细胞内Retinoid结合蛋白mRNA水平在生精过程中的周期性变化
作者：陈咏梅 叶世隽 黄玉苓 郑文利
单位：陈咏梅(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)；叶世隽(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)；黄玉苓(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)
关键词：支持细胞；细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ；细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ；睾丸
解剖学报000412 【摘要】 目的 研究大鼠睾丸细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ(CRBP-Ⅰ)及细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)mRNA水平与曲细精管生精上皮周期的相关关系。 方法 分别以地高辛标记的大鼠CRBP-Ⅰ及CRABP-ⅡcDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交，应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量。 结果 CRBP-Ⅰ及CRABP-Ⅱ mRNA在支持细胞(sertoli cell, SC)中表达。CRBP-Ⅰ mRNAⅦ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，至Ⅰ期骤然下降，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低，仅为高峰时期的28%。CRABP-Ⅱ mRNA Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降。 结论 SC可合成CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ，且合成量具有与生精周期相伴的周期性变化。总的来说Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期合成量较高，生精周期后期CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的高表达提示它们在圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用。CRBP-ⅠⅪ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用。总之，SC周期性分泌的蛋白可能是它调节周期性精子发生的重要因素。研究大鼠睾丸细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ(CRBP-Ⅰ)及细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)mRNA水平与曲细精管生精上皮周期的相关关系。 方法 分别以地高辛标记的大鼠CRBP-Ⅰ及CRABP-ⅡcDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交，应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量。 结果 CRBP-Ⅰ及CRABP-Ⅱ mRNA在支持细胞(sertoli cell, SC)中表达。CRBP-Ⅰ mRNAⅦ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，至Ⅰ期骤然下降，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低，仅为高峰时期的28%。CRABP-Ⅱ mRNA Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降。 结论 SC可合成CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ，且合成量具有与生精周期相伴的周期性变化。总的来说Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期合成量较高，生精周期后期CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的高表达提示它们在圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用。CRBP-ⅠⅪ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用。总之，SC周期性分泌的蛋白可能是它调节周期性精子发生的重要因素。
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【中图分类号】 R322.6+4 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-339
THE PERIODIC CHANGE OF CELLULAR RETINOID BINDING
PROTEIN mRNA LEVEL IN RAT TESTIS DURING THE CYCLE
OF THE SEMINIFEROUS EPITHELIUM
CHEN Yong-mei YE Shi-jun HUANG Yu-ling ZHENG Wen-li
(Department of Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medcine, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective
To investigate the variation of the level of rat cellular retinol-binding protein-Ⅰ(CRBP-Ⅰ) and cellular retinoic acid binding protein-Ⅱ(CRABP-Ⅱ) mRNA in rat testis during the spermatogenetic cycle. Methods In situ hybridization was performed with DIG-labeled rat CRBP-Ⅰ or CRABP-Ⅱ cDNA probe on male SD rats frozen tissue sections. The laser density scanning system was used to quantitate the level of the positive signal. Results We found that both of CRBP-Ⅰ and CRABP-Ⅱ genes were expressed in the SC in the testis, and a stage-dependent variation was observed. No signal was found in the spermatogenetic cells. The CRBP-Ⅰ mRNA levels increased from stage Ⅶ-Ⅷ through stage Ⅸ-Ⅺ, reached a peak during stage Ⅺ Ⅰ-Ⅺ Ⅴ,and declined markedly between stage Ⅰ-Ⅵ, very slight hybridization signal was seen at stage Ⅱ-Ⅳ. The CRABP-Ⅱ mRNA levels were two folds lower at stage Ⅰ-Ⅵ than that detected at stage Ⅶ-Ⅺ Ⅴ,at stage Ⅶ-Ⅷ it reached a peak, thereafter declined. Conclusion The expression of both CRBP-Ⅰ and CRABP-Ⅱ genes was higher at stage Ⅶ-Ⅺ Ⅴthan at stage Ⅰ-Ⅵ. At the later of the spermatogenetic cycle the high expression of CRBP-Ⅰ, CRABP-Ⅱ suggested that they might play an role in the spermiogenesis from round sperm to elongated one. The peak of CRBP-Ⅰ mRNA levels at stage Ⅺ Ⅰ-Ⅺ Ⅴ indicated that it might play a key role in the process that the secondary spermatocytes finished meiosis and a new spermatogenetic cycle was initiated. The cyclically secreted proteins of SC may be one important factor by which SC influences spermatogenesis.
