豚鼠耳蜗单离Deiters细胞的钾电流
作者：杨军 汪吉宝
单位：430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科
关键词：迷路支持细胞；CORTI器；基底膜；离子通道；钾通道；四乙基铵；膜片钳术
中华耳鼻咽喉科杂志000311 【摘要】 目的 研究豚鼠耳蜗单离Deiters细胞的钾电流及其特性。方法 运用膜片钳技术，在全细胞模式下记录正常细胞外液中钾电流，不同K+浓度的细胞外液对细胞反转电位和外向钾电流的影响，四氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP)和四乙基胺(tetraethylammonium,TEA)对钾电流成分的阻滞作用，探讨外向钾电流通道的激活和失活动力学。结果 单离Deiters细胞具有电压依赖的外向整流离子选择性通道；钾通道阻滞剂4-AP和TEA可使峰电流和迟电流幅度下降，表明存在两种类型的钾通道，或者这种通道有两种不同的状态；通道的激活和失活符合Boltzmann方程。未记录到Deiters细胞的内向钙电流。结论 Deiters细胞外向整流钾电流的作用可能是缓冲细胞周围间隙钾离子浓度。
, 百拇医药
Outward potassium currents in isolated Deiters′ cells of guinea pig cochlea
YANG Jun，WANG Jibao
(Department of Otorhinolaryngology, Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022,China)
【Abstract】 Objective To study potassium currents in isolated Deiters′ cells of guinea pig cochlea. Methods Potassium currents in Deiters′ cells in normal external solution, in external solutions with different K+ concentrations effecting on reversal potentials and outward potassium currents, 4-aminopyridine(4-AP) and tetraethylammonium (TEA) blocking components of outward potassium currents and kinetics of activation and inactivation of potassium ion channels were studied using the whole cell variant of the patch clamp technique. Results Isolated Deiters′ cells could possess voltage dependent, outwardly rectifying ion channel which was K+ selective. Existence of two separate types of K+ channels or their closed and open states was suggested by effects of 4-AP and TEA. Activation and inactivation of ion channels were described by Boltzmman equation. Voltage dependent inward Ca2+ current could not be detected. Conclusion Outwardly rectifying potassium in Deiters′ cells could buffer extracellular K+ in the small space between Deiters′ cells and outer hair cells or neural fibers and alter the stiffness of Deiters′ cells, which as a result might influence cochlear mechanics.
, 百拇医药
【Key words】 Labyrinth supporting cells； Corti′s organ； Basilar membrane； Ion channels； Potassium channels； Tetraethylammonium； Patch-clamp techniques
近期的研究发现，哺乳动物的耳蜗支持细胞在耳蜗机制中可能具有重要作用。Nadol[1]等报告，人的耳蜗Deiters细胞表面存在传出性突触，而Burgess等[2]则证实，在豚鼠Deiters细胞的突触中，可能有传入性的神经末梢参与。Spicer等[3]观察到蒙古沙鼠Deiters细胞胞浆中有玫瑰花形复合体；Nadol认为它可能使该细胞具有类神经胶质样作用，即缓冲细胞外的K+浓度。关于Deiters细胞电生理的研究结果近来在国外已有报道。我们运用膜片钳技术记录了豚鼠耳蜗Deiters细胞的钾电流，并研究了其特性，现报道如下。
