重复性好的精浆锌快速微量检测法。方法：精浆锌和4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚反应，形成锌-色原复合物，在490 nm处比色；取消了高氯酸消化蛋白质的步骤，将原法中加中和缓冲液、显色试剂、双蒸水三个步骤合成一步。结果：23例正常对照组精浆锌浓度(1.95±0.69)mmol/L，锌总量(6.61±3.01)μ mol/total；标准锌液在10.96μ mol/L内呈直线相关；批内重复精浆锌浓度(mmol/L)分别为2.902±0.100，1.006±0.050，变异系数分别为3.45%，4.97%；批间重复平均锌浓度(mmol/L)分别为2.802±0.119，1.008±0.060，变异系数分别为4.25%，5.95%；分别将不同浓度的锌加到8份精浆样品中，平均回复率(98.34±4.09)%；每份精浆加6.118μ mol/L锌标稀释液250μ l，平均回复率为(97.90±6.16)%。结论：改良法具有快速、简便的优点，样品、试剂量少，重复性、直线性好，可以用于临床实验室的精液分析。
, 百拇医药
我们对精浆锌快速微量检测法进行了改良，全部采用国产试剂，简化了文献[1，2]的步骤，使之更加快速、简便，适用于男性不育症者的精液分析。反应原理是精浆锌和4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚在pH 9.5的缓冲液中反应，形成锌-色原复合物，在490 nm处有最大吸收波长。
1 材料与方法
1.1 试剂配制 (1)锌标准原液(15.295 mmol/L)：氧化锌粉末110℃烘烤过夜，精确称取1.2448 g，加入浓盐酸3 ml，用双蒸水稀释至1 000 ml。锌标准稀释液(6.118μ mol/L)：取锌标准原液，用双蒸水稀释至1 000 ml。(2)中和缓冲液：取氢氧化钠1.440 g，四硼酸钠27.459 g溶于双蒸水中并稀释至1 000 ml。4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚一钠即4-(2-pyridylazo)resorcinol mono sodium salt，简称PAR溶液(3.918 mmol/L)，取PAR 0.1 g溶解于双蒸水中并稀释至1 000 ml。(3)显色溶液：每次临用前配制，取中和缓冲液59份，PAR溶液1份，混合而成。PAR为国产指示剂，其余试剂均为国产分析纯，所有溶液均用双蒸水配制。
, 百拇医药
1.2 仪器 南京华东电子管厂DG-3022酶联免疫检测仪。
1.3 取样 精液样品液化后，测量精液量，取一部分精液3 000 r/min离心10 min，取上清液-20℃冻存备用。
1.4 回顾性质控 混合多份已知高锌含量精浆，混合多份已知低锌含量精浆，分别分装多份，-20℃冻存备用，每次各取1支，随机插入样品中测定，进行回顾性质控。
1.5 精浆锌测定方法 样品管加1 μ l精浆，250 μ l双蒸水，标准管加250 μ l锌标准稀释液，空白管加250 μ l双蒸水。每管加显色溶液300 μ l，充分混合。5 min后，1 h内，96孔版每孔加液250 μ l，每样品加2孔，空白管调零，酶标仪490 nm比色。
1.6 计算 锌浓度(mmol/L)=(A样品/A标准)×(6.118×250)/1 000=1.5295×(A样品/A标准)；锌总量(μ mol/total，μ mol/T)=锌浓度(μ mol/ml=mmol/L)×精液量(ml)。式中A为吸光度，6.118是锌标准稀释液微摩尔浓度，250是精浆稀释倍数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 精浆锌浓度 23例正常对照组精浆锌浓度(1.95±0.69)mmol/L，锌总量(6.61±3.01)μ mol/T，参考值范围锌浓度为0.92～3.20 mmol/L，锌总量2.38～13.42 μ mol/T。
2.2 直线线性关系 不同浓度系列标准锌液的颜色反应呈直线关系。标准锌液在10.96μ mol/L内呈直线关系，而对应精浆锌达6.08 mmol/L，已远高于正常人或不育症者精浆锌最高浓度。