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【Key words】 Sertoli cell; Testis; Cellular retinol-binding protein-Ⅰ(CRBP-Ⅰ);Cellular retinoic acid binding protein-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)
视黄醇(retinol, R,维生素A)和它的衍生物视黄醛(retinaldehyde)\,视黄酸(retinoic acid, RA)，统称为Retinoid(Rs)。很早人们就发现Rs是正常精子发生所必需的。如果食物中缺乏R(vitamin A deficient, VAD)，会导致大鼠曲细精管生精上皮极度退化，所有后期生精细胞均降解，仅剩下支持细胞、A1型精原细胞和少量前细线期精母细胞[1]。食物中恢复供应R或睾内注射高浓度RA则可逆转这一改变，启动一个同步化的精子发生[2，3]。CRBP及CRABP分别是R和RA在细胞内的结合蛋白，细胞内Rs结合蛋白在Rs转运和代谢中起着非常重要的作用，但这类蛋白在生精过程中的确切功能和作用机理仍不清楚。目前国外有少量研究，但尚属起步阶段，国内还未见报道。鉴于此，我们对大鼠生精过程中睾丸CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ mRNA水平进行了动态观察。
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材料和方法
1.材料
动物：SD健康雄性大鼠4只，体重400g左右，由药检所实验动物中心提供。
探针：大鼠CRBP-ⅠcDNA，长0.4kb，大鼠CRABP-ⅡcDNA，长0.42kb，载体均为pCRTMⅡ。
试剂盒：地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection kit)为Boehringer Mannbeim公司产品。
2.实验方法
2.1 cDNA片段的制备[4]：分别将含CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选转化成功者小量制备质粒，用EcoRⅠ酶切鉴定。将含正确cDNA质粒的细菌克隆大量扩增，碱裂解法提取质粒，PEG法纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定A260和A280值，计算DNA浓度，其余置-20℃保存。用地高辛DNA标记和检测试剂盒标记和检测cDNA探针。
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2.2 组织冰冻切片的制备：大鼠断头处死后迅速取出睾丸，经液氮速冻后，于-20℃恒冷箱切片机中切片(厚8～10μm)，新鲜配制的4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，待切片晾干后存-20℃备用。于原位杂交切片的相邻切片进行PAS染色，在光镜下确定每个曲细精管属哪一期，以此为依据，确认原位杂交切片中各曲细精管的分期，本实验分曲细精管为Ⅰ、Ⅱ～Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ～Ⅷ、Ⅸ～Ⅺ、Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期7个阶段。
2.3 原位杂交[5]：室温下用含5 mmol/L MgCl\-2的PBS和2×SSC洗切片，预杂交液37℃预杂交1h，杂交液(含新变性的探针约2mg/L)于37℃杂交16h(以杂交液中除去探针作阴性对照)。2×SSC、1×SSC、0.5×SSC于室温下依次清洗，于封闭液中封闭30min，于抗体溶液中孵育2h，加入新鲜配制的显色液，暗处显色满意后，TE终止显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，镜检并摄片。
2.4 原位杂交结果的定量及统计学处理：采用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对原位杂交结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为mRNA量的参数，数据以均数±标准误
±s表示，对灰度扫描数据进行方差分析和SNK检验，检验标准α＝0.05。
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结果
1.制备的质粒DNA的限制性内切酶酶切分析
用质粒转化大肠杆菌，小量制备质粒DNA后用EcoRⅠ消化，经琼脂糖凝胶电泳后可见分别有400bp和420bp的目的cDNA片段，与预期相符。
2.原位杂交的结果
2.1 CRBP-Ⅰ：蓝色颗粒状阳性杂交信号主要位于SC(图2)，且有明显的周期性改变，Leydig细胞中亦有表达，生精细胞中无表达。SC中的阳性信号Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，至Ⅰ期骤然下降，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低，仅为高峰时期的28%(图1)。方差分析显示各个阶段之间具有非常显著差异(P<0.01)，SNK检验显示其中Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期与Ⅰ、Ⅱ～Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期之间分别有显著差异(P<0.05)(附表)。
