钒酸盐氧化法测定总胆红素及直接胆红素的实验评价
作者：蒋兴亮 唐中 周京国
单位：川北医学院附属医院检验科 南充 637000
关键词：总胆红素；直接胆红素；评价
川北医学院学报/990251提 要 为了解钒酸盐氧化法测定血清胆红素的可行性，进行方法学评价。结果：总胆红素测定平均回收率为100.6%，线性达620μmol/L，批内CV%为2.1%，批间CV为3.9%，与咖啡因法比较，Y＝0.991x+2.01，t=2.11，P>0.2，r=0.998。直接胆红素线性达340μmol/L，批内CV 2.3%，批间CV 4.1%与改良Doumas法比较，r=0.993x+0.99，t=1.47,P>0.2,r=0.997。轻度乳糜血，Hb 4g/L以下对测定无干扰，试剂至少稳定两个月。结果表明钒酸盐氧化法测定血清胆红素具有灵敏、准确、重复性好等特点，可作为常规法使用。
, 百拇医药 文章编号：1005-3697(1999)02-0069-02 中图分类号：R446.1 文献标识码：A
血清胆红素测定是临床医学中的一项重要常规检测项目，是黄疸性疾病诊断与鉴别诊断的重要指标，对了解疾病的发展有一定意义。目前测定胆红素的方法主要有两种：一种为传统偶氮法[1]，此法操作简便，是现今大多实验室采用的常规方法，但特异性低，干扰因素多，尤其是总胆红素因使用不同加速剂而方法间结果有较大差异。另一方法为酶法[2]，准确，特异但价格昂贵，目前难于普及。因此寻找简便准确的测定方法仍是检验界关心的问题。我们对科华—东菱公司新近推出的钒酸盐氧化法测定血清胆红素试剂盒的性能进行了实验评价，认为该双试剂法适宜于自动生化分析，现报告如下：
1 材料与方法
1.1 反应原理 样品中总胆红素、直接胆红素在PH3.0附近，以及在钒酸盐和表面活性剂作用下，氧化为胆绿素，同时胆红素特有的黄色消失，测定胆红素氧化前后吸光度之差，可计算出样品中总、直接胆红素浓度。
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1.2 材料
1.2.1 试剂：①钒酸盐氧化法测定总、直接胆红素试剂盒(批号分别为980601，980601)，上海科华—东菱公司产品。②重氮法测定血清总、直接胆红素试剂盒(批号分别为442745，439715)，美国贝克曼产品，并用各自标准品。③定值血清，德国宝灵曼产品(批号为1939621)。
1.2.2 仪器 美国贝克曼cx7全自动生化分析仪。
1.3 仪器测定参数 ①双波长450/550nm，温度37℃，②终点法2，吸光度下降法，③方法：第一试剂225ml与标本8ml，孵育5min,读取一次吸光度，同时加入第二试剂56ul，孵育5min,第二次读取吸光度，前后两次吸光度之差与标准吸光度之差比较，可得样品胆红素量。
2 实验结果
1.2 测定线性范围 取病人高值标本，总胆红素(TBil)620μmol/L，直接胆红素(DBil)340μmol/L，用生理盐水进行倍比稀释，用钒酸盐氧化法测定TBil及DBil含量，结果见表1：
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从表1可知，总胆红素在620μmol/L内保持良好线性，Y=0.00221x-0.001,r=0.999,P<0.05。直接胆红素线性可达340μmol/L，Y=0.00121x+0.002,r=0.998,P<0.05。
表1 钒酸盐氧化法测定TBil及DBil线性范围(μmol/L) 项 目
原液
1∶2
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
1∶64
1∶128
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TBil
620.0
305.0
151.0
74.0
35.5
17.0
8.1
3.9
DBil
340.0
168.0
82.0
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40.0
19.1
8.9
4.0
1.8
2.2 精密度试验 一份TBil为82.1μmol/L，DBil为32.3μmol/L的质控血清，测定20次，结果(x±S)：TBil 81.0μmol/L±1.80，CV为2.1%；DBil 32.4±0.76，CV为2.3%，用此血清，每天测定一次，连续测定25天，结果(x±S)：TBil 79.8±3.10μmol/L，CV为3.9%，DBil 31.9±1.30μmol/L，CV为4.1%。2.3 回收率试验 分别取TBil为25.3和TBil为41.2μmol/L的两份血清，加入浓度为513.0μmol/L胆红素标准液各0.1ml，用钒酸盐氧化法测得回收率分别为102.%和99.2%，平均回收率为100.6%。
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2.4 方法比较 用钒酸盐氧化法测定TBil与咖啡因法比较，同时测定临床标本113份。结果(
