rhBMP-2对人牙周膜细胞骨桥蛋白表达的影响
作者：刘宏 王勤涛 吴织芬 周斌
单位：刘宏(西安，第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科 710032)；王勤涛(西安，第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科 710032)；吴织芬(西安，第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科 710032)；周斌(第二军医大学药学院药理教研室)
关键词：骨形成蛋白；牙周膜细胞；骨桥蛋白
中华口腔医学杂志000503 【摘要】 目的 深入了解牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLC)的成骨样细胞特性，以及非胶原蛋白在牙周组织矿化中的作用。方法 在体外培养条件下，观察重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)作用前后是否对矿化相关蛋白之一的骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在人PDLC中的存在及表达情况产生影响。在小玻片上培养第5代PDLC，分为加rhBMP-2(50 μg/L)刺激的实验组和不加任何因子的空白对照组，以地高辛标记的OPN cDNA探针，采用原位杂交技术对PDLC中OPN的表达情况进行检测；同时做PBS替代探针和RNA酶预处理的方法学对照。结果 对照组、替代对照和RNA酶预处理的PDLC均显示为阴性反应， 没有显示出OPN的阳性表达信号；实验组PDLC的胞浆中可见明显的OPN阳性反应，表达信号较强。结论 rhBMP-2的刺激作用可使PDLC表达出较强的OPN阳性信号；表明在一定条件和外界因子的诱导下，PDLC具有向成骨特性方向转变的潜能，对牙周组织再生有促进效应。
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Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on the expression of osteopontin in human periodontal ligament cells
LIU Hong , WANG Qintao, WU Zhifen, et al.
(Department of Periodontology and Oral Medicine，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of growth factor rhBMP-2 on the expression of osteopontin in periodontal ligament cells(PDLC). Methods In culture model of human PDLC, in situ hybridization method was used to detect the expression of osteopontin in human PDLC. Results The PDLC showed negative reaction to express osteopontin, while those PDLC stimulated by rhBMP-2 showed osteopontin mRNA positive reaction in plasm. Conclusion rhBMP-2 can induce the expression of osteopontin in PDLC. rhBMP-2 may be an effective growth factor in stimulating PDLC differentiation to osteoblast and promote periodontal regeneration.
, 百拇医药
【Key words】 Bone morphogenetic protein ； Periodontal ligament cells； Osteopontin
牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLC)具有组成的复杂性以及功能的多样性，很多研究均已表明PDLC具有成骨样细胞的特性[1-3]。成骨细胞表型标记除传统的碱性磷酸酶活性较高、甲状旁腺激素刺激下cAMP产生增加、1,25(OH)2-VD3刺激下骨钙素产生增加外，随着生物化学研究的深入，骨组织显示了与其他结缔组织不同的独特的组成成分：非胶原蛋白[4]。非胶原蛋白包括：骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨粘连素、骨钙素、骨涎蛋白等。我们采用原位杂交的方法，研究体外培养的人PDLC中矿化相关非胶原蛋白之一OPN的表达，以及生长因子刺激作用下对其表达的影响，以期探讨生长因子用于牙周组织再生过程中对骨形成的调节机理。
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材料和方法
1.材料：体外培养的人 PDLC，DIG标记试剂盒(Boehringer Mamhein，German),24孔培养板(Nunlcon, Denmark),OPN cDNA探针(Marian T Young, National Institute of Dental Research, NIH), 胎牛血清(fetal calf serum, FCS)。