, 百拇医药 附表 大鼠睾丸SC中mRNA的灰度值(±s)
Table Gray level of mRNA in the SC of rat testis (±s) 期Stage
Ⅰ
Ⅱ～Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ～Ⅷ
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Ⅸ～Ⅺ
Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ
CRBP-Ⅰ
0.15±0.02*
0.10±0.02*
0.15±0.01*
0.14±0.03*
0.22±0.05
0.24±0.05
0.36±0.07☆
CRABP-Ⅱ
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0.08±0.01*
0.10±0.02*
0.10±0.01*
0.13±0.02*
0.26±0.02☆
0.24±0.03☆
0.20±0.02☆
其中和☆之间有显著差异(P<0.05)。☆P<0.05compared with*
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图1 大鼠睾丸曲细精管上皮周期中mRNA相对平均灰度值
的变化〔AU.光密度单位(Arbitrary densitometric units)〕
Fig.1 Varation of the relative average grey level of
the specific hybridizable mRNA in the SC of the
seminiferous tubule of rat testis during the epithelial cycle.
2.2 CRABP-Ⅱ：蓝色颗粒状阳性杂交信号位于SC(图3)，且有明显的周期性改变，生精细胞中无表达。SC中的阳性信号Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降(图1)。方差分析显示各个阶段之间具有非常显著差异(P<0.01)，SNK检验显示其中Ⅶ～Ⅷ、Ⅸ～Ⅺ、Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期与Ⅰ、Ⅱ～Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期之间分别有显著差异(P<0.05)(表1)。
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2.3 阴性对照未见阳性杂交信号(图4)。
图2 CRBP-Ⅰ mRNA 在大鼠睾丸曲精管内的分布 ×200；
a示Ⅸ～Ⅺ期，b示Ⅰ期。BL.基膜 TL.管腔(下同)
Fig.2 Distribution of CRBP-Ⅰ mRNA in the seminiferous tubule of testis in the rat, as detected by in situ hybridization with CRBP-Ⅰ cDNA probe ×200; a,stage Ⅸ～Ⅺ b,stage Ⅰ; Bl,basal lamina TL,tubular lumen
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图3 CRBP-Ⅱ mRNA 在大鼠睾丸曲精管内的分布 ×200；
a示Ⅻ～ⅩⅣ期，b示Ⅱ～Ⅳ期。
Fig.3 Distribution of CRBP-Ⅱ mRNA in the seminiferous tubule of testis in the rat, as detected by in situ hybridization with CRBP-Ⅱ cDNA probe ×200; a,stage Ⅻ～ⅩⅣ b,stage Ⅱ～Ⅳ; Bl,basal lamina TL,tubular lumen
图4 阴性对照 ×200
Fig.4 Negative control of in situ hybridization on testicular tissue ×200; Bl,basal lamina TL,tubular lumen
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讨 论
CRBP有两种亚型，CRBP-Ⅰ及CRBP-Ⅱ。CRBP-Ⅱ仅于成年大鼠的小肠中发现，而CRBP-Ⅰ在体内多种组织中大量存在，且其蛋白质与mRNA水平有很好的对应关系[6]。本研究表明，CRBP-Ⅰ mRNA主要位于SC，Leydig细胞中亦有表达，生精细胞中无表达。位于SC中的CRBP-Ⅰ mRNA水平有明显的周期性改变，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低。这与Rajan等[7]用同位素标记的CRBP-Ⅰ cRNA探针研究发现CRBP-Ⅰ mRNA Ⅹ～Ⅺ Ⅱ期达高峰，Ⅰ～Ⅲ期骤降的周期性变化相符合。免疫组织化学及体外分离培养细胞试验均证实CRBP-Ⅰ蛋白主要位于SC，Leydig细胞及附睾头部近端的主细胞中也存在。Rajan[7]等还发现CRBP-Ⅰ蛋白水平峰值在Ⅹ Ⅱ-Ⅲ期，Ⅳ～Ⅶ期骤降。可见蛋白周期略滞后于mRNA周期，说明蛋白周期正是其mRNA水平周期性变动的反应。其Ⅹ Ⅱ～Ⅺ Ⅴ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用。