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材料与方法
1.细胞分离：健康花斑或白色豚鼠(250～300 g)25只(同济医科大学实验动物中心)，断头后取出听泡，快速将Corti器暴露于正常细胞外液中，分离基底膜后将其移入含0.25 mg/ml木瓜蛋白酶的正常细胞外液中。20℃消化10～12 min后，用小吸管研磨基底膜组织，分离出Deiters细胞。活性良好的单离Deiters细胞在其胞浆内没有可见的细胞器活动，无颗粒，呈正常的充盈状态[4]。用于试验的Deiters细胞均为单离细胞。
2. 全细胞电压钳记录：采用全细胞膜片钳记录方法，在电压钳下记录K+通道电流。电极尖端直径为1～1.5 μm，入水后电阻3～5 MΩ。在Deiters细胞的体部进行封接，封接电阻至少可达1 GΩ以上。膜片钳放大器(PC-Ⅱ型，华中理工大学)通过12位A/D和D/A数据转换器(DA-Ⅰ型，华中理工大学)与计算机相连接。由软件P6(华中理工大学)完成刺激信号及电压输入信号的采集。使用负压脉冲吸破细胞膜，形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和串联电阻补偿(50%～80%)。信号经截止频率为1 kHz的4阶贝塞尔低通滤波器，采样频率为5 kHz。采样后数据存贮在硬盘内供测量。
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3.实验条件：含Deiters细胞的正常细胞外液加于细胞皿(corningTM petri dishes)中，置于倒置显微镜(上海光学仪器厂)载物台上，在20～25℃下进行试验。 溶液成分见表1。细胞外液用1 mol/L的NaOH调节pH至7.4，渗透浓度为(300±2)Osmmol/L，使用前经95%O2+5%CO2混和气体饱和并过滤。电极内液用1 mol/L的KOH调节pH至7.2，渗透浓度为(290±2)Osmmol/L。牛血清白蛋白、四乙基胺(tetraethylammonium,TEA)、四氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP)、Na2ATP均为Sigma公司(美国)产品，N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2(丙磺酸)(HEPES)，乙二醇-双(2-氨乙基)四乙酸(EGTA)为G1BCO公司(美国)产品，木瓜蛋白酶为Merk公司(德国)产品。
表1 实验用溶液成分(mmol/L) 溶液成分
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正常细胞外液
50 mmol /L
K+细胞外液
150 mmol /L
K+细胞外液
电极内液
NaCl
150
105
5
KCl
5
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50
150
140
CaCl2
2
2
2
0.5
MgCl2
1
1
1
5
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HEPES
10
10
10
10
Glucose
10
10
10
EGTA
5
Na2ATP
5
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结果
1.Deiters细胞的外向电流：钳制电压为-70 mV，阶跃电压从-100 mV到50 mV(50 ms)去极化时，在正常细胞外液中记录出Deiters的外向电流(图1A)，结果在-30 mV以上引出越来越大的外向电流。图1B可以看出，这种电流呈明显外向整流性和电压依赖性。细胞间外向电流的幅度差异较大；在零电流电位附近差异最小，内向电流幅值很小。
2.Deiters细胞电压依赖性离子通道的K+选择性：分别在正常细胞外液、50 mmol/L K+细胞外液和150 mmol/L K+细胞外液中记录反转电位(erev)，平均结果(
±s,下同)分别为(-64.3±2.9) mV(n=24)、(-37.5±1.1) mV(n=7)和(2.9±0.2) mV(n=8，图2)，与Nernst公式计算出的理论反转电位比较接近。
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A： 一个典型细胞的外向电流；B：膜电位改变时外向电流(±s，n=28)，即I/V曲线。电流值取自阶跃电压结束前1 ms(迟电流)
图1 Deiters细胞的外向整流电流
图2 Deiters细胞在不同浓度的K+细胞外液中的反转电位(±s)。膜电流值取自阶跃电压开始后约1 ms的峰电流值
3.细胞外K+浓度对细胞电流的影响：在3种不同K+浓度(5 、50、150 mmol/L)的细胞外液中，分别记录Deiters细胞的外向钾电流。细胞外液中K+的浓度越高，外向电流幅度越小，尾电流由外向转变为内向，且幅度变大，说明当细胞外液中K+成倍增加时，在外向电流之后出现越来越大的内向整流。但阶跃电压在0 mV以下时，细胞外液中K+对电流的影响不大(图3)。