2.3 精密性 两份高、低锌浓度精浆作批内重复试验，每份10次重复，精浆锌浓度分别为(2.902±0.100)mmol/L，(1.006±0.050)mmol/L，变异系数分别为3.45%，4.97%。两份高、低锌浓度高质控精浆样品每2周测1次，共测12次，批间平均锌浓度分别为(2.802±0.119)mmol/L，(1.008±0.060)mmol/L，变异系数分别为4.25%，5.95%。
, 百拇医药
2.4 回复率 分别将不同浓度的锌加到8份精浆样品中测回复率，平均回复率(98.34±4.09)%。每份精浆加6.118 μ mol/L锌标准稀释液250 μ l，整个反应体系为2.77 μ mol/L锌标液，测精浆回复率。自1995年7月～1996年4月共测定8次59份精浆，平均回复率为(97.90±6.16)%。
2.5 改良法与高氯酸法比较 高氯酸法测定精浆锌方法参阅文献[1，2]。两法同时测定精浆锌，结果呈高度相关(n=70，r=0.993，P<0.001)。过氯酸法高、低质控批内变异系数分别为3.91%，5.88%，批间变异系数分别为4.17%，6.85%[2]。改良法在重复性上高于过氯酸法。
2.6 微量法与常量法关系 微量法总液量550 μ l，酶标仪比色。常量法基本方法同微量法，只不过总液量扩大为2 800 μ l，721分光光度计比色。两法同时测定精浆锌样品50份，结果呈高度相关(n=50，r=0.997，P<0.001)。
, 百拇医药
3 讨论
23例正常对照组精浆锌浓度(1.95±0.69)mmol/L，锌总量(6.61±3.01)μ mol/T，参考值范围锌浓度0.92～3.20 mmol/L，锌总量2.28～13.42 μ mol/T，接近WHO[3]精浆锌参考值≥2.4 μ mol/T，略低于Cooper等[4]报道的正常生育者精浆锌总量2.8～20.5 μ mol/T，他们的比色法测精浆锌的显色剂不同。
精浆锌可作为前列腺分泌物的可靠标记[3]，锌的缺如影响垂体分泌促性腺激素，致使性腺功能减退，睾丸萎缩，精子数目减少，死精子增多，低锌与男性生育力降低有关[5]。通常分析锌含量的方法是原子吸收光谱法，但此法仪器昂贵，阻碍许多实验室使用。Lampugnani等[1]将4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚作为显色剂用于精液锌的测定，并认为该法和原子吸收法相似。作者全部采用国产试剂，简化了文献[1，2]的步骤，使之更加快速、简便，适用于男性不育症者的精液分析。
, 百拇医药
微量比色法的某些技术要点请参阅文献[6，7]，和原法[1，2]比较，本法取消了高氯酸消化蛋白质的步骤，也缩短了消化所需要的时间，因为精浆高度稀释后，无需用高氯酸消化去除蛋白质干扰。另外将原法中加中和缓冲液、显色试剂、双蒸水三个步骤合成一步，这样原来加液的五个步骤缩为两个步骤，也就减少了加液的误差和时间。试验表明，本法具有快速，简便，样品、试剂量少，重复性，直线性好，可以用于临床实验室的精液分析。
参考文献
1，Lampugnani L,Maccheroni M. Rapid colorimetry of zinc in seminal fluid. Clin Chem,1984,30(8):1366～1368.
2，王望九，产美英，李笑梅，等. 男性不育者精浆锌的微量比色法. 安徽医学，1996，17(1)：52～53，57.
, 百拇医药
3，World Health Organization. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge:Cambridge University Press,1992. 3～23,70～71.
4，Cooper TG,Jockcnhovel F,Nieschlag E. Variations in semen parameters from fathers. Hum Reprod,1991,6(6):859～863.
5，谢文英，王一飞，江 鱼. 男性学. 上海：上海科学技术出版社，1991. 152～153.
6，王望九，陈永华，汤明礼，等. 男性精浆α-糖苷酶微量检测的研究. 安徽中医学院学报，1995，14(3)：62～64.
7，王望九，陈永华，汤明礼，等. 男性生育及不育者精浆果糖微量检测的研究. 生殖医学杂志，1995，4(3)：171～172.
(收稿日期：1999-10-25), 百拇医药
单位：230038 合肥市，安徽中医学院中西医结合系
关键词：精液；锌；检测法
实用医学杂志000745 摘 要 目的：探讨一种更加快速简便，重复性好的精浆锌快速微量检测法。方法：精浆锌和4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚反应，形成锌-色原复合物，在490 nm处比色；取消了高氯酸消化蛋白质的步骤，将原法中加中和缓冲液、显色试剂、双蒸水三个步骤合成一步。结果：23例正常对照组精浆锌浓度(1.95±0.69)mmol/L，锌总量(6.61±3.01)μ mol/total；标准锌液在10.96μ mol/L内呈直线相关；批内重复精浆锌浓度(mmol/L)分别为2.902±0.100，1.006±0.050，变异系数分别为3.45%，4.97%；批间重复平均锌浓度(mmol/L)分别为2.802±0.119，1.008±0.060，变异系数分别为4.25%，5.95%；分别将不同浓度的锌加到8份精浆样品中，平均回复率(98.34±4.09)%；每份精浆加6.118μ mol/L锌标稀释液250μ l，平均回复率为(97.90±6.16)%。结论：改良法具有快速、简便的优点，样品、试剂量少，重复性、直线性好，可以用于临床实验室的精液分析。
, 百拇医药
我们对精浆锌快速微量检测法进行了改良，全部采用国产试剂，简化了文献[1，2]的步骤，使之更加快速、简便，适用于男性不育症者的精液分析。反应原理是精浆锌和4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚在pH 9.5的缓冲液中反应，形成锌-色原复合物，在490 nm处有最大吸收波长。
1 材料与方法
1.1 试剂配制 (1)锌标准原液(15.295 mmol/L)：氧化锌粉末110℃烘烤过夜，精确称取1.2448 g，加入浓盐酸3 ml，用双蒸水稀释至1 000 ml。锌标准稀释液(6.118μ mol/L)：取锌标准原液，用双蒸水稀释至1 000 ml。(2)中和缓冲液：取氢氧化钠1.440 g，四硼酸钠27.459 g溶于双蒸水中并稀释至1 000 ml。4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚一钠即4-(2-pyridylazo)resorcinol mono sodium salt，简称PAR溶液(3.918 mmol/L)，取PAR 0.1 g溶解于双蒸水中并稀释至1 000 ml。(3)显色溶液：每次临用前配制，取中和缓冲液59份，PAR溶液1份，混合而成。PAR为国产指示剂，其余试剂均为国产分析纯，所有溶液均用双蒸水配制。
, 百拇医药
1.2 仪器 南京华东电子管厂DG-3022酶联免疫检测仪。
1.3 取样 精液样品液化后，测量精液量，取一部分精液3 000 r/min离心10 min，取上清液-20℃冻存备用。
1.4 回顾性质控 混合多份已知高锌含量精浆，混合多份已知低锌含量精浆，分别分装多份，-20℃冻存备用，每次各取1支，随机插入样品中测定，进行回顾性质控。
1.5 精浆锌测定方法 样品管加1 μ l精浆，250 μ l双蒸水，标准管加250 μ l锌标准稀释液，空白管加250 μ l双蒸水。每管加显色溶液300 μ l，充分混合。5 min后，1 h内，96孔版每孔加液250 μ l，每样品加2孔，空白管调零，酶标仪490 nm比色。
1.6 计算 锌浓度(mmol/L)=(A样品/A标准)×(6.118×250)/1 000=1.5295×(A样品/A标准)；锌总量(μ mol/total，μ mol/T)=锌浓度(μ mol/ml=mmol/L)×精液量(ml)。式中A为吸光度，6.118是锌标准稀释液微摩尔浓度，250是精浆稀释倍数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 精浆锌浓度 23例正常对照组精浆锌浓度(1.95±0.69)mmol/L，锌总量(6.61±3.01)μ mol/T，参考值范围锌浓度为0.92～3.20 mmol/L，锌总量2.38～13.42 μ mol/T。
2.2 直线线性关系 不同浓度系列标准锌液的颜色反应呈直线关系。标准锌液在10.96μ mol/L内呈直线关系，而对应精浆锌达6.08 mmol/L，已远高于正常人或不育症者精浆锌最高浓度。