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一旦R进入SC，即与CRBP-Ⅰ结合，在正常情况下，血浆R及RBP水平恒定，摄入R依赖于细胞中的载脂CRBP-Ⅰ。在生精过程中，各期生精细胞对R的需求可能不同，当R因代谢从载脂CRBP-Ⅰ中游离出来时，细胞中CRBP-Ⅰ的水平就会发生变化，这可能是其周期性变化的原因，提示其对精子发生的重要意义。CRBP-Ⅰ的表达受R营养状况的调节，在R缺乏(vitamin-A-deficient, VAD)动物，CRBP-Ⅰ mRNA水平明显下降，补充R则可使之很快恢复到正常水平。故推测R可直接影响细胞内CRBP-Ⅰ基因的表这，后者也许是一个R导致的早期应答基因[8]。CRBP-Ⅰ的确切功能仍未明了，但SC中的CRBP-Ⅰ可能与R的内摄及酯化、R对SC的直接作用或转运R到发育中的生精细胞有关。
CRABP参与RA信号传导，它也有两种亚型：CRABP-Ⅰ和CRABP-Ⅱ，CRABP-Ⅰ在体内分布广泛，而CRABP-Ⅱ则较局限，其含量较CRABP-Ⅰ少[9]。在睾丸中，公认CRABP-Ⅰ位于生精细胞。本研究发现CRABP-Ⅱ mRNA位于SC，生精细胞中无表达。位于SC中的CRABP-Ⅱ mRNA水平有明显的周期性改变，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降。而Zheng[10]用Northern blot方法未能在成年SC中检测到CRABP-Ⅱ。这可能是方法敏感度不同导致的差异。既然成年大鼠SC中存在有少量RARα受体，理应有它的配体存在，RA在细胞内总是与CRABP结合存在，而SC中又无CRABP-Ⅰ，故本文认为存在CRABP-Ⅱ。Bucco等[11]发现在子宫上皮细胞和卵巢颗粒细胞中有CRABP-Ⅱ mRNA的表达，且其mRNA和蛋白水平随卵巢颗粒细胞增生而升高，而卵巢颗粒细胞与SC同源。结果尚需进一步验证。
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本实验中的两种Rs结合蛋白mRNA水平均为Ⅰ～Ⅵ期较低，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期较高，Ⅷ期末精子释放，生精周期后期的高表达提示它们在由圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用，其确切的作用机制还有待进一步的研究。
本文图2～4见插图11页
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39770778)
【作者简介】 陈咏梅(1970—)，女(汉族)，湖北襄樊人，医学硕士，讲师
作者单位：郑文利(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)
参考文献
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[2]Griswold MD,Bishop PD, Kim KH, et al. Function of vitamin A in normal and synchronized seminiferous tubules[J].Ann NY Acad Sci, 1989,564(1):154-172.
[3]Van Pelt AMM, de Rooij DG.Retinoic acid is able to reinitiate spermatogenesis in vitamin A-deficient rats and high doses support the full development of spermatogenic cells[J]. Endocrinology,1991,128(2):697-704.
[4]李尹雄.核酸的分离和纯化.见：卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术[M].北京：高等教育出版社，1993：95～154.
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[5]苏慧慈.原位杂交[M].北京：科学技术出版社，1994：115～157.
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, 百拇医药
[8]Rajan N,Blaner WS,Soprano DR, et al. Cellular retinol-binding protein messenger RNA levels in normal and retinoid-deficient rats[J].J Lipid Res,1990:31(2):821-829.
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[10]Zheng WL,Bucco RA, Schmitt MC, et al. Localization of cellular retinoic acid-binding protein(CRABP)Ⅱ and CRABP in developing rat testis[J].Endocrinology, 1996,137(6):5028-5035.