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4.4-AP对Deiters细胞钾电流的影响：将Deiters细胞的膜电位钳制于-60 mV，阶跃电压从-100 mV去极化至100 mV，持续100 ms，阶跃电压之后的膜电位为-30 mV，持续20 ms。在细胞皿中加入终浓度为1 mmol/L的钾通道阻滞剂4-AP后，峰电流(peak current)和迟电流(late current)幅度均有下降。阶跃电压为100 mV时，峰电流幅度从(4.34±1.72) nA降至(2.55±0.69) nA，迟电流幅度从(4.31±1.72) nA降至(3.02±1.20) nA。4-AP应用前后膜总电流下降幅度与迟电流下降幅度相比差异有显著性，峰电流减少的幅度较大(n=5，P<0.05，迟电流值取自阶跃电压结束前2 ms)。
图3 不同浓度K+细胞外液中Deiters细胞外向钾电流(±s)。膜电流值取自阶跃电压结束前1 ms
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5.TEA对Deiters细胞钾电流的影响：采用与上述相同的刺激参数，加入终浓度为10 mmol/L的钾通道阻滞剂TEA之后，峰电流和迟电流的幅值均有下降。阶跃电压为100 mV时，峰电流幅度从(3.74±1.50) nA降至(3.70±1.51) nA，迟电流幅度从(2.17±1.50) nA降至(2.15±1.51) nA。TEA应用前后膜总电流的峰电流下降幅度与迟电流下降幅度相比差异无显著性(n=8, P>0.05，迟电流值取自阶跃电压结束前2 ms)，呈电压依赖性的抑制。
6.电压依赖性的激活曲线：前脉冲电压(-90～60 mV)和刺激电压(-30 mV)持续时间均为100 ms，比较两者的电流幅值，用Boltzmann方程拟合(公式1)，得出激活曲线，以研究Deiters细胞钾电流通道的激活特性和电压依赖性。
I(Vm)=Im/[1+exp(V1/2-Vm)/S] (1)
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式中I(Vm)为-30 mV时的即时电流(取刺激电压开始后1 ms电流值)，Im为前脉冲电压时的最大电流，V1/2和Vm分别代表半量激活电压和前脉冲电压，S为激活的电压敏感性。本组V1/2=(12.9±0.67) mV(n=18)，S=(12.2±0.59) mV(n=18)。从图4中可以看出所得数据与拟合曲线非常接近(相关系数0.98)，并呈明显的电压依赖性。
7. 电压依赖性的失活曲线：前脉冲电压(-60～40 mV)和刺激电压(50 mV)持续时间均为2 s，测量电流幅值，仍然用Boltzmann方程拟合，绘出失活曲线。V1/2(半量失活电压)=(-2.5±1.7) mV(n=13)，S=(13.5±1.52) mV(n=13，图5)，相关系数0.98。
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图4 根据Boltzmann方程拟合而得Deiters细胞钾电流的激活曲线。纵轴为I(Vm)/Im(标准化电流)
图5 用Boltzmann方程拟合出Deiters细胞钾电流失活的激活曲线。纵轴为I(Vm)/Im(标准化曲线)
8.Deiters细胞钾通道失活后的恢复：采用双脉冲刺激，以观察通道在第一次激活并失活后，再次完全激活所需要的时间以及不同时间的恢复过程。前脉冲和刺激脉冲均为80 mV，钳制电压-60 mV，设计一系列不同时间间隔的双脉冲刺激程序，使第一个脉冲完成后的不同时间进行第二个刺激。用平方指数函数(公式2)拟合数据，得到通道失活后的恢复曲线。
It=Im(1-e-t/τ)2 (2)
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式中It和Im分别为间隔时间为t时的电流和前脉冲最大电流，τ为失活时间常数。本文τ=(29.7±4.5) ms(n=10，图6)。
9.未记录到Derters细胞的钙电流：将细胞外液中的Ca2+用Ba2+(30 mmol/L)替代，电极内液和细胞外液中的K+用Cs+替代，内液中加入TEA，所记录的5个Deiters细胞均无内向电流，外向电流也消失，所有电流线均靠近基线(数据未显示)。
讨论
我们以前的研究中发现，正常细胞外液中Dei-ters细胞离子通K+与Na+的相对通透性比率为25.4：1[4]，说明Deiters细胞电压依赖性离子通道具有高K+选择性。本实验记录到豚鼠耳蜗Deiters细胞在正常细胞外液中具有电压依赖性和外向整流性的电流。在正常和高K+的细胞外液中分别记录到的反转电位显示，这种电流确实是高K+选择性的。当阶跃电压在0 mV以上时，增加细胞外液中的K+浓度，外向电流的幅度变小，而尾电流的内向整流变大。本组未发现Deiters细胞的内向钙电流。
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图6 平方指数函数拟合的Deiters细胞钾通道失活后恢复曲线。两脉冲间隔时间从10 ms～8 s, 10个刺激系列，相关系数0.95
