不同免疫方法制备抗血清的效果比较
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南京医科大学学报 2000年第5期第20卷 论著
作者：童明庆 赵旺胜 蒋理 文怡 杨鹏云 钟兰香
单位：南京医科大学第一附属医院检验中心，南京 210029
关键词：重组葡激酶；免疫方案；补体C3
南京医科大学学报000505
摘 要 目的 比较不同免疫方法制备抗血清的效果以选取最佳免疫程序。方法 以菊糖-C3复合物和重组葡激酶分别作为颗粒性和可溶性抗原，采用多种途径对20只家兔进行免疫，并采用琼脂免疫扩散法测定抗血清的滴度。结果 多点肌肉、淋巴结和皮内注射所获抗血清的平均几何滴度分别为1∶22.6、1∶11.3和1∶8。结论 多点肌肉注射是一个好的免疫程序。
中图号 R973+.2; R392.7
, 百拇医药
A Comparison of Immunization Protocols in Preparing Antisera
Tong Minqing, Zhao Wangsheng, Jiang Li,et al.
Department of Clinical Laboratories, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029
Abstract Objective To compare immunization protocols in preparing antisera and select the best protocol. Methods 20 rabbits were immunized with inulin-C3 complex and recombinant staphylokinase as granular and soluble antigens respectively by different routes. The antiserum titers were detected by double immunodiffusion in agar gel. Results The geometric mean of antiserum titers were 1∶22.6, 1∶11.3 and 1∶8 corresponding to unlike immunization routes intramuscular, intralymphaden and intradermal. Conclusion The multisite intramuscular injection is one of the best immunization protocols.
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Key words recombinant staphylokinase; immunization protocol; C3 component of complement
以抗原免疫动物制备抗血清的方法很多，究竟哪种免疫途径较好，众说纷纭，早年主张淋巴结内注射，近10年来提倡多点皮内注射。为了选择一个既方便又高效的免疫途径，我们对常用的几种途径进行了免疫效果的比较分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
福氏完全佐剂(FCA) Sigma产品，批号37H8910。
新西兰大耳兔 1.5～2.0 kg/只，共20只，均为雄性，每种免疫方法用2只兔子。
, 百拇医药
C3抗原制备 C3抗原制备按文献[1，2]方法进行，取菊糖0.5 g研细，用缓冲生理盐水洗3次后，加到30 ml新鲜人混合血清中混匀，37℃水浴1 h，其间每10 min混匀1次，然后3 000 r/min离心20 min，弃去上清，沉淀用缓冲生理盐水洗涤6次后，用
25 ml缓冲生理盐水配成悬液，每管5 ml分装、20℃保存。临用前加等量FCA充分乳化，直到抗原完全乳化成油包水型的乳液。
重组葡激酶(r-SAK，分子质量12 000 ku，成都金鹏生物工程公司提供)。免疫原制备：取2.5 ml r-SAK(2 g/L)加入等量的FCA乳化成油包水乳剂。
1.2 免疫方法
方法一：用1.0 ml抗原乳剂在兔子背部皮内多点(6点)免疫，10天和1个月后分别用相同剂量抗原乳剂加强免疫1次。
, 百拇医药
方法二：用1.0 ml抗原乳剂在兔子背部皮下多点(6点)免疫，10天和1个月后分别用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
方法三：用1.0 ml抗原乳剂在兔子肌肉多点(前后腿、臀部)免疫，10天和1个月后分别用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
方法四：用1.0 ml抗原乳剂在兔子足背(两后腿)免疫，10天和1个月后分别在窝肿大的淋巴结内用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
方法五：用1.0 ml FCA在兔子足背(两后腿)预免疫，10天和1个月后分别在窝肿大的淋巴结内用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
1.3 抗血清效价测定
最后1次加强免疫22天后耳静脉采血分离血清，抗血清效价测定采用双向免疫扩散法，用生理盐水配制1.2%琼脂浇板(载玻片)，每板4 ml，待琼脂凝固后，用打孔器打成梅花孔，中心孔加抗原1 μg(10 μl)，周围孔依次加入原倍、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32的待测抗血清，将加过样的琼脂凝胶板放入湿盒中，置37℃ 24 h后观察结果，以出现沉淀线的抗血清最高稀释度为抗血清滴度。