[11]Bucco RA,Zheng WL, Warlaw SA, et al.Regulation and localization of CRBP,RBP, CRABP, and CRABP-Ⅱ in the uterus of pseudopregnant rat [J]. Endocrinology, 1996,137(4):3111-3122.
【收稿日期】 1999-10-26
【修回日期】 2000-01-14, http://www.100md.com
单位：陈咏梅(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)；叶世隽(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)；黄玉苓(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)
关键词：支持细胞；细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ；细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ；睾丸
解剖学报000412 【摘要】 目的 研究大鼠睾丸细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ(CRBP-Ⅰ)及细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)mRNA水平与曲细精管生精上皮周期的相关关系。 方法 分别以地高辛标记的大鼠CRBP-Ⅰ及CRABP-ⅡcDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交，应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量。 结果 CRBP-Ⅰ及CRABP-Ⅱ mRNA在支持细胞(sertoli cell, SC)中表达。CRBP-Ⅰ mRNAⅦ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，至Ⅰ期骤然下降，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低，仅为高峰时期的28%。CRABP-Ⅱ mRNA Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降。 结论 SC可合成CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ，且合成量具有与生精周期相伴的周期性变化。总的来说Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期合成量较高，生精周期后期CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的高表达提示它们在圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用。CRBP-ⅠⅪ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用。总之，SC周期性分泌的蛋白可能是它调节周期性精子发生的重要因素。研究大鼠睾丸细胞内视黄醇结合蛋白-Ⅰ(CRBP-Ⅰ)及细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)mRNA水平与曲细精管生精上皮周期的相关关系。 方法 分别以地高辛标记的大鼠CRBP-Ⅰ及CRABP-ⅡcDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交，应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量。 结果 CRBP-Ⅰ及CRABP-Ⅱ mRNA在支持细胞(sertoli cell, SC)中表达。CRBP-Ⅰ mRNAⅦ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，至Ⅰ期骤然下降，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低，仅为高峰时期的28%。CRABP-Ⅱ mRNA Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降。 结论 SC可合成CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ，且合成量具有与生精周期相伴的周期性变化。总的来说Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期合成量较高，生精周期后期CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的高表达提示它们在圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用。CRBP-ⅠⅪ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用。总之，SC周期性分泌的蛋白可能是它调节周期性精子发生的重要因素。
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【中图分类号】 R322.6+4 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-339
THE PERIODIC CHANGE OF CELLULAR RETINOID BINDING
PROTEIN mRNA LEVEL IN RAT TESTIS DURING THE CYCLE
OF THE SEMINIFEROUS EPITHELIUM
CHEN Yong-mei YE Shi-jun HUANG Yu-ling ZHENG Wen-li
(Department of Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medcine, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective
To investigate the variation of the level of rat cellular retinol-binding protein-Ⅰ(CRBP-Ⅰ) and cellular retinoic acid binding protein-Ⅱ(CRABP-Ⅱ) mRNA in rat testis during the spermatogenetic cycle. Methods In situ hybridization was performed with DIG-labeled rat CRBP-Ⅰ or CRABP-Ⅱ cDNA probe on male SD rats frozen tissue sections. The laser density scanning system was used to quantitate the level of the positive signal. Results We found that both of CRBP-Ⅰ and CRABP-Ⅱ genes were expressed in the SC in the testis, and a stage-dependent variation was observed. No signal was found in the spermatogenetic cells. The CRBP-Ⅰ mRNA levels increased from stage Ⅶ-Ⅷ through stage Ⅸ-Ⅺ, reached a peak during stage Ⅺ Ⅰ-Ⅺ Ⅴ,and declined markedly between stage Ⅰ-Ⅵ, very slight hybridization signal was seen at stage Ⅱ-Ⅳ. The CRABP-Ⅱ mRNA levels were two folds lower at stage Ⅰ-Ⅵ than that detected at stage Ⅶ-Ⅺ Ⅴ,at stage Ⅶ-Ⅷ it reached a peak, thereafter declined. Conclusion The expression of both CRBP-Ⅰ and CRABP-Ⅱ genes was higher at stage Ⅶ-Ⅺ Ⅴthan at stage Ⅰ-Ⅵ. At the later of the spermatogenetic cycle the high expression of CRBP-Ⅰ, CRABP-Ⅱ suggested that they might play an role in the spermiogenesis from round sperm to elongated one. The peak of CRBP-Ⅰ mRNA levels at stage Ⅺ Ⅰ-Ⅺ Ⅴ indicated that it might play a key role in the process that the secondary spermatocytes finished meiosis and a new spermatogenetic cycle was initiated. The cyclically secreted proteins of SC may be one important factor by which SC influences spermatogenesis.