±S)：咖啡因法36.1±51.2μmol/L，钒酸盐氧化法36.6±51.6μmol/L，Y=0.991x+2.01,t=2.11,P>0.2，r=0.998。钒酸盐氧化法测DBil与改良Doumas法比较。结果(±S)：改良Doumas法22.3±39.1μmol/L，钒酸盐法22.6±40.3μmol/L，Y=0.993x+0.99,t=1.47,P>0.2，r=0.997。
2.5 干扰试验 ①溶血干扰：取三份临床胆红素高、中、低标本，用钒酸盐法测定TBil及DBil然后用力挤压塑料试管，造成不同程度溶血，分别测定Hb,TBil及DBil，结果Hb在4g/L以内时对TBil及DBil不产生干扰。②两份胆红素标本，加入不同浓度乳剂，甘油三酯为8.9mmol/L时不干扰测定。
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2.6 稳定性试验 将宝灵曼质控血清每天用钒酸盐法测定，间隔测定60天，观察试剂上机后的稳定性，结果见表2。表2 TBil及DBil试剂的稳定性试验(μmol/L) 项目
第1天
第2天
第3天
第7天
第14天
第28天
第45天
第60天
TBil
34.1
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34.2
37.9
34.0
34.0
33.9
34.0
33.9
DBil
6.2
6.1
6.1
5.9
6.0
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5.9
6.0
5.9
从表2可见，钒酸盐法试剂的稳定性至少在60天内。
2.7 参考值 测定120名我院体检职工标本，分别用咖啡因法及钒酸盐法测定，结果(μmol/L)：TBil咖啡因法4.1～21.2μmol/L，钒酸盐法4.2～21.5μmol/L，DBil：改良Doumas法0～5.2，钒酸盐法0～5.5。
3 小结
钒酸盐氧化法测定胆红素具有特异性好、线性范围宽，测定重现性好等优点，各项指标符合方法学要求，与现在大多实验室普遍采用的重氮偶合法具有可比性且存在良好线性关系。适宜于具有双试剂功能的生化分析上仪上机使用，因而是值得推荐的胆红素常规测定方法。
参考文献
1 叶应妩、王毓三.全国临床检验规程.第二版.南京：东南大学出版社，1997；248～250
2 Perry B,et al.Measurement of total bilirubin by ue of bilimbin oxidase,clin chem,1986;32:329
(收稿日期：1999-03-09), 百拇医药
单位：川北医学院附属医院检验科 南充 637000
关键词：总胆红素；直接胆红素；评价
川北医学院学报/990251提 要 为了解钒酸盐氧化法测定血清胆红素的可行性，进行方法学评价。结果：总胆红素测定平均回收率为100.6%，线性达620μmol/L，批内CV%为2.1%，批间CV为3.9%，与咖啡因法比较，Y＝0.991x+2.01，t=2.11，P>0.2，r=0.998。直接胆红素线性达340μmol/L，批内CV 2.3%，批间CV 4.1%与改良Doumas法比较，r=0.993x+0.99，t=1.47,P>0.2,r=0.997。轻度乳糜血，Hb 4g/L以下对测定无干扰，试剂至少稳定两个月。结果表明钒酸盐氧化法测定血清胆红素具有灵敏、准确、重复性好等特点，可作为常规法使用。
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血清胆红素测定是临床医学中的一项重要常规检测项目，是黄疸性疾病诊断与鉴别诊断的重要指标，对了解疾病的发展有一定意义。目前测定胆红素的方法主要有两种：一种为传统偶氮法[1]，此法操作简便，是现今大多实验室采用的常规方法，但特异性低，干扰因素多，尤其是总胆红素因使用不同加速剂而方法间结果有较大差异。另一方法为酶法[2]，准确，特异但价格昂贵，目前难于普及。因此寻找简便准确的测定方法仍是检验界关心的问题。我们对科华—东菱公司新近推出的钒酸盐氧化法测定血清胆红素试剂盒的性能进行了实验评价，认为该双试剂法适宜于自动生化分析，现报告如下：
1 材料与方法
1.1 反应原理 样品中总胆红素、直接胆红素在PH3.0附近，以及在钒酸盐和表面活性剂作用下，氧化为胆绿素，同时胆红素特有的黄色消失，测定胆红素氧化前后吸光度之差，可计算出样品中总、直接胆红素浓度。
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1.2 材料
1.2.1 试剂：①钒酸盐氧化法测定总、直接胆红素试剂盒(批号分别为980601，980601)，上海科华—东菱公司产品。②重氮法测定血清总、直接胆红素试剂盒(批号分别为442745，439715)，美国贝克曼产品，并用各自标准品。③定值血清，德国宝灵曼产品(批号为1939621)。
1.2.2 仪器 美国贝克曼cx7全自动生化分析仪。
