一种可用于治疗苯丙酮尿症的工程菌株的建立
作者：蔡朱男 余应年 罗建红 钱羽力 陈星若 袁丽芳
单位：浙江大学医学院病理生理教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010179
目的：通过基因重组建立高效表达有活性的PAL菌株，为开创苯丙酮尿症的新疗法奠定基础。方法：对已克隆于pUC19质粒中的水稻苯丙氨酸氨解酶的cDNA进行反向测序，根据测序结果，与pET28系列质粒中的阅读框架结构进行比较，选择相匹配的pET28c质粒作为表达载体，用EcoRⅠ分别切开质粒pUC19-rPAL-1-cDNA和pET28c，切下的2.5 kb rPAL-1-cDNA通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，透析袋回收，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，纯化后溶于双蒸水备用。用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)切去线性pET28c 5′端磷酸。然后用T4DNA连接酶将2.5 kb rPAL-1-cDNA与5′端脱磷酸之线性pET28c连接重组成表达质粒，随后将其转化入大肠杆菌BL21DE3，在含有卡那霉素的LB平板上，筛选出阳性克隆。采用BamHⅠ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分析，初步确定插入方向，进一步通过序列测定，筛选出正向插入所需目的基因的重组表达质粒。挑取正向插入克隆，扩增培养后，用1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h，超声破菌后，在低分子量蛋白标准的参照下，通过聚丙酰胺凝胶电泳，分析建立的工程菌BL21DE3pET28c-rPAL-1-cDNA能否高效表达水稻苯丙氨酸解酶。将BL21DE3pET28c及BL21DE3pET28c-rPAL-1-cDNA分别扩增诱导超声粗提，按Zucker法测定酶活性。酶反应系统构成：100 mmol/L pH8.7 硼酸缓冲液1 mL，加或不加100 mmol/L苯丙氨酸0.5 mL，不同浓度超声粗提物0.5 mL，双蒸水补至3 mL，37℃水浴，振荡175次/min，，反应1 h，加入0.5 mL 24%三氯醋酸终止反应，243 000×g 4℃离心15 min，取上清液，使用日立U-2000分光光度计，在290 nm下测定产物苯丙烯酸的吸光度，作图显示剂量效应关系。进一步作不同浓度底物L-苯丙氨酸对反应速度影响试验，以不同浓度底物的倒数(1/S)作横坐标，酶反应速度的倒数(1/V)为纵坐标作图，根据米氏方程求出酶的Km值和最大反应速度Vmax。结果：正向插入2.5 kb rPAL-1-cDNA重组表达质粒构建成功，大肠杆菌菌株BLHDE3pET28c-rPAL-1-cDNA表达融合蛋白His6-rPAL分子量为78.6 kD，表达量高达35.4%。超声粗提酶存在明显的剂量效应关系，相关系数为0.993，比活性为461.7 nmol/g.min-1，Km=0.50 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.05 nmol/min。结论：可用于治疗苯丙酮尿症的高效表达有活性PAL的工程菌株已建立。
浙江省自然科学基金资助(No 397463), 百拇医药
单位：浙江大学医学院病理生理教研室，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010179
目的：通过基因重组建立高效表达有活性的PAL菌株，为开创苯丙酮尿症的新疗法奠定基础。方法：对已克隆于pUC19质粒中的水稻苯丙氨酸氨解酶的cDNA进行反向测序，根据测序结果，与pET28系列质粒中的阅读框架结构进行比较，选择相匹配的pET28c质粒作为表达载体，用EcoRⅠ分别切开质粒pUC19-rPAL-1-cDNA和pET28c，切下的2.5 kb rPAL-1-cDNA通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，透析袋回收，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，纯化后溶于双蒸水备用。用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)切去线性pET28c 5′端磷酸。然后用T4DNA连接酶将2.5 kb rPAL-1-cDNA与5′端脱磷酸之线性pET28c连接重组成表达质粒，随后将其转化入大肠杆菌BL21DE3，在含有卡那霉素的LB平板上，筛选出阳性克隆。采用BamHⅠ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分析，初步确定插入方向，进一步通过序列测定，筛选出正向插入所需目的基因的重组表达质粒。挑取正向插入克隆，扩增培养后，用1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h，超声破菌后，在低分子量蛋白标准的参照下，通过聚丙酰胺凝胶电泳，分析建立的工程菌BL21DE3pET28c-rPAL-1-cDNA能否高效表达水稻苯丙氨酸解酶。将BL21DE3pET28c及BL21DE3pET28c-rPAL-1-cDNA分别扩增诱导超声粗提，按Zucker法测定酶活性。酶反应系统构成：100 mmol/L pH8.7 硼酸缓冲液1 mL，加或不加100 mmol/L苯丙氨酸0.5 mL，不同浓度超声粗提物0.5 mL，双蒸水补至3 mL，37℃水浴，振荡175次/min，，反应1 h，加入0.5 mL 24%三氯醋酸终止反应，243 000×g 4℃离心15 min，取上清液，使用日立U-2000分光光度计，在290 nm下测定产物苯丙烯酸的吸光度，作图显示剂量效应关系。进一步作不同浓度底物L-苯丙氨酸对反应速度影响试验，以不同浓度底物的倒数(1/S)作横坐标，酶反应速度的倒数(1/V)为纵坐标作图，根据米氏方程求出酶的Km值和最大反应速度Vmax。结果：正向插入2.5 kb rPAL-1-cDNA重组表达质粒构建成功，大肠杆菌菌株BLHDE3pET28c-rPAL-1-cDNA表达融合蛋白His6-rPAL分子量为78.6 kD，表达量高达35.4%。超声粗提酶存在明显的剂量效应关系，相关系数为0.993，比活性为461.7 nmol/g.min-1，Km=0.50 mmol/L,最大反应速度Vmax=3.05 nmol/min。结论：可用于治疗苯丙酮尿症的高效表达有活性PAL的工程菌株已建立。
浙江省自然科学基金资助(No 397463), 百拇医药