4-AP通常被认为是电压依赖性的延迟整流K+通道阻滞剂[5]。而TEA对多种类型的K+通道均有抑制作用[6]。本实验显示，4-AP对细胞峰电流(即快相成分)的影响大于迟电流(即慢相成分)，阶跃电压越大，抑制越明显，呈电压依赖性。但TEA对细胞电流的快成分和慢成分的影响则是相同的，为非电压依赖性。这两种K+通道阻滞剂的实验结果除了进一步证实Deiters细胞的外向电流为钾电流以外，还说明Deiters细胞存在两种类型的钾通道，或者是一种钾通道的两个不同状态。实验中，先用4-AP抑制快相成分之后，再加TEA，可引起4-AP非敏感电流(即加4-AP后的剩余电流)幅值的减小；而先加TEA再加4-AP，仍然可引起外向电流形状的改变，提示4-AP和TEA对Deiters细胞的作用是相互独立的，并无拮抗作用。Nenov等[7]通过研究4-AP和尼莫地平对Deiters细胞钾电流的影响，认为至少其中一种通道类型为Kv1.5。
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Deiters细胞钾电流的激活动力学试验得出V1/2=(12.9±0.67) mV，不同于Nenov等[7]等报道的结果。Nenov等将数据采用Boltzmann方程分段拟合，得到2个V1/2，而本组例数较多，且所采用的细胞内、外液的成分也与其不同。S=(12.2±0.59) mV，表示每e倍阶跃电压的改变可有12.2的激活电压敏感性。失活曲线的V1/2 =(-2.5±1.7) mV，S=(13.5±1.52) mV。
Nenov等[7]通过研究4-AP和尼莫地平对Deiters细胞钾电流的影响，认为至少其中一种通道类型为Kv1.5。目前认为，Deiters细胞的外向钾电流的作用是在细胞受到去极化的影响后，恢复其静息电位，细胞外液中的高K+浓度是细胞去极化的因素之一。令人感兴趣的是，本实验发现当细胞外液中K+浓度逐渐升高甚至超过内液中K+浓度时，仍然可以记录到Deiters细胞的外向整流钾电流，说明细胞内的外向钾电流的驱动力很大，只是在150 mmol/L K+外液中出现很大的内向尾电流整流，以恢复细胞内环境的平衡。外向钾电流的这种作用特性，可以缓冲附近外毛细胞和神经纤维外的K+浓度，即具有神经胶质样离子运输作用[8]。蒙古沙鼠耳蜗Deiters细胞的超微结构研究发现，其胞浆中存在非常独特的玫瑰花形复合体，其功能可能与趋化K+从神经和外毛细胞的流出有关[3]。这种细胞结构的特点也从形态上支持了外向钾电流的生理特点。
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本实验证实，Deiters细胞膜上存在两种类型的钾通道，或一种钾通道的两种状态，关于这两种通道或两种状态的药理学分型和动力学尚需进一步研究。Deiters细胞的神经支配，递质(包括ATP)的来源及作用的研究也将对耳蜗机制的阐明大有裨益。
通信作者：杨军(Email：yangjun67@263.net)
参考文献
1，Nadol JB Jr, Burgess BJ. Supranuclear efferent synapses on outer hair cells and Deiters′cells in the human organ of Corti. Hear Res, l994,81:49-56.
2，Burgess BJ, Adams JC, Nadol JB. Morphological evidence for innervation of Deiters′ and Hensen′s cells in the guinea pig. Hear Res,1997,108:74-82.
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3，Spicer SS, Schulte BA. Cytologic structures unique to Deiters′cells of the cochlea. Anat Rec,1993,237:421-430.
4，杨军，汪吉宝. 单离豚鼠内耳Deiters 细胞的形态及电生理特性. 临床耳鼻咽喉科学杂志, 2000, 14:29-31.
5，Grissmer S, Nguyen AN, Aiyar J, et al. Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+ channels,types Kv1.1,1.2,1.3,1.5,and 3.1,stably expressed in mammalian cell lines. Mol Pharmacol,1994,45:1227-1234.
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6，Rudy B. Diversity and ubiquity of K channels. Neuroscience, 1988,25:729-749.
7，Nenov AP, Chen C, Bobbin RP. Outward rectifying potassium currents are the dominant voltage activated currents present in Deiters′cells. Hear Res, 1998,123:168-182.
8，Spicer SS, Schulte BA. The fine structure of spiral ligament cells relates to ion return to the stria and varies with place-frequency. Hear Res, 1996,100:80-100.