2.分组：对照组：2%FCS的DMEM培养液培养的PDLC；实验组：2%FCS的DMEM培养液培养的PDLC另加rhBMP-2，浓度为50 μg/L。空白对照：以PBS替代探针；阴性对照：以RNA酶预处理玻片。
3.细胞培养方法：取生长良好的第5代人PDLC，以浓度3×107/L接种于24孔板，孔底预先放置10 mm×10 mm盖玻片，每孔1 ml, 含15%FCS的DMEM培养24 h，弃孔内液体及未贴壁细胞，无血清培养液洗3次。分实验组和对照组继续培养5 d，取出细胞玻片，乙醇、乙酸按3：1的体积比固定15 min，95%乙醇固定5 min，室温干燥，密封，-20℃保存备用。
, 百拇医药
4.探针标记：采用随机引物延伸法，DIG标记的dUTP掺入到OPN探针上形成OPN cDNA探针。
5.原位杂交：取实验组和对照组玻片，同时标本设略去探针的空白对照和RNA酶消化的阴性对照，原位杂交法显示OPN的表达。本实验重复3次。
结果
1.对照组PDLC呈阴性反应，胞浆及胞核均无OPN阳性表达信号。
2.经生长因子rhBMP-2刺激5 d后，实验组PDLC的胞浆中可见明显的OPN蓝色阳性反应，出现较强的表达信号，而胞核不染色。
3.空白对照和RNA酶预处理的PDLC均为阴性反应，无阳性表达信号出现。说明实验组的阳性表达信号为特异性反应的结果。
讨论
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OPN是一种分泌型糖基化磷蛋白[5，6]，最早在骨组织中发现[7]，是一种主要的非胶原蛋白，约占骨基质成分的2%。研究显示，矿化前成熟的成骨细胞可表达OPN及其他非胶原蛋白：碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白等[8]。
基因序列分析显示，OPN含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的细胞粘附序列，因而是对很多细胞有粘附能力的粘附分子；能结合于细胞表面和骨组织的羟基磷灰石表面，介导细胞与细胞、细胞与基质的相互作用；而且这种粘附能力可能与纤维粘连素、Ⅰ型胶原、骨钙素相关。OPN的产生随不同的时间阶段而变化，在骨形成早期的增殖阶段以及矿化前或矿化发生时均有出现。它的主要功能是：①通过其RGD序列结合于细胞表面，从而介导细胞-细胞、细胞-基质的相互作用；②通过富含天冬氨酸的序列而结合于骨的羟基磷灰石基质，刺激骨的矿化。在成骨细胞及牙本质、牙骨质中均可见OPN的存在；前成骨细胞可合成55 000的低磷酸化蛋白，可能与骨基质形成有关；而成骨细胞可合成44 000的高磷酸化蛋白，能调节羟基磷灰石晶体生长。因此，OPN被认为是成骨细胞分化成熟的标志。
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D′errioco等[9]用免疫细胞化学及原位杂交技术证实OPN是牙骨质的主要成分之一，可由邻近的成牙骨质细胞分泌。在牙骨质形成过程中OPN位于牙根表面，而且可出现在整个牙周膜区[10]。从牙石中也发现两种OPN(61 000和68 000)[11]，且龈下牙石比龈上牙石含量大，边缘区较中心区多。因此，OPN被认为是一种与骨形成密切相关的矿化相关蛋白，有文献报道矿化颗粒中的主要矿化基质蛋白为OPN和BSP，OPN以67 000为主[12]。
新鲜分离的PDLC可表达OPN，但经过培养传代后PDLC 的OPN表达减少5.3倍；在含维生素C、β-甘油磷酸钠和氟美的培养条件下，牙周膜细胞可合成两种形式的OPN(61 000、67 000)[13]。据Chen等[14]报道，成骨细胞经过连续培养17 d，其中加BMP-2刺激后第5 天 OPN表达最高，而未加刺激至第7 天才达到最高。提示BMP-2在骨形成中可刺激未分化间充质细胞分化为成骨细胞，其在矿化过程中的作用可能与矿化相关蛋白的表达有关。
, 百拇医药
作者采用原位杂交的方法，观察到第5代人PDLC经过5 d培养，未见OPN的表达；但经BMP-2刺激后，部分细胞出现较强的OPN阳性表达信号，与Chen等[14]的结果具有某些一致性。本实验中未加BMP-2作用的对照组未出现OPN的阳性表达，这可能与培养时间的长短、标本采集的个体差异、细胞本身的特性(牙周膜细胞而非成骨细胞)等有关；经BMP-2作用后的PDLC则出现了OPN的较强阳性表达；从一个侧面表明PDLC具有向成骨特性方向转变的潜能，但需要在一定条件和外界因子的作用诱导下才能发生；这在调节细胞的粘附、迁移、分化、细胞外基质的产生和矿化等方面将发挥一定的作用。提示应进一步对PDLC的生物学特性、尤其是在某些生长因子的诱导调控下发生的定向性转化做多方位的综合研究、评价，以达到能选择性调节PDLC的粘附、迁移、分化、增殖等功能，这将对牙周组织尤其是骨和牙骨质的再生具有重大的现实意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700035)
, 百拇医药
参考文献
1，Somerman MJ, Young MF, Foster RA, et al. Characteristics of human periodontal ligament cells in vitro. Arch Oral Biol , 1990,35:241-247.