1.3 仪器测定参数 ①双波长450/550nm，温度37℃，②终点法2，吸光度下降法，③方法：第一试剂225ml与标本8ml，孵育5min,读取一次吸光度，同时加入第二试剂56ul，孵育5min,第二次读取吸光度，前后两次吸光度之差与标准吸光度之差比较，可得样品胆红素量。
2 实验结果
1.2 测定线性范围 取病人高值标本，总胆红素(TBil)620μmol/L，直接胆红素(DBil)340μmol/L，用生理盐水进行倍比稀释，用钒酸盐氧化法测定TBil及DBil含量，结果见表1：
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从表1可知，总胆红素在620μmol/L内保持良好线性，Y=0.00221x-0.001,r=0.999,P<0.05。直接胆红素线性可达340μmol/L，Y=0.00121x+0.002,r=0.998,P<0.05。
表1 钒酸盐氧化法测定TBil及DBil线性范围(μmol/L) 项 目
原液
1∶2
1∶4
1∶8
1∶16
1∶32
1∶64
1∶128
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TBil
620.0
305.0
151.0
74.0
35.5
17.0
8.1
3.9
DBil
340.0
168.0
82.0
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40.0
19.1
8.9
4.0
1.8
2.2 精密度试验 一份TBil为82.1μmol/L，DBil为32.3μmol/L的质控血清，测定20次，结果(x±S)：TBil 81.0μmol/L±1.80，CV为2.1%；DBil 32.4±0.76，CV为2.3%，用此血清，每天测定一次，连续测定25天，结果(x±S)：TBil 79.8±3.10μmol/L，CV为3.9%，DBil 31.9±1.30μmol/L，CV为4.1%。2.3 回收率试验 分别取TBil为25.3和TBil为41.2μmol/L的两份血清，加入浓度为513.0μmol/L胆红素标准液各0.1ml，用钒酸盐氧化法测得回收率分别为102.%和99.2%，平均回收率为100.6%。
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2.4 方法比较 用钒酸盐氧化法测定TBil与咖啡因法比较，同时测定临床标本113份。结果(
±S)：咖啡因法36.1±51.2μmol/L，钒酸盐氧化法36.6±51.6μmol/L，Y=0.991x+2.01,t=2.11,P>0.2，r=0.998。钒酸盐氧化法测DBil与改良Doumas法比较。结果(±S)：改良Doumas法22.3±39.1μmol/L，钒酸盐法22.6±40.3μmol/L，Y=0.993x+0.99,t=1.47,P>0.2，r=0.997。2.5 干扰试验 ①溶血干扰：取三份临床胆红素高、中、低标本，用钒酸盐法测定TBil及DBil然后用力挤压塑料试管，造成不同程度溶血，分别测定Hb,TBil及DBil，结果Hb在4g/L以内时对TBil及DBil不产生干扰。②两份胆红素标本，加入不同浓度乳剂，甘油三酯为8.9mmol/L时不干扰测定。
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2.6 稳定性试验 将宝灵曼质控血清每天用钒酸盐法测定，间隔测定60天，观察试剂上机后的稳定性，结果见表2。表2 TBil及DBil试剂的稳定性试验(μmol/L) 项目
第1天
第2天
第3天
第7天
第14天
第28天
第45天
第60天
TBil
34.1
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34.2
37.9
34.0
34.0
33.9
34.0
33.9
DBil
6.2
6.1
6.1
5.9
6.0
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5.9
6.0
5.9
从表2可见，钒酸盐法试剂的稳定性至少在60天内。
2.7 参考值 测定120名我院体检职工标本，分别用咖啡因法及钒酸盐法测定，结果(μmol/L)：TBil咖啡因法4.1～21.2μmol/L，钒酸盐法4.2～21.5μmol/L，DBil：改良Doumas法0～5.2，钒酸盐法0～5.5。
3 小结
钒酸盐氧化法测定胆红素具有特异性好、线性范围宽，测定重现性好等优点，各项指标符合方法学要求，与现在大多实验室普遍采用的重氮偶合法具有可比性且存在良好线性关系。适宜于具有双试剂功能的生化分析上仪上机使用，因而是值得推荐的胆红素常规测定方法。
参考文献
1 叶应妩、王毓三.全国临床检验规程.第二版.南京：东南大学出版社，1997；248～250
2 Perry B,et al.Measurement of total bilirubin by ue of bilimbin oxidase,clin chem,1986;32:329
(收稿日期：1999-03-09), 百拇医药