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【Key words】 Sertoli cell; Testis; Cellular retinol-binding protein-Ⅰ(CRBP-Ⅰ);Cellular retinoic acid binding protein-Ⅱ(CRABP-Ⅱ)
视黄醇(retinol, R,维生素A)和它的衍生物视黄醛(retinaldehyde)\,视黄酸(retinoic acid, RA)，统称为Retinoid(Rs)。很早人们就发现Rs是正常精子发生所必需的。如果食物中缺乏R(vitamin A deficient, VAD)，会导致大鼠曲细精管生精上皮极度退化，所有后期生精细胞均降解，仅剩下支持细胞、A1型精原细胞和少量前细线期精母细胞[1]。食物中恢复供应R或睾内注射高浓度RA则可逆转这一改变，启动一个同步化的精子发生[2，3]。CRBP及CRABP分别是R和RA在细胞内的结合蛋白，细胞内Rs结合蛋白在Rs转运和代谢中起着非常重要的作用，但这类蛋白在生精过程中的确切功能和作用机理仍不清楚。目前国外有少量研究，但尚属起步阶段，国内还未见报道。鉴于此，我们对大鼠生精过程中睾丸CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ mRNA水平进行了动态观察。
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材料和方法
1.材料
动物：SD健康雄性大鼠4只，体重400g左右，由药检所实验动物中心提供。
探针：大鼠CRBP-ⅠcDNA，长0.4kb，大鼠CRABP-ⅡcDNA，长0.42kb，载体均为pCRTMⅡ。
试剂盒：地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection kit)为Boehringer Mannbeim公司产品。
2.实验方法
2.1 cDNA片段的制备[4]：分别将含CRBP-Ⅰ、CRABP-Ⅱ的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选转化成功者小量制备质粒，用EcoRⅠ酶切鉴定。将含正确cDNA质粒的细菌克隆大量扩增，碱裂解法提取质粒，PEG法纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定A260和A280值，计算DNA浓度，其余置-20℃保存。用地高辛DNA标记和检测试剂盒标记和检测cDNA探针。
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2.2 组织冰冻切片的制备：大鼠断头处死后迅速取出睾丸，经液氮速冻后，于-20℃恒冷箱切片机中切片(厚8～10μm)，新鲜配制的4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，待切片晾干后存-20℃备用。于原位杂交切片的相邻切片进行PAS染色，在光镜下确定每个曲细精管属哪一期，以此为依据，确认原位杂交切片中各曲细精管的分期，本实验分曲细精管为Ⅰ、Ⅱ～Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ～Ⅷ、Ⅸ～Ⅺ、Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期7个阶段。
2.3 原位杂交[5]：室温下用含5 mmol/L MgCl\-2的PBS和2×SSC洗切片，预杂交液37℃预杂交1h，杂交液(含新变性的探针约2mg/L)于37℃杂交16h(以杂交液中除去探针作阴性对照)。2×SSC、1×SSC、0.5×SSC于室温下依次清洗，于封闭液中封闭30min，于抗体溶液中孵育2h，加入新鲜配制的显色液，暗处显色满意后，TE终止显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，镜检并摄片。
2.4 原位杂交结果的定量及统计学处理：采用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对原位杂交结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为mRNA量的参数，数据以均数±标准误
±s表示，对灰度扫描数据进行方差分析和SNK检验，检验标准α＝0.05。, http://www.100md.com
结果
1.制备的质粒DNA的限制性内切酶酶切分析
用质粒转化大肠杆菌，小量制备质粒DNA后用EcoRⅠ消化，经琼脂糖凝胶电泳后可见分别有400bp和420bp的目的cDNA片段，与预期相符。
2.原位杂交的结果
