氨溴索对哮喘豚鼠肺表面活性物质系统超微结构的影响
作者：邓琳 方凤 方超萍 毋永正
单位：方凤(第二军医大学长海医院儿科，上海 200433)；方超萍(第二军医大学长海医院儿科，上海 200433)；毋永正(第二军医大学长海医院儿科，上海 200433)；邓琳(湖北省宜昌市第一人民医院儿科，宜昌市 443000)
关键词：氨溴索；哮喘；肺表面活性剂；超微结构
第二军医大学学报000226 摘 要：目的：观察氨溴索对哮喘豚鼠肺表面活性物质系统(pulmonary surfactant system,PSS)超微结构的影响。方法：16只豚鼠分4组，即正常组、致敏组、哮喘组、哮喘+氨溴索组，采用电子显微镜组织化学法观察各组PSS超微结构的变化。结果：电镜下超微结构显示：(1)哮喘组PSS层丧失正常的连续结构，出现断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象，肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化。(2)哮喘+氨溴索组PSS层基本连续，肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体少量空泡化。(3)致敏组PSS超微结构与哮喘+氨溴索组相似。结论：PSS超微结构于哮喘后出现明显异常。应用氨溴索可减轻哮喘后PSS超微结构的异常变化。
, 百拇医药
分类号：R 562.25 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0180-02
Effects of ambroxol on pulmonary surfactant system
ultrastructure in asthma guinea-pigs
FANG Feng
(Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
FANG Chao-Ping
, 百拇医药
(Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WU Yong-Zheng
(Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
DENG Lin
(Department of Pediatrics, the First People′s Hospital of Yichang,Yichang 443000, Hubei, China)
, 百拇医药
ABSTRACT：Objective: To explore the effects of ambroxol on pulmonary surfactant system(PSS) ultrastructure of asthma guinea-pigs. Methods: Sixteen guinea-pