淋球菌染色体mtrR基因突变对淋球菌多重耐药性的影响
作者：潘炜华 廖万清 李志刚
单位：200003上海，第二军医大学长征医院皮肤科
关键词：奈瑟氏球菌；淋病基因；mtrR微生物敏感性试验
中华皮肤科杂志990303
【摘要】目的 对淋球菌的染色体耐药机理进行了一定的探索。方法 聚合酶链反应及Sanger双脱氧链终止法，测定淋球菌mtrR基因的碱基序列，并做相应淋球菌的药敏试验。结果 具有青霉素耐药性的淋球菌毫无例外都有mtrR基因的单碱基突变，而耐壮观霉素的淋球菌在mtrR基因上有两个位点突变。结论 淋球菌染色体上mtrR基因的突变会引起淋球菌多重耐药性的产生，增加淋球菌对脂溶性细胞毒因子如脂溶性抗生素、去污剂类脂肪酸的抗性。
Effect of mtrR Gene Mutation on Multiple Antibiotic Resistance of Neisseria Gonorrhoeae
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PAN Weihua, LIAO Wanqing, LI Zhigang. Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of multiple antibiotic resistance of Neisseria gonorrhoeae chromosome. Methods The mtrR gene sequence of Neisseria gonorrhoeae was examined by polymerase chain reaction and Sanger′ s method, the drug susceptibility testing of relevant strains was done. Results Among 37 stains resistant to penicillin, 21 were resistant to tetracycline, erythromycin and Triton X 100 simultaneouely; one of them was resistant to spectinomycin as well; 5 strains were resistant to erythromycin only. All penicillin resistant strains had a single base mutation in mtrR gene, and spectinomycin resistant strain mutated in two position of mtrR gene. Conclusion The missense and null mutations in the mtrR gene of Neisseria gonorrhoeae resulted in the emergence of multiple antibiotic resistance.
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【Key words】 Neisseria gonorrhoeae genes,mtrR Microbial sensitivity tests
淋球菌产生耐药性的主要原因，是其细胞膜外泵蛋白即mtrCDE蛋白复合物合成量的增多，导致抗淋球菌细胞毒因子被排出细胞外[1]。除由质粒介导产生β内酰胺酶外[2]，淋球菌主要由染色体控制通过膜蛋白机制及膜通透性改变产生耐药性[1]，mtrR基因控制着mtrCDE蛋白的合成，因此我们从mtrR基因着手研究mtrCDE蛋白合成量增多的原因。
材料和方法
一、菌株
WHO标准株A、B、C、D、E株及临床分离株共46株。标准株由上海市性病防治中心及中国协和医科大学皮肤病研究所赠送，临床株由我院门诊患者及上海市性病防治中心门诊患者1992～1993分离所得。均用纸片酸度定量法鉴定为PPNG阴性菌株。
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二、主要试剂
测序试剂盒购自美国Promega公司，TaqDNA聚合酶由复旦大学遗传所提供，同位素γ32P-ATP购自北京亚辉生物工程公司，丙烯酰胺和NN′-亚甲双丙烯酰胺购自美国Sigma公司，低熔点胶购自Sigma公司。
三、主要仪器和设备
0.2mm10跑道电泳板及高压电泳仪购自美国BioRAD公司，480型及9600型DNA扩增仪购自美国PE公司。
四、方法
1.药敏测试用淋球菌快速定量药敏测试法[3]。另配200～6400μg/mL各浓度梯度的TritonX100溶液，分别测TritonX100对各菌株的MIC值。保存结果待用。
2.mtrR基因扩增所用引物参照Wubin等[1]设计的序列,由本校生化教研室合成。上游引物为：5′dATACATACACGATTGCACGG3′,下游引物为5′TTTGTGTCATTTTGATGCCG3′。使用该对引物预期扩增产物为630bP。总反应体积200μL，反应体系pH值8.0，引物各0.25μmol/L;1UTaqDNA聚合酶;模板5μL。反应条件为93℃预变性3min，93℃变性30s，62℃退火60s,共35个循环,72℃延伸5min结束。(以TBE作为整个实验的缓冲液)。