2，Carnes DL, Maeder CL , Graves DT. Cells with osteoblastic phenotypes can be explanted from human gingiva and periodontal ligament. J Periodontal, 1997, 68:701-707.
3，Somerman MJ, Archer SY, Imm GR, et al. A comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro. J Dent Res, 1988, 67:66-70.
, 百拇医药
4，Young MF, Kerr JM, Ibaraki K, et al. Structure, expression and regulation of the major noncollagenous matrix proteins of bone. Clin Orthop , 1992, 281:275-294.
5，Denhardt DT , Guo X. Osteopontin: a protein with diverse functions. FASEB J , 1993,7:1 475-1 482.
6，Uede T, Katagiri Y, Iizuka J, et al. Osteopontin, a coordinator of host defense system: a cytokine or an extracellular adhesive protein? Microbiol Immunol ,1997,41:641-648.
, 百拇医药
7，Robey PG. Biochemistry of bone. In: Riggs BK ,Melton Ⅲ LJ, eds. Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. 2nd ed. Philadelphia: Mayo Foundation, 1995. 41-66.
8，Liu F, Malaval L, Aubin JE. The mature osteoblast phenotype is characterized by extensive plasticity. Exp Cell Res , 1997, 232:97-105.
9，D′errioco JA, MacNeil RL, Takata, et al. Expression of bone associated marker by tooth root lining cells, in situ and in vitro. Bone , 1997,20:117-126.
, 百拇医药
10，MacNeil RL, Berry J, D′Errico J, et al. Localization and expression of osteopontin in mineralized and nonmineralized tissues of the periodontium. Ann N Y Acad Sci, 1995, 760:166-176.
11，Kido J, Kasahara C, Ohishi K, et al. Identification of osteopontin in human dental calculus matrix. Arch Oral Biol ,1995, 40:967-972.
12，Ramakrishnan PR, Lin WL, Sodek J, et al . Synthesis of noncollagenous extracellular matrix proteins during development of mineralized nodules by rat periodontal ligament cells in vitro. Calcif Tissue Int , 1995,57:52-59.
, 百拇医药
13，Nohutcu RM, McCauley LK, Shigeyama Y, et al. Expression of mineral-associated proteins by periodontal ligament cells: in vitro vs. ex vivo. J Periodontal Res, 1996,31:369-372.
14，Chen D, Harris A, Rossini G, et al. Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) enhances BMP-3, BMP-4, and bone cell differentiation marker gene expression during the induction of mineralized bone matrix formation in cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. Calcif Tissue Int , 1997,60:283-290.
(收稿日期：1999-12-17), http://www.100md.com
单位：刘宏(西安，第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科 710032)；王勤涛(西安，第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科 710032)；吴织芬(西安，第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科 710032)；周斌(第二军医大学药学院药理教研室)
关键词：骨形成蛋白；牙周膜细胞；骨桥蛋白
中华口腔医学杂志000503 【摘要】 目的 深入了解牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLC)的成骨样细胞特性，以及非胶原蛋白在牙周组织矿化中的作用。方法 在体外培养条件下，观察重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)作用前后是否对矿化相关蛋白之一的骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在人PDLC中的存在及表达情况产生影响。在小玻片上培养第5代PDLC，分为加rhBMP-2(50 μg/L)刺激的实验组和不加任何因子的空白对照组，以地高辛标记的OPN cDNA探针，采用原位杂交技术对PDLC中OPN的表达情况进行检测；同时做PBS替代探针和RNA酶预处理的方法学对照。结果 对照组、替代对照和RNA酶预处理的PDLC均显示为阴性反应， 没有显示出OPN的阳性表达信号；实验组PDLC的胞浆中可见明显的OPN阳性反应，表达信号较强。结论 rhBMP-2的刺激作用可使PDLC表达出较强的OPN阳性信号；表明在一定条件和外界因子的诱导下，PDLC具有向成骨特性方向转变的潜能，对牙周组织再生有促进效应。
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Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on the expression of osteopontin in human periodontal ligament cells
LIU Hong , WANG Qintao, WU Zhifen, et al.