2.3 精密性 两份高、低锌浓度精浆作批内重复试验，每份10次重复，精浆锌浓度分别为(2.902±0.100)mmol/L，(1.006±0.050)mmol/L，变异系数分别为3.45%，4.97%。两份高、低锌浓度高质控精浆样品每2周测1次，共测12次，批间平均锌浓度分别为(2.802±0.119)mmol/L，(1.008±0.060)mmol/L，变异系数分别为4.25%，5.95%。
, 百拇医药
2.4 回复率 分别将不同浓度的锌加到8份精浆样品中测回复率，平均回复率(98.34±4.09)%。每份精浆加6.118 μ mol/L锌标准稀释液250 μ l，整个反应体系为2.77 μ mol/L锌标液，测精浆回复率。自1995年7月～1996年4月共测定8次59份精浆，平均回复率为(97.90±6.16)%。
2.5 改良法与高氯酸法比较 高氯酸法测定精浆锌方法参阅文献[1，2]。两法同时测定精浆锌，结果呈高度相关(n=70，r=0.993，P<0.001)。过氯酸法高、低质控批内变异系数分别为3.91%，5.88%，批间变异系数分别为4.17%，6.85%[2]。改良法在重复性上高于过氯酸法。
2.6 微量法与常量法关系 微量法总液量550 μ l，酶标仪比色。常量法基本方法同微量法，只不过总液量扩大为2 800 μ l，721分光光度计比色。两法同时测定精浆锌样品50份，结果呈高度相关(n=50，r=0.997，P<0.001)。
, 百拇医药
3 讨论
23例正常对照组精浆锌浓度(1.95±0.69)mmol/L，锌总量(6.61±3.01)μ mol/T，参考值范围锌浓度0.92～3.20 mmol/L，锌总量2.28～13.42 μ mol/T，接近WHO[3]精浆锌参考值≥2.4 μ mol/T，略低于Cooper等[4]报道的正常生育者精浆锌总量2.8～20.5 μ mol/T，他们的比色法测精浆锌的显色剂不同。
精浆锌可作为前列腺分泌物的可靠标记[3]，锌的缺如影响垂体分泌促性腺激素，致使性腺功能减退，睾丸萎缩，精子数目减少，死精子增多，低锌与男性生育力降低有关[5]。通常分析锌含量的方法是原子吸收光谱法，但此法仪器昂贵，阻碍许多实验室使用。Lampugnani等[1]将4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚作为显色剂用于精液锌的测定，并认为该法和原子吸收法相似。作者全部采用国产试剂，简化了文献[1，2]的步骤，使之更加快速、简便，适用于男性不育症者的精液分析。
, 百拇医药
微量比色法的某些技术要点请参阅文献[6，7]，和原法[1，2]比较，本法取消了高氯酸消化蛋白质的步骤，也缩短了消化所需要的时间，因为精浆高度稀释后，无需用高氯酸消化去除蛋白质干扰。另外将原法中加中和缓冲液、显色试剂、双蒸水三个步骤合成一步，这样原来加液的五个步骤缩为两个步骤，也就减少了加液的误差和时间。试验表明，本法具有快速，简便，样品、试剂量少，重复性，直线性好，可以用于临床实验室的精液分析。
参考文献
1，Lampugnani L,Maccheroni M. Rapid colorimetry of zinc in seminal fluid. Clin Chem,1984,30(8):1366～1368.
2，王望九，产美英，李笑梅，等. 男性不育者精浆锌的微量比色法. 安徽医学，1996，17(1)：52～53，57.
, 百拇医药
3，World Health Organization. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge:Cambridge University Press,1992. 3～23,70～71.
4，Cooper TG,Jockcnhovel F,Nieschlag E. Variations in semen parameters from fathers. Hum Reprod,1991,6(6):859～863.
5，谢文英，王一飞，江 鱼. 男性学. 上海：上海科学技术出版社，1991. 152～153.
6，王望九，陈永华，汤明礼，等. 男性精浆α-糖苷酶微量检测的研究. 安徽中医学院学报，1995，14(3)：62～64.
7，王望九，陈永华，汤明礼，等. 男性生育及不育者精浆果糖微量检测的研究. 生殖医学杂志，1995，4(3)：171～172.
(收稿日期：1999-10-25), 百拇医药