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3.DNA序列的检测:DNA扩增产物纯化后，按试剂盒说明书标记引物及进行测序反应。测序反应总体积22μL,反应条件为：94℃变性20s;60℃退火30s;70℃延伸40s;共30个循环。反应终止后每管中加入终止液3μL。凝胶灌制完毕待干后各跑道的4个梳齿孔内按A、C、G、T顺序分别加入3μL扩增产物,接高压电泳仪进行电泳。维持电压2000～2300V，温度50℃，功率120W,每轮电泳2h左右,上、下游各跑2轮电泳。电泳结束后用0.3mmWhatman滤纸将凝胶取下，取Saran包装膜放于胶上，根据膜胶同位素含量放入XRC-Ⅱ型X射线暗匣放射自显影24～72h读片。
图1正常mtrR序列(1)箭头处为45号氨基酸GGC
图2正常mtrR序列(2)箭头处为105号氨基酸CAC
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图3箭头处为45号氨基酸突变点GGC→GAC
图4箭头处为105号氨基酸突变点CAC→UAC
结果
46株淋球菌测得MIC[3],TritonX100对各菌株的MIC为:25株菌MIC≤3200μg/mL，21株菌MIC≥6400μg/mL。46株淋球菌均进行了mtrR基因的序列检测，标准株的mtrR基因序列见图1，2。药敏测得其中有37株淋球菌对青霉素耐药(MIC≥1μg/mL),该37株菌中有21株同时耐四环素(MIC≥1μg/mL)、红霉素(MIC≥1μg/mL)及TritonX100(MIC≥6400μg/mL)，37株中有5株淋球菌仅耐红霉素。有1株淋球菌在耐青霉素、红霉素、四环素、TritonX100的同时尚对壮观霉素耐药(MIC≥64μg/mL)，所有菌株均对头孢三嗪敏感。
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全部37株耐药淋球菌均发现有mtrR基因的突变，第45号氨基酸由甘氨酸突变成了天门冬氨酸(GGC→GAC)，见图3，有壮观霉素耐药性的那株菌除了有第45号氨基酸的突变外,还有第105号氨基酸的突变,由组氨酸突变成了酪氨酸(CACUAC),见图4。两组突变均为单碱基突变，整个mtrR基因的其它位点稳定。9株敏感菌无mtrR基因的突变。
讨论
淋球菌产生多重耐药性的基本原因之一，就是细菌能把药物有效地排出细胞外，而该外排过程是由细胞膜上脂蛋白在ATP酶催化下通过外泵作用完成的。该脂蛋白的过多表达与临床细菌耐药直接有关，其编码基因即mtr基因系统[4]。淋球菌能够对抗粪便中的脂类及胆盐的毒性而生存于特定的粘膜表面，就是因为其基因中有mtr系统(multipletransterableresistancesystem)的存在。mtr基因系统由mtrR基因和mtrCDE基因组成,mtrR基因控制mtrCDE的表达。mtrR编码1个含210个氨基酸的蛋白，该蛋白作为转录阻遏物结合于mtrRCDE基因上而影响它的转录。mtrCDE基因位于mtrR基因的下游，其编码的蛋白质存在于淋球菌的细胞膜上，该蛋白复合物能在ATP酶作用下通过外泵机制把药物泵出细胞外，其合成量的增减直接决定了淋球菌的耐药程度[1]。由于mtrR基因编码转录阻遏蛋白,如果mtrR基因有突变，将会导致阻遏蛋白阻遏作用减少或消失，使mtrR基因下游的mtrCDE基因转录开放,细胞膜脂蛋白中表达受其控制的mtrCDE蛋白复合物表达增多。过多的mtrCDE蛋白使外泵系统功能增强,细胞膜通透性降低,并增加对多种抗菌因子的抵抗力。
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本实验检测了淋球菌的mtrR基因的DNA序列，将其结果与该菌对脂溶性因子包括脂溶性抗生素、去污剂类脂肪酸(TritonX-100)的敏感性进行对照，寻找国内淋球菌产生染色体耐药的主要原因。本实验的46株菌株都较有针对性，它们中的70%来源于临床复发患者，曾用过青霉素、淋必治、强力霉素等药。实验发现，在β-内酰胺酶阴性的淋球菌菌株中，具有青霉素耐药性的菌株毫无例外都有mtrR基因的变异。在mtrR基因编码的210个氨基酸中,第45号氨基酸由甘氨酸突变成了天门冬氨酸(GGC→GAC)是造成淋球菌对青霉素、红霉素、四环素及去污剂类脂肪酸TritonX100抗性增高的主要原因。9株药物敏感菌无mtrR基因的突变，由于本实验样本较小，不能得出敏感菌都无mtrR基因突变的结论，但在一定程度上我们认为mtrR基因的突变与淋球菌多重耐药性密切相关。mtrR基因突变会导致耐药但并不一定出现多重耐药，因为37株耐药株中有10株仅对青霉素耐药。
唯一1株对壮观霉素耐药的淋球菌除了有第45号氨基酸的单碱基突变外，还有第105号氨基酸的突变，由组氨酸突变成了酪氨酸(CAC→UAC)，因此第105号氨基酸的突变可能使mtrR蛋白对mtrCDE基因的转录阻遏作用更小,淋球菌的耐药性进一步增强。mtrR基因的这些点突变导致mtrCDE基因转录的阻遏开放，mtrCDE蛋白表达量增多，淋球菌细胞膜外泵蛋白作用增强，使抗生素等细胞毒性因子在细胞内浓度降低，是淋球菌产生多重耐药性的主要原因。mtr系统即多传递耐药系统控制着淋球菌对脂溶性因子的敏感性，通过mtrCDE蛋白复合物形成的外泵系统，拮抗那些经过淋球菌细胞膜表面的结构各异的抗生素、脂肪酸和胆盐[5]。