(Department of Periodontology and Oral Medicine，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of growth factor rhBMP-2 on the expression of osteopontin in periodontal ligament cells(PDLC). Methods In culture model of human PDLC, in situ hybridization method was used to detect the expression of osteopontin in human PDLC. Results The PDLC showed negative reaction to express osteopontin, while those PDLC stimulated by rhBMP-2 showed osteopontin mRNA positive reaction in plasm. Conclusion rhBMP-2 can induce the expression of osteopontin in PDLC. rhBMP-2 may be an effective growth factor in stimulating PDLC differentiation to osteoblast and promote periodontal regeneration.
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【Key words】 Bone morphogenetic protein ； Periodontal ligament cells； Osteopontin
牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLC)具有组成的复杂性以及功能的多样性，很多研究均已表明PDLC具有成骨样细胞的特性[1-3]。成骨细胞表型标记除传统的碱性磷酸酶活性较高、甲状旁腺激素刺激下cAMP产生增加、1,25(OH)2-VD3刺激下骨钙素产生增加外，随着生物化学研究的深入，骨组织显示了与其他结缔组织不同的独特的组成成分：非胶原蛋白[4]。非胶原蛋白包括：骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨粘连素、骨钙素、骨涎蛋白等。我们采用原位杂交的方法，研究体外培养的人PDLC中矿化相关非胶原蛋白之一OPN的表达，以及生长因子刺激作用下对其表达的影响，以期探讨生长因子用于牙周组织再生过程中对骨形成的调节机理。
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材料和方法
1.材料：体外培养的人 PDLC，DIG标记试剂盒(Boehringer Mamhein，German),24孔培养板(Nunlcon, Denmark),OPN cDNA探针(Marian T Young, National Institute of Dental Research, NIH), 胎牛血清(fetal calf serum, FCS)。
2.分组：对照组：2%FCS的DMEM培养液培养的PDLC；实验组：2%FCS的DMEM培养液培养的PDLC另加rhBMP-2，浓度为50 μg/L。空白对照：以PBS替代探针；阴性对照：以RNA酶预处理玻片。
3.细胞培养方法：取生长良好的第5代人PDLC，以浓度3×107/L接种于24孔板，孔底预先放置10 mm×10 mm盖玻片，每孔1 ml, 含15%FCS的DMEM培养24 h，弃孔内液体及未贴壁细胞，无血清培养液洗3次。分实验组和对照组继续培养5 d，取出细胞玻片，乙醇、乙酸按3：1的体积比固定15 min，95%乙醇固定5 min，室温干燥，密封，-20℃保存备用。
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4.探针标记：采用随机引物延伸法，DIG标记的dUTP掺入到OPN探针上形成OPN cDNA探针。
5.原位杂交：取实验组和对照组玻片，同时标本设略去探针的空白对照和RNA酶消化的阴性对照，原位杂交法显示OPN的表达。本实验重复3次。
结果
1.对照组PDLC呈阴性反应，胞浆及胞核均无OPN阳性表达信号。
2.经生长因子rhBMP-2刺激5 d后，实验组PDLC的胞浆中可见明显的OPN蓝色阳性反应，出现较强的表达信号，而胞核不染色。
3.空白对照和RNA酶预处理的PDLC均为阴性反应，无阳性表达信号出现。说明实验组的阳性表达信号为特异性反应的结果。
讨论
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OPN是一种分泌型糖基化磷蛋白[5，6]，最早在骨组织中发现[7]，是一种主要的非胶原蛋白，约占骨基质成分的2%。研究显示，矿化前成熟的成骨细胞可表达OPN及其他非胶原蛋白：碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白等[8]。
基因序列分析显示，OPN含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的细胞粘附序列，因而是对很多细胞有粘附能力的粘附分子；能结合于细胞表面和骨组织的羟基磷灰石表面，介导细胞与细胞、细胞与基质的相互作用；而且这种粘附能力可能与纤维粘连素、Ⅰ型胶原、骨钙素相关。OPN的产生随不同的时间阶段而变化，在骨形成早期的增殖阶段以及矿化前或矿化发生时均有出现。它的主要功能是：①通过其RGD序列结合于细胞表面，从而介导细胞-细胞、细胞-基质的相互作用；②通过富含天冬氨酸的序列而结合于骨的羟基磷灰石基质，刺激骨的矿化。在成骨细胞及牙本质、牙骨质中均可见OPN的存在；前成骨细胞可合成55 000的低磷酸化蛋白，可能与骨基质形成有关；而成骨细胞可合成44 000的高磷酸化蛋白，能调节羟基磷灰石晶体生长。因此，OPN被认为是成骨细胞分化成熟的标志。
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D′errioco等[9]用免疫细胞化学及原位杂交技术证实OPN是牙骨质的主要成分之一，可由邻近的成牙骨质细胞分泌。在牙骨质形成过程中OPN位于牙根表面，而且可出现在整个牙周膜区[10]。从牙石中也发现两种OPN(61 000和68 000)[11]，且龈下牙石比龈上牙石含量大，边缘区较中心区多。因此，OPN被认为是一种与骨形成密切相关的矿化相关蛋白，有文献报道矿化颗粒中的主要矿化基质蛋白为OPN和BSP，OPN以67 000为主[12]。