(收稿日期：1999-09-26), 百拇医药
单位：430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科
关键词：迷路支持细胞；CORTI器；基底膜；离子通道；钾通道；四乙基铵；膜片钳术
中华耳鼻咽喉科杂志000311 【摘要】 目的 研究豚鼠耳蜗单离Deiters细胞的钾电流及其特性。方法 运用膜片钳技术，在全细胞模式下记录正常细胞外液中钾电流，不同K+浓度的细胞外液对细胞反转电位和外向钾电流的影响，四氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP)和四乙基胺(tetraethylammonium,TEA)对钾电流成分的阻滞作用，探讨外向钾电流通道的激活和失活动力学。结果 单离Deiters细胞具有电压依赖的外向整流离子选择性通道；钾通道阻滞剂4-AP和TEA可使峰电流和迟电流幅度下降，表明存在两种类型的钾通道，或者这种通道有两种不同的状态；通道的激活和失活符合Boltzmann方程。未记录到Deiters细胞的内向钙电流。结论 Deiters细胞外向整流钾电流的作用可能是缓冲细胞周围间隙钾离子浓度。
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Outward potassium currents in isolated Deiters′ cells of guinea pig cochlea
YANG Jun，WANG Jibao
(Department of Otorhinolaryngology, Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022,China)
【Abstract】 Objective To study potassium currents in isolated Deiters′ cells of guinea pig cochlea. Methods Potassium currents in Deiters′ cells in normal external solution, in external solutions with different K+ concentrations effecting on reversal potentials and outward potassium currents, 4-aminopyridine(4-AP) and tetraethylammonium (TEA) blocking components of outward potassium currents and kinetics of activation and inactivation of potassium ion channels were studied using the whole cell variant of the patch clamp technique. Results Isolated Deiters′ cells could possess voltage dependent, outwardly rectifying ion channel which was K+ selective. Existence of two separate types of K+ channels or their closed and open states was suggested by effects of 4-AP and TEA. Activation and inactivation of ion channels were described by Boltzmman equation. Voltage dependent inward Ca2+ current could not be detected. Conclusion Outwardly rectifying potassium in Deiters′ cells could buffer extracellular K+ in the small space between Deiters′ cells and outer hair cells or neural fibers and alter the stiffness of Deiters′ cells, which as a result might influence cochlear mechanics.
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【Key words】 Labyrinth supporting cells； Corti′s organ； Basilar membrane； Ion channels； Potassium channels； Tetraethylammonium； Patch-clamp techniques
近期的研究发现，哺乳动物的耳蜗支持细胞在耳蜗机制中可能具有重要作用。Nadol[1]等报告，人的耳蜗Deiters细胞表面存在传出性突触，而Burgess等[2]则证实，在豚鼠Deiters细胞的突触中，可能有传入性的神经末梢参与。Spicer等[3]观察到蒙古沙鼠Deiters细胞胞浆中有玫瑰花形复合体；Nadol认为它可能使该细胞具有类神经胶质样作用，即缓冲细胞外的K+浓度。关于Deiters细胞电生理的研究结果近来在国外已有报道。我们运用膜片钳技术记录了豚鼠耳蜗Deiters细胞的钾电流，并研究了其特性，现报道如下。
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材料与方法
1.细胞分离：健康花斑或白色豚鼠(250～300 g)25只(同济医科大学实验动物中心)，断头后取出听泡，快速将Corti器暴露于正常细胞外液中，分离基底膜后将其移入含0.25 mg/ml木瓜蛋白酶的正常细胞外液中。20℃消化10～12 min后，用小吸管研磨基底膜组织，分离出Deiters细胞。活性良好的单离Deiters细胞在其胞浆内没有可见的细胞器活动，无颗粒，呈正常的充盈状态[4]。用于试验的Deiters细胞均为单离细胞。
2. 全细胞电压钳记录：采用全细胞膜片钳记录方法，在电压钳下记录K+通道电流。电极尖端直径为1～1.5 μm，入水后电阻3～5 MΩ。在Deiters细胞的体部进行封接，封接电阻至少可达1 GΩ以上。膜片钳放大器(PC-Ⅱ型，华中理工大学)通过12位A/D和D/A数据转换器(DA-Ⅰ型，华中理工大学)与计算机相连接。由软件P6(华中理工大学)完成刺激信号及电压输入信号的采集。使用负压脉冲吸破细胞膜，形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和串联电阻补偿(50%～80%)。信号经截止频率为1 kHz的4阶贝塞尔低通滤波器，采样频率为5 kHz。采样后数据存贮在硬盘内供测量。
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3.实验条件：含Deiters细胞的正常细胞外液加于细胞皿(corningTM petri dishes)中，置于倒置显微镜(上海光学仪器厂)载物台上，在20～25℃下进行试验。 溶液成分见表1。细胞外液用1 mol/L的NaOH调节pH至7.4，渗透浓度为(300±2)Osmmol/L，使用前经95%O2+5%CO2混和气体饱和并过滤。电极内液用1 mol/L的KOH调节pH至7.2，渗透浓度为(290±2)Osmmol/L。牛血清白蛋白、四乙基胺(tetraethylammonium,TEA)、四氨基吡啶(4-aminopyridine, 4-AP)、Na2ATP均为Sigma公司(美国)产品，N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2(丙磺酸)(HEPES)，乙二醇-双(2-氨乙基)四乙酸(EGTA)为G1BCO公司(美国)产品，木瓜蛋白酶为Merk公司(德国)产品。
表1 实验用溶液成分(mmol/L) 溶液成分
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正常细胞外液
50 mmol /L
K+细胞外液
150 mmol /L
K+细胞外液
电极内液
NaCl
150
105
5
KCl
5
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50
150
140
CaCl2
2
2
2
0.5
MgCl2
1
1
1
5
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HEPES
10
10
10
10
Glucose
10
10
10
EGTA
5
Na2ATP
5
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结果
1.Deiters细胞的外向电流：钳制电压为-70 mV，阶跃电压从-100 mV到50 mV(50 ms)去极化时，在正常细胞外液中记录出Deiters的外向电流(图1A)，结果在-30 mV以上引出越来越大的外向电流。图1B可以看出，这种电流呈明显外向整流性和电压依赖性。细胞间外向电流的幅度差异较大；在零电流电位附近差异最小，内向电流幅值很小。
2.Deiters细胞电压依赖性离子通道的K+选择性：分别在正常细胞外液、50 mmol/L K+细胞外液和150 mmol/L K+细胞外液中记录反转电位(erev)，平均结果(
±s,下同)分别为(-64.3±2.9) mV(n=24)、(-37.5±1.1) mV(n=7)和(2.9±0.2) mV(n=8，图2)，与Nernst公式计算出的理论反转电位比较接近。, 百拇医药
A： 一个典型细胞的外向电流；B：膜电位改变时外向电流(
±s，n=28)，即I/V曲线。电流值取自阶跃电压结束前1 ms(迟电流)图1 Deiters细胞的外向整流电流
图2 Deiters细胞在不同浓度的K+细胞外液中的反转电位(
±s)。膜电流值取自阶跃电压开始后约1 ms的峰电流值3.细胞外K+浓度对细胞电流的影响：在3种不同K+浓度(5 、50、150 mmol/L)的细胞外液中，分别记录Deiters细胞的外向钾电流。细胞外液中K+的浓度越高，外向电流幅度越小，尾电流由外向转变为内向，且幅度变大，说明当细胞外液中K+成倍增加时，在外向电流之后出现越来越大的内向整流。但阶跃电压在0 mV以下时，细胞外液中K+对电流的影响不大(图3)。
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4.4-AP对Deiters细胞钾电流的影响：将Deiters细胞的膜电位钳制于-60 mV，阶跃电压从-100 mV去极化至100 mV，持续100 ms，阶跃电压之后的膜电位为-30 mV，持续20 ms。在细胞皿中加入终浓度为1 mmol/L的钾通道阻滞剂4-AP后，峰电流(peak current)和迟电流(late current)幅度均有下降。阶跃电压为100 mV时，峰电流幅度从(4.34±1.72) nA降至(2.55±0.69) nA，迟电流幅度从(4.31±1.72) nA降至(3.02±1.20) nA。4-AP应用前后膜总电流下降幅度与迟电流下降幅度相比差异有显著性，峰电流减少的幅度较大(n=5，P<0.05，迟电流值取自阶跃电压结束前2 ms)。
图3 不同浓度K+细胞外液中Deiters细胞外向钾电流(
±s)。膜电流值取自阶跃电压结束前1 ms, 百拇医药
5.TEA对Deiters细胞钾电流的影响：采用与上述相同的刺激参数，加入终浓度为10 mmol/L的钾通道阻滞剂TEA之后，峰电流和迟电流的幅值均有下降。阶跃电压为100 mV时，峰电流幅度从(3.74±1.50) nA降至(3.70±1.51) nA，迟电流幅度从(2.17±1.50) nA降至(2.15±1.51) nA。TEA应用前后膜总电流的峰电流下降幅度与迟电流下降幅度相比差异无显著性(n=8, P>0.05，迟电流值取自阶跃电压结束前2 ms)，呈电压依赖性的抑制。
6.电压依赖性的激活曲线：前脉冲电压(-90～60 mV)和刺激电压(-30 mV)持续时间均为100 ms，比较两者的电流幅值，用Boltzmann方程拟合(公式1)，得出激活曲线，以研究Deiters细胞钾电流通道的激活特性和电压依赖性。
I(Vm)=Im/[1+exp(V1/2-Vm)/S] (1)
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式中I(Vm)为-30 mV时的即时电流(取刺激电压开始后1 ms电流值)，Im为前脉冲电压时的最大电流，V1/2和Vm分别代表半量激活电压和前脉冲电压，S为激活的电压敏感性。本组V1/2=(12.9±0.67) mV(n=18)，S=(12.2±0.59) mV(n=18)。从图4中可以看出所得数据与拟合曲线非常接近(相关系数0.98)，并呈明显的电压依赖性。
7. 电压依赖性的失活曲线：前脉冲电压(-60～40 mV)和刺激电压(50 mV)持续时间均为2 s，测量电流幅值，仍然用Boltzmann方程拟合，绘出失活曲线。V1/2(半量失活电压)=(-2.5±1.7) mV(n=13)，S=(13.5±1.52) mV(n=13，图5)，相关系数0.98。
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图4 根据Boltzmann方程拟合而得Deiters细胞钾电流的激活曲线。纵轴为I(Vm)/Im(标准化电流)
图5 用Boltzmann方程拟合出Deiters细胞钾电流失活的激活曲线。纵轴为I(Vm)/Im(标准化曲线)
8.Deiters细胞钾通道失活后的恢复：采用双脉冲刺激，以观察通道在第一次激活并失活后，再次完全激活所需要的时间以及不同时间的恢复过程。前脉冲和刺激脉冲均为80 mV，钳制电压-60 mV，设计一系列不同时间间隔的双脉冲刺激程序，使第一个脉冲完成后的不同时间进行第二个刺激。用平方指数函数(公式2)拟合数据，得到通道失活后的恢复曲线。
It=Im(1-e-t/τ)2 (2)
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式中It和Im分别为间隔时间为t时的电流和前脉冲最大电流，τ为失活时间常数。本文τ=(29.7±4.5) ms(n=10，图6)。
9.未记录到Derters细胞的钙电流：将细胞外液中的Ca2+用Ba2+(30 mmol/L)替代，电极内液和细胞外液中的K+用Cs+替代，内液中加入TEA，所记录的5个Deiters细胞均无内向电流，外向电流也消失，所有电流线均靠近基线(数据未显示)。
讨论
我们以前的研究中发现，正常细胞外液中Dei-ters细胞离子通K+与Na+的相对通透性比率为25.4：1[4]，说明Deiters细胞电压依赖性离子通道具有高K+选择性。本实验记录到豚鼠耳蜗Deiters细胞在正常细胞外液中具有电压依赖性和外向整流性的电流。在正常和高K+的细胞外液中分别记录到的反转电位显示，这种电流确实是高K+选择性的。当阶跃电压在0 mV以上时，增加细胞外液中的K+浓度，外向电流的幅度变小，而尾电流的内向整流变大。本组未发现Deiters细胞的内向钙电流。
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图6 平方指数函数拟合的Deiters细胞钾通道失活后恢复曲线。两脉冲间隔时间从10 ms～8 s, 10个刺激系列，相关系数0.95