2.1 CRBP-Ⅰ：蓝色颗粒状阳性杂交信号主要位于SC(图2)，且有明显的周期性改变，Leydig细胞中亦有表达，生精细胞中无表达。SC中的阳性信号Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，至Ⅰ期骤然下降，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低，仅为高峰时期的28%(图1)。方差分析显示各个阶段之间具有非常显著差异(P<0.01)，SNK检验显示其中Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期与Ⅰ、Ⅱ～Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期之间分别有显著差异(P<0.05)(附表)。
, 百拇医药 附表 大鼠睾丸SC中mRNA的灰度值(
±s)Table Gray level of mRNA in the SC of rat testis (
±s) 期StageⅠ
Ⅱ～Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ～Ⅷ
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Ⅸ～Ⅺ
Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ
CRBP-Ⅰ
0.15±0.02*
0.10±0.02*
0.15±0.01*
0.14±0.03*
0.22±0.05
0.24±0.05
0.36±0.07☆
CRABP-Ⅱ
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0.08±0.01*
0.10±0.02*
0.10±0.01*
0.13±0.02*
0.26±0.02☆
0.24±0.03☆
0.20±0.02☆
其中和☆之间有显著差异(P<0.05)。☆P<0.05compared with*
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图1 大鼠睾丸曲细精管上皮周期中mRNA相对平均灰度值
的变化〔AU.光密度单位(Arbitrary densitometric units)〕
Fig.1 Varation of the relative average grey level of
the specific hybridizable mRNA in the SC of the
seminiferous tubule of rat testis during the epithelial cycle.
2.2 CRABP-Ⅱ：蓝色颗粒状阳性杂交信号位于SC(图3)，且有明显的周期性改变，生精细胞中无表达。SC中的阳性信号Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降(图1)。方差分析显示各个阶段之间具有非常显著差异(P<0.01)，SNK检验显示其中Ⅶ～Ⅷ、Ⅸ～Ⅺ、Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期与Ⅰ、Ⅱ～Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期之间分别有显著差异(P<0.05)(表1)。
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2.3 阴性对照未见阳性杂交信号(图4)。
图2 CRBP-Ⅰ mRNA 在大鼠睾丸曲精管内的分布 ×200；
a示Ⅸ～Ⅺ期，b示Ⅰ期。BL.基膜 TL.管腔(下同)
Fig.2 Distribution of CRBP-Ⅰ mRNA in the seminiferous tubule of testis in the rat, as detected by in situ hybridization with CRBP-Ⅰ cDNA probe ×200; a,stage Ⅸ～Ⅺ b,stage Ⅰ; Bl,basal lamina TL,tubular lumen
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图3 CRBP-Ⅱ mRNA 在大鼠睾丸曲精管内的分布 ×200；
a示Ⅻ～ⅩⅣ期，b示Ⅱ～Ⅳ期。
Fig.3 Distribution of CRBP-Ⅱ mRNA in the seminiferous tubule of testis in the rat, as detected by in situ hybridization with CRBP-Ⅱ cDNA probe ×200; a,stage Ⅻ～ⅩⅣ b,stage Ⅱ～Ⅳ; Bl,basal lamina TL,tubular lumen
图4 阴性对照 ×200
Fig.4 Negative control of in situ hybridization on testicular tissue ×200; Bl,basal lamina TL,tubular lumen
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讨 论
CRBP有两种亚型，CRBP-Ⅰ及CRBP-Ⅱ。CRBP-Ⅱ仅于成年大鼠的小肠中发现，而CRBP-Ⅰ在体内多种组织中大量存在，且其蛋白质与mRNA水平有很好的对应关系[6]。本研究表明，CRBP-Ⅰ mRNA主要位于SC，Leydig细胞中亦有表达，生精细胞中无表达。位于SC中的CRBP-Ⅰ mRNA水平有明显的周期性改变，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期处于高水平，Ⅺ Ⅰ～Ⅺ Ⅴ期达到高峰，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，其中Ⅱ～Ⅳ期最低。这与Rajan等[7]用同位素标记的CRBP-Ⅰ cRNA探针研究发现CRBP-Ⅰ mRNA Ⅹ～Ⅺ Ⅱ期达高峰，Ⅰ～Ⅲ期骤降的周期性变化相符合。免疫组织化学及体外分离培养细胞试验均证实CRBP-Ⅰ蛋白主要位于SC，Leydig细胞及附睾头部近端的主细胞中也存在。Rajan[7]等还发现CRBP-Ⅰ蛋白水平峰值在Ⅹ Ⅱ-Ⅲ期，Ⅳ～Ⅶ期骤降。可见蛋白周期略滞后于mRNA周期，说明蛋白周期正是其mRNA水平周期性变动的反应。其Ⅹ Ⅱ～Ⅺ Ⅴ期的峰值显示它对于次级精母细胞减数分裂的完成、新一轮生精周期的开始起着非常重要的作用。
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一旦R进入SC，即与CRBP-Ⅰ结合，在正常情况下，血浆R及RBP水平恒定，摄入R依赖于细胞中的载脂CRBP-Ⅰ。在生精过程中，各期生精细胞对R的需求可能不同，当R因代谢从载脂CRBP-Ⅰ中游离出来时，细胞中CRBP-Ⅰ的水平就会发生变化，这可能是其周期性变化的原因，提示其对精子发生的重要意义。CRBP-Ⅰ的表达受R营养状况的调节，在R缺乏(vitamin-A-deficient, VAD)动物，CRBP-Ⅰ mRNA水平明显下降，补充R则可使之很快恢复到正常水平。故推测R可直接影响细胞内CRBP-Ⅰ基因的表这，后者也许是一个R导致的早期应答基因[8]。CRBP-Ⅰ的确切功能仍未明了，但SC中的CRBP-Ⅰ可能与R的内摄及酯化、R对SC的直接作用或转运R到发育中的生精细胞有关。
CRABP参与RA信号传导，它也有两种亚型：CRABP-Ⅰ和CRABP-Ⅱ，CRABP-Ⅰ在体内分布广泛，而CRABP-Ⅱ则较局限，其含量较CRABP-Ⅰ少[9]。在睾丸中，公认CRABP-Ⅰ位于生精细胞。本研究发现CRABP-Ⅱ mRNA位于SC，生精细胞中无表达。位于SC中的CRABP-Ⅱ mRNA水平有明显的周期性改变，Ⅰ～Ⅵ期为低水平，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期水平增加1倍以上，其中Ⅶ～Ⅷ期达到高峰，随后缓慢下降。而Zheng[10]用Northern blot方法未能在成年SC中检测到CRABP-Ⅱ。这可能是方法敏感度不同导致的差异。既然成年大鼠SC中存在有少量RARα受体，理应有它的配体存在，RA在细胞内总是与CRABP结合存在，而SC中又无CRABP-Ⅰ，故本文认为存在CRABP-Ⅱ。Bucco等[11]发现在子宫上皮细胞和卵巢颗粒细胞中有CRABP-Ⅱ mRNA的表达，且其mRNA和蛋白水平随卵巢颗粒细胞增生而升高，而卵巢颗粒细胞与SC同源。结果尚需进一步验证。
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本实验中的两种Rs结合蛋白mRNA水平均为Ⅰ～Ⅵ期较低，Ⅶ～Ⅺ Ⅴ期较高，Ⅷ期末精子释放，生精周期后期的高表达提示它们在由圆形精子向长形精子转变的过程中发挥作用，其确切的作用机制还有待进一步的研究。
本文图2～4见插图11页
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39770778)
【作者简介】 陈咏梅(1970—)，女(汉族)，湖北襄樊人，医学硕士，讲师
作者单位：郑文利(中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室，北京 100005)
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【收稿日期】 1999-10-26
【修回日期】 2000-01-14, http://www.100md.com