新鲜分离的PDLC可表达OPN，但经过培养传代后PDLC 的OPN表达减少5.3倍；在含维生素C、β-甘油磷酸钠和氟美的培养条件下，牙周膜细胞可合成两种形式的OPN(61 000、67 000)[13]。据Chen等[14]报道，成骨细胞经过连续培养17 d，其中加BMP-2刺激后第5 天 OPN表达最高，而未加刺激至第7 天才达到最高。提示BMP-2在骨形成中可刺激未分化间充质细胞分化为成骨细胞，其在矿化过程中的作用可能与矿化相关蛋白的表达有关。
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作者采用原位杂交的方法，观察到第5代人PDLC经过5 d培养，未见OPN的表达；但经BMP-2刺激后，部分细胞出现较强的OPN阳性表达信号，与Chen等[14]的结果具有某些一致性。本实验中未加BMP-2作用的对照组未出现OPN的阳性表达，这可能与培养时间的长短、标本采集的个体差异、细胞本身的特性(牙周膜细胞而非成骨细胞)等有关；经BMP-2作用后的PDLC则出现了OPN的较强阳性表达；从一个侧面表明PDLC具有向成骨特性方向转变的潜能，但需要在一定条件和外界因子的作用诱导下才能发生；这在调节细胞的粘附、迁移、分化、细胞外基质的产生和矿化等方面将发挥一定的作用。提示应进一步对PDLC的生物学特性、尤其是在某些生长因子的诱导调控下发生的定向性转化做多方位的综合研究、评价，以达到能选择性调节PDLC的粘附、迁移、分化、增殖等功能，这将对牙周组织尤其是骨和牙骨质的再生具有重大的现实意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700035)
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参考文献
1，Somerman MJ, Young MF, Foster RA, et al. Characteristics of human periodontal ligament cells in vitro. Arch Oral Biol , 1990,35:241-247.
2，Carnes DL, Maeder CL , Graves DT. Cells with osteoblastic phenotypes can be explanted from human gingiva and periodontal ligament. J Periodontal, 1997, 68:701-707.
3，Somerman MJ, Archer SY, Imm GR, et al. A comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro. J Dent Res, 1988, 67:66-70.
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7，Robey PG. Biochemistry of bone. In: Riggs BK ,Melton Ⅲ LJ, eds. Osteoporosis: etiology, diagnosis, and management. 2nd ed. Philadelphia: Mayo Foundation, 1995. 41-66.
8，Liu F, Malaval L, Aubin JE. The mature osteoblast phenotype is characterized by extensive plasticity. Exp Cell Res , 1997, 232:97-105.
9，D′errioco JA, MacNeil RL, Takata, et al. Expression of bone associated marker by tooth root lining cells, in situ and in vitro. Bone , 1997,20:117-126.
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10，MacNeil RL, Berry J, D′Errico J, et al. Localization and expression of osteopontin in mineralized and nonmineralized tissues of the periodontium. Ann N Y Acad Sci, 1995, 760:166-176.
11，Kido J, Kasahara C, Ohishi K, et al. Identification of osteopontin in human dental calculus matrix. Arch Oral Biol ,1995, 40:967-972.
12，Ramakrishnan PR, Lin WL, Sodek J, et al . Synthesis of noncollagenous extracellular matrix proteins during development of mineralized nodules by rat periodontal ligament cells in vitro. Calcif Tissue Int , 1995,57:52-59.
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14，Chen D, Harris A, Rossini G, et al. Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) enhances BMP-3, BMP-4, and bone cell differentiation marker gene expression during the induction of mineralized bone matrix formation in cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. Calcif Tissue Int , 1997,60:283-290.
(收稿日期：1999-12-17), http://www.100md.com