, 百拇医药
2 结 果
见表1。
表1 各种免疫途径制备的抗血清滴度比较 免疫原
多点皮内
多点皮下
多点肌肉
足背加淋巴结
淋巴结(足背预免疫)
菊糖-C\-3
1∶32
1∶16
1∶32.0
, 百拇医药
1∶32.0
1∶4
r-SAK
1∶2
-*
1∶16.0
1∶4.0
1∶4
几何均数
1∶8
1∶4
1∶22.6
1∶11.3
, 百拇医药
1∶4
示未检出抗体。
3 讨 论
菊糖-C3复合物和r-SAK是两种不同性质的免疫原，菊糖-C3复合物系不溶性颗粒抗原；r-SAK是小分子蛋白(12 000 ku)可溶性抗原。在采用相同途径和方法免疫动物时，菊糖-C3获得抗血清效价较高，可能是由于颗粒性抗原更容易被抗原提呈细胞摄取、加工并提呈给B细胞的缘故。
从两种抗原通过各种免疫途径获得的抗血清滴度的几何均数来看，多点肌肉注射效价最高，足背加淋巴结及多点皮内次之，多点皮下和足背预免疫加淋巴结免疫较差。
目前一般认为多点皮内注射的免疫途径效果较好[3，4]，其依据是皮肤内有较多的抗原提呈细胞，如朗格汉斯细胞，有利于抗原的摄取、加工和提呈。但从本研究结果来看，皮内多点并非最好的途径，我们以往的经验亦是如此，几乎每次皮内多点免疫之后，动物的皮肤均表现为不同程度的溃疡，皮损累及表皮，造成环境微生物的感染，这些环境微生物作为非目的免疫原而刺激机体免疫系统，势必要与目的免疫原竞争淋巴细胞库中的免疫活性细胞，使得目的免疫原可能活化的免疫活性细胞减少，以致抗体产生量并不满意。
, 百拇医药
肌肉注射法免疫家兔方法简单而易于掌握，由于肌肉是一种相对致密的组织，抗原注入肌肉后被肌肉包裹而缓慢地释放，有利于持续地刺激免疫系统；另外，肌肉注射法不会造成皮肤损坏和感染，也就不会出现非目的抗原的干扰。研究结果显示肌肉免疫法效果最好，无论是颗粒性抗原(菊糖-C3复合物)还是可溶性抗原(r-SAK)，所获抗血清效价都是最高，应引起我们足够的重视，值得推崇。
皮下注射法可能是由于抗原在疏松的皮下组织中易于较快地扩散和清除，故不能持续刺激免疫系统而产生较高效价的抗体；另外，抗原释放太快亦可能造成免疫耐受。预免疫法由于第一次预免疫时佐剂中不含抗原，故免疫的时间相应较短，以致抗体效价未能足够升高。
本研究由于使用动物较少，实验中偶然因素的影响不可避免，故实验结论仅是初步的。
国家1035工程“九五”科技攻关基金资助项目(No 96-901-01-44)
, 百拇医药
参考文献
1，童明庆，金再望.分补体C3的测定及其在流行性出血热中的初步应用.流行病学杂志，1979，3：247
2，武建国主编.实用临床免疫学检验.南京：江苏科学技术出版社，1989.196
3，Johnstone A, Thorpe R. Immunochemistry in Practice. 2nd ed. London: Blackwell Scientific Publication， 1987.30
4，陶义训主编.免疫学和免疫学检验.第2版.北京：人民卫生出版社，1995.75
(1999-11-17收稿), http://www.100md.com
单位：南京医科大学第一附属医院检验中心，南京 210029
关键词：重组葡激酶；免疫方案；补体C3
南京医科大学学报000505
摘 要 目的 比较不同免疫方法制备抗血清的效果以选取最佳免疫程序。方法 以菊糖-C3复合物和重组葡激酶分别作为颗粒性和可溶性抗原，采用多种途径对20只家兔进行免疫，并采用琼脂免疫扩散法测定抗血清的滴度。结果 多点肌肉、淋巴结和皮内注射所获抗血清的平均几何滴度分别为1∶22.6、1∶11.3和1∶8。结论 多点肌肉注射是一个好的免疫程序。
中图号 R973+.2; R392.7
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A Comparison of Immunization Protocols in Preparing Antisera
Tong Minqing, Zhao Wangsheng, Jiang Li,et al.
Department of Clinical Laboratories, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029
Abstract Objective To compare immunization protocols in preparing antisera and select the best protocol. Methods 20 rabbits were immunized with inulin-C3 complex and recombinant staphylokinase as granular and soluble antigens respectively by different routes. The antiserum titers were detected by double immunodiffusion in agar gel. Results The geometric mean of antiserum titers were 1∶22.6, 1∶11.3 and 1∶8 corresponding to unlike immunization routes intramuscular, intralymphaden and intradermal. Conclusion The multisite intramuscular injection is one of the best immunization protocols.