4-AP通常被认为是电压依赖性的延迟整流K+通道阻滞剂[5]。而TEA对多种类型的K+通道均有抑制作用[6]。本实验显示，4-AP对细胞峰电流(即快相成分)的影响大于迟电流(即慢相成分)，阶跃电压越大，抑制越明显，呈电压依赖性。但TEA对细胞电流的快成分和慢成分的影响则是相同的，为非电压依赖性。这两种K+通道阻滞剂的实验结果除了进一步证实Deiters细胞的外向电流为钾电流以外，还说明Deiters细胞存在两种类型的钾通道，或者是一种钾通道的两个不同状态。实验中，先用4-AP抑制快相成分之后，再加TEA，可引起4-AP非敏感电流(即加4-AP后的剩余电流)幅值的减小；而先加TEA再加4-AP，仍然可引起外向电流形状的改变，提示4-AP和TEA对Deiters细胞的作用是相互独立的，并无拮抗作用。Nenov等[7]通过研究4-AP和尼莫地平对Deiters细胞钾电流的影响，认为至少其中一种通道类型为Kv1.5。
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Deiters细胞钾电流的激活动力学试验得出V1/2=(12.9±0.67) mV，不同于Nenov等[7]等报道的结果。Nenov等将数据采用Boltzmann方程分段拟合，得到2个V1/2，而本组例数较多，且所采用的细胞内、外液的成分也与其不同。S=(12.2±0.59) mV，表示每e倍阶跃电压的改变可有12.2的激活电压敏感性。失活曲线的V1/2 =(-2.5±1.7) mV，S=(13.5±1.52) mV。
Nenov等[7]通过研究4-AP和尼莫地平对Deiters细胞钾电流的影响，认为至少其中一种通道类型为Kv1.5。目前认为，Deiters细胞的外向钾电流的作用是在细胞受到去极化的影响后，恢复其静息电位，细胞外液中的高K+浓度是细胞去极化的因素之一。令人感兴趣的是，本实验发现当细胞外液中K+浓度逐渐升高甚至超过内液中K+浓度时，仍然可以记录到Deiters细胞的外向整流钾电流，说明细胞内的外向钾电流的驱动力很大，只是在150 mmol/L K+外液中出现很大的内向尾电流整流，以恢复细胞内环境的平衡。外向钾电流的这种作用特性，可以缓冲附近外毛细胞和神经纤维外的K+浓度，即具有神经胶质样离子运输作用[8]。蒙古沙鼠耳蜗Deiters细胞的超微结构研究发现，其胞浆中存在非常独特的玫瑰花形复合体，其功能可能与趋化K+从神经和外毛细胞的流出有关[3]。这种细胞结构的特点也从形态上支持了外向钾电流的生理特点。
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本实验证实，Deiters细胞膜上存在两种类型的钾通道，或一种钾通道的两种状态，关于这两种通道或两种状态的药理学分型和动力学尚需进一步研究。Deiters细胞的神经支配，递质(包括ATP)的来源及作用的研究也将对耳蜗机制的阐明大有裨益。
通信作者：杨军(Email：yangjun67@263.net)
参考文献
1，Nadol JB Jr, Burgess BJ. Supranuclear efferent synapses on outer hair cells and Deiters′cells in the human organ of Corti. Hear Res, l994,81:49-56.
2，Burgess BJ, Adams JC, Nadol JB. Morphological evidence for innervation of Deiters′ and Hensen′s cells in the guinea pig. Hear Res,1997,108:74-82.
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3，Spicer SS, Schulte BA. Cytologic structures unique to Deiters′cells of the cochlea. Anat Rec,1993,237:421-430.
4，杨军，汪吉宝. 单离豚鼠内耳Deiters 细胞的形态及电生理特性. 临床耳鼻咽喉科学杂志, 2000, 14:29-31.
5，Grissmer S, Nguyen AN, Aiyar J, et al. Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+ channels,types Kv1.1,1.2,1.3,1.5,and 3.1,stably expressed in mammalian cell lines. Mol Pharmacol,1994,45:1227-1234.
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6，Rudy B. Diversity and ubiquity of K channels. Neuroscience, 1988,25:729-749.
7，Nenov AP, Chen C, Bobbin RP. Outward rectifying potassium currents are the dominant voltage activated currents present in Deiters′cells. Hear Res, 1998,123:168-182.
8，Spicer SS, Schulte BA. The fine structure of spiral ligament cells relates to ion return to the stria and varies with place-frequency. Hear Res, 1996,100:80-100.
(收稿日期：1999-09-26), 百拇医药