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参考文献
1 Wubin P,Brian GS.Regulation of the permeability of the gonococcal cell envelope by the mtr system.Mol Microbiol, 1994,11:769- 775.
2 潘炜华，廖万清，李志刚.淋球菌快速定量药敏测试法的建立.第二军医大学学报，1998，19：387-388.
3 Judd RC,Strange JC,Pettit RK.Identification and characterization of a conserved outer membrane of Neisseria gonorrhoeae.Mol Microbiol,1991,5:1091- 1096.
4 Alexander AN,Vladimir EB,Lan BC.Efflux mediated multidrug resistance in bacillus subtilis:similarities and dissimilarities with the mammalian system.Biochemistry, 1991,88:4781- 4785.
5 Kayla EH,Wubin P,Brianb G,et al.Resistance of Neisseria gonorrhoeae to antimicrobial hydrophobic agents is modulated by the mtrRCDE efflux system.Microbiol, 1995,141:611- 622.
(收稿：1998-06-29修回：1998-11-09), 百拇医药
单位：200003上海，第二军医大学长征医院皮肤科
关键词：奈瑟氏球菌；淋病基因；mtrR微生物敏感性试验
中华皮肤科杂志990303
【摘要】目的 对淋球菌的染色体耐药机理进行了一定的探索。方法 聚合酶链反应及Sanger双脱氧链终止法，测定淋球菌mtrR基因的碱基序列，并做相应淋球菌的药敏试验。结果 具有青霉素耐药性的淋球菌毫无例外都有mtrR基因的单碱基突变，而耐壮观霉素的淋球菌在mtrR基因上有两个位点突变。结论 淋球菌染色体上mtrR基因的突变会引起淋球菌多重耐药性的产生，增加淋球菌对脂溶性细胞毒因子如脂溶性抗生素、去污剂类脂肪酸的抗性。
Effect of mtrR Gene Mutation on Multiple Antibiotic Resistance of Neisseria Gonorrhoeae
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PAN Weihua, LIAO Wanqing, LI Zhigang. Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Shanghai 200003
【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of multiple antibiotic resistance of Neisseria gonorrhoeae chromosome. Methods The mtrR gene sequence of Neisseria gonorrhoeae was examined by polymerase chain reaction and Sanger′ s method, the drug susceptibility testing of relevant strains was done. Results Among 37 stains resistant to penicillin, 21 were resistant to tetracycline, erythromycin and Triton X 100 simultaneouely; one of them was resistant to spectinomycin as well; 5 strains were resistant to erythromycin only. All penicillin resistant strains had a single base mutation in mtrR gene, and spectinomycin resistant strain mutated in two position of mtrR gene. Conclusion The missense and null mutations in the mtrR gene of Neisseria gonorrhoeae resulted in the emergence of multiple antibiotic resistance.
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【Key words】 Neisseria gonorrhoeae genes,mtrR Microbial sensitivity tests
淋球菌产生耐药性的主要原因，是其细胞膜外泵蛋白即mtrCDE蛋白复合物合成量的增多，导致抗淋球菌细胞毒因子被排出细胞外[1]。除由质粒介导产生β内酰胺酶外[2]，淋球菌主要由染色体控制通过膜蛋白机制及膜通透性改变产生耐药性[1]，mtrR基因控制着mtrCDE蛋白的合成，因此我们从mtrR基因着手研究mtrCDE蛋白合成量增多的原因。
材料和方法
一、菌株
WHO标准株A、B、C、D、E株及临床分离株共46株。标准株由上海市性病防治中心及中国协和医科大学皮肤病研究所赠送，临床株由我院门诊患者及上海市性病防治中心门诊患者1992～1993分离所得。均用纸片酸度定量法鉴定为PPNG阴性菌株。
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二、主要试剂
测序试剂盒购自美国Promega公司，TaqDNA聚合酶由复旦大学遗传所提供，同位素γ32P-ATP购自北京亚辉生物工程公司，丙烯酰胺和NN′-亚甲双丙烯酰胺购自美国Sigma公司，低熔点胶购自Sigma公司。
三、主要仪器和设备
0.2mm10跑道电泳板及高压电泳仪购自美国BioRAD公司，480型及9600型DNA扩增仪购自美国PE公司。
四、方法
1.药敏测试用淋球菌快速定量药敏测试法[3]。另配200～6400μg/mL各浓度梯度的TritonX100溶液，分别测TritonX100对各菌株的MIC值。保存结果待用。
2.mtrR基因扩增所用引物参照Wubin等[1]设计的序列,由本校生化教研室合成。上游引物为：5′dATACATACACGATTGCACGG3′,下游引物为5′TTTGTGTCATTTTGATGCCG3′。使用该对引物预期扩增产物为630bP。总反应体积200μL，反应体系pH值8.0，引物各0.25μmol/L;1UTaqDNA聚合酶;模板5μL。反应条件为93℃预变性3min，93℃变性30s，62℃退火60s,共35个循环,72℃延伸5min结束。(以TBE作为整个实验的缓冲液)。
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3.DNA序列的检测:DNA扩增产物纯化后，按试剂盒说明书标记引物及进行测序反应。测序反应总体积22μL,反应条件为：94℃变性20s;60℃退火30s;70℃延伸40s;共30个循环。反应终止后每管中加入终止液3μL。凝胶灌制完毕待干后各跑道的4个梳齿孔内按A、C、G、T顺序分别加入3μL扩增产物,接高压电泳仪进行电泳。维持电压2000～2300V，温度50℃，功率120W,每轮电泳2h左右,上、下游各跑2轮电泳。电泳结束后用0.3mmWhatman滤纸将凝胶取下，取Saran包装膜放于胶上，根据膜胶同位素含量放入XRC-Ⅱ型X射线暗匣放射自显影24～72h读片。
图1正常mtrR序列(1)箭头处为45号氨基酸GGC
图2正常mtrR序列(2)箭头处为105号氨基酸CAC
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图3箭头处为45号氨基酸突变点GGC→GAC
图4箭头处为105号氨基酸突变点CAC→UAC
结果
46株淋球菌测得MIC[3],TritonX100对各菌株的MIC为:25株菌MIC≤3200μg/mL，21株菌MIC≥6400μg/mL。46株淋球菌均进行了mtrR基因的序列检测，标准株的mtrR基因序列见图1，2。药敏测得其中有37株淋球菌对青霉素耐药(MIC≥1μg/mL),该37株菌中有21株同时耐四环素(MIC≥1μg/mL)、红霉素(MIC≥1μg/mL)及TritonX100(MIC≥6400μg/mL)，37株中有5株淋球菌仅耐红霉素。有1株淋球菌在耐青霉素、红霉素、四环素、TritonX100的同时尚对壮观霉素耐药(MIC≥64μg/mL)，所有菌株均对头孢三嗪敏感。
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全部37株耐药淋球菌均发现有mtrR基因的突变，第45号氨基酸由甘氨酸突变成了天门冬氨酸(GGC→GAC)，见图3，有壮观霉素耐药性的那株菌除了有第45号氨基酸的突变外,还有第105号氨基酸的突变,由组氨酸突变成了酪氨酸(CACUAC),见图4。两组突变均为单碱基突变，整个mtrR基因的其它位点稳定。9株敏感菌无mtrR基因的突变。
讨论
淋球菌产生多重耐药性的基本原因之一，就是细菌能把药物有效地排出细胞外，而该外排过程是由细胞膜上脂蛋白在ATP酶催化下通过外泵作用完成的。该脂蛋白的过多表达与临床细菌耐药直接有关，其编码基因即mtr基因系统[4]。淋球菌能够对抗粪便中的脂类及胆盐的毒性而生存于特定的粘膜表面，就是因为其基因中有mtr系统(multipletransterableresistancesystem)的存在。mtr基因系统由mtrR基因和mtrCDE基因组成,mtrR基因控制mtrCDE的表达。mtrR编码1个含210个氨基酸的蛋白，该蛋白作为转录阻遏物结合于mtrRCDE基因上而影响它的转录。mtrCDE基因位于mtrR基因的下游，其编码的蛋白质存在于淋球菌的细胞膜上，该蛋白复合物能在ATP酶作用下通过外泵机制把药物泵出细胞外，其合成量的增减直接决定了淋球菌的耐药程度[1]。由于mtrR基因编码转录阻遏蛋白,如果mtrR基因有突变，将会导致阻遏蛋白阻遏作用减少或消失，使mtrR基因下游的mtrCDE基因转录开放,细胞膜脂蛋白中表达受其控制的mtrCDE蛋白复合物表达增多。过多的mtrCDE蛋白使外泵系统功能增强,细胞膜通透性降低,并增加对多种抗菌因子的抵抗力。
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本实验检测了淋球菌的mtrR基因的DNA序列，将其结果与该菌对脂溶性因子包括脂溶性抗生素、去污剂类脂肪酸(TritonX-100)的敏感性进行对照，寻找国内淋球菌产生染色体耐药的主要原因。本实验的46株菌株都较有针对性，它们中的70%来源于临床复发患者，曾用过青霉素、淋必治、强力霉素等药。实验发现，在β-内酰胺酶阴性的淋球菌菌株中，具有青霉素耐药性的菌株毫无例外都有mtrR基因的变异。在mtrR基因编码的210个氨基酸中,第45号氨基酸由甘氨酸突变成了天门冬氨酸(GGC→GAC)是造成淋球菌对青霉素、红霉素、四环素及去污剂类脂肪酸TritonX100抗性增高的主要原因。9株药物敏感菌无mtrR基因的突变，由于本实验样本较小，不能得出敏感菌都无mtrR基因突变的结论，但在一定程度上我们认为mtrR基因的突变与淋球菌多重耐药性密切相关。mtrR基因突变会导致耐药但并不一定出现多重耐药，因为37株耐药株中有10株仅对青霉素耐药。
唯一1株对壮观霉素耐药的淋球菌除了有第45号氨基酸的单碱基突变外，还有第105号氨基酸的突变，由组氨酸突变成了酪氨酸(CAC→UAC)，因此第105号氨基酸的突变可能使mtrR蛋白对mtrCDE基因的转录阻遏作用更小,淋球菌的耐药性进一步增强。mtrR基因的这些点突变导致mtrCDE基因转录的阻遏开放，mtrCDE蛋白表达量增多，淋球菌细胞膜外泵蛋白作用增强，使抗生素等细胞毒性因子在细胞内浓度降低，是淋球菌产生多重耐药性的主要原因。mtr系统即多传递耐药系统控制着淋球菌对脂溶性因子的敏感性，通过mtrCDE蛋白复合物形成的外泵系统，拮抗那些经过淋球菌细胞膜表面的结构各异的抗生素、脂肪酸和胆盐[5]。
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参考文献
1 Wubin P,Brian GS.Regulation of the permeability of the gonococcal cell envelope by the mtr system.Mol Microbiol, 1994,11:769- 775.
2 潘炜华，廖万清，李志刚.淋球菌快速定量药敏测试法的建立.第二军医大学学报，1998，19：387-388.
3 Judd RC,Strange JC,Pettit RK.Identification and characterization of a conserved outer membrane of Neisseria gonorrhoeae.Mol Microbiol,1991,5:1091- 1096.
4 Alexander AN,Vladimir EB,Lan BC.Efflux mediated multidrug resistance in bacillus subtilis:similarities and dissimilarities with the mammalian system.Biochemistry, 1991,88:4781- 4785.
5 Kayla EH,Wubin P,Brianb G,et al.Resistance of Neisseria gonorrhoeae to antimicrobial hydrophobic agents is modulated by the mtrRCDE efflux system.Microbiol, 1995,141:611- 622.
(收稿：1998-06-29修回：1998-11-09), 百拇医药