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Key words recombinant staphylokinase; immunization protocol; C3 component of complement
以抗原免疫动物制备抗血清的方法很多，究竟哪种免疫途径较好，众说纷纭，早年主张淋巴结内注射，近10年来提倡多点皮内注射。为了选择一个既方便又高效的免疫途径，我们对常用的几种途径进行了免疫效果的比较分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
福氏完全佐剂(FCA) Sigma产品，批号37H8910。
新西兰大耳兔 1.5～2.0 kg/只，共20只，均为雄性，每种免疫方法用2只兔子。
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C3抗原制备 C3抗原制备按文献[1，2]方法进行，取菊糖0.5 g研细，用缓冲生理盐水洗3次后，加到30 ml新鲜人混合血清中混匀，37℃水浴1 h，其间每10 min混匀1次，然后3 000 r/min离心20 min，弃去上清，沉淀用缓冲生理盐水洗涤6次后，用
25 ml缓冲生理盐水配成悬液，每管5 ml分装、20℃保存。临用前加等量FCA充分乳化，直到抗原完全乳化成油包水型的乳液。
重组葡激酶(r-SAK，分子质量12 000 ku，成都金鹏生物工程公司提供)。免疫原制备：取2.5 ml r-SAK(2 g/L)加入等量的FCA乳化成油包水乳剂。
1.2 免疫方法
方法一：用1.0 ml抗原乳剂在兔子背部皮内多点(6点)免疫，10天和1个月后分别用相同剂量抗原乳剂加强免疫1次。
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方法二：用1.0 ml抗原乳剂在兔子背部皮下多点(6点)免疫，10天和1个月后分别用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
方法三：用1.0 ml抗原乳剂在兔子肌肉多点(前后腿、臀部)免疫，10天和1个月后分别用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
方法四：用1.0 ml抗原乳剂在兔子足背(两后腿)免疫，10天和1个月后分别在窝肿大的淋巴结内用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
方法五：用1.0 ml FCA在兔子足背(两后腿)预免疫，10天和1个月后分别在窝肿大的淋巴结内用相同剂量的抗原乳剂加强免疫1次。
1.3 抗血清效价测定
最后1次加强免疫22天后耳静脉采血分离血清，抗血清效价测定采用双向免疫扩散法，用生理盐水配制1.2%琼脂浇板(载玻片)，每板4 ml，待琼脂凝固后，用打孔器打成梅花孔，中心孔加抗原1 μg(10 μl)，周围孔依次加入原倍、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32的待测抗血清，将加过样的琼脂凝胶板放入湿盒中，置37℃ 24 h后观察结果，以出现沉淀线的抗血清最高稀释度为抗血清滴度。
, 百拇医药
2 结 果
见表1。
表1 各种免疫途径制备的抗血清滴度比较 免疫原
多点皮内
多点皮下
多点肌肉
足背加淋巴结
淋巴结(足背预免疫)
菊糖-C\-3
1∶32
1∶16
1∶32.0
, 百拇医药
1∶32.0
1∶4
r-SAK
1∶2
-*
1∶16.0
1∶4.0
1∶4
几何均数
1∶8
1∶4
1∶22.6
1∶11.3
, 百拇医药
1∶4
示未检出抗体。
3 讨 论
菊糖-C3复合物和r-SAK是两种不同性质的免疫原，菊糖-C3复合物系不溶性颗粒抗原；r-SAK是小分子蛋白(12 000 ku)可溶性抗原。在采用相同途径和方法免疫动物时，菊糖-C3获得抗血清效价较高，可能是由于颗粒性抗原更容易被抗原提呈细胞摄取、加工并提呈给B细胞的缘故。
从两种抗原通过各种免疫途径获得的抗血清滴度的几何均数来看，多点肌肉注射效价最高，足背加淋巴结及多点皮内次之，多点皮下和足背预免疫加淋巴结免疫较差。
目前一般认为多点皮内注射的免疫途径效果较好[3，4]，其依据是皮肤内有较多的抗原提呈细胞，如朗格汉斯细胞，有利于抗原的摄取、加工和提呈。但从本研究结果来看，皮内多点并非最好的途径，我们以往的经验亦是如此，几乎每次皮内多点免疫之后，动物的皮肤均表现为不同程度的溃疡，皮损累及表皮，造成环境微生物的感染，这些环境微生物作为非目的免疫原而刺激机体免疫系统，势必要与目的免疫原竞争淋巴细胞库中的免疫活性细胞，使得目的免疫原可能活化的免疫活性细胞减少，以致抗体产生量并不满意。
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肌肉注射法免疫家兔方法简单而易于掌握，由于肌肉是一种相对致密的组织，抗原注入肌肉后被肌肉包裹而缓慢地释放，有利于持续地刺激免疫系统；另外，肌肉注射法不会造成皮肤损坏和感染，也就不会出现非目的抗原的干扰。研究结果显示肌肉免疫法效果最好，无论是颗粒性抗原(菊糖-C3复合物)还是可溶性抗原(r-SAK)，所获抗血清效价都是最高，应引起我们足够的重视，值得推崇。
皮下注射法可能是由于抗原在疏松的皮下组织中易于较快地扩散和清除，故不能持续刺激免疫系统而产生较高效价的抗体；另外，抗原释放太快亦可能造成免疫耐受。预免疫法由于第一次预免疫时佐剂中不含抗原，故免疫的时间相应较短，以致抗体效价未能足够升高。
本研究由于使用动物较少，实验中偶然因素的影响不可避免，故实验结论仅是初步的。
国家1035工程“九五”科技攻关基金资助项目(No 96-901-01-44)
, 百拇医药
参考文献
1，童明庆，金再望.分补体C3的测定及其在流行性出血热中的初步应用.流行病学杂志，1979，3：247
2，武建国主编.实用临床免疫学检验.南京：江苏科学技术出版社，1989.196
3，Johnstone A, Thorpe R. Immunochemistry in Practice. 2nd ed. London: Blackwell Scientific Publication， 1987.30
4，陶义训主编.免疫学和免疫学检验.第2版.北京：人民卫生出版社，1995.75
(1999-11-17收稿), http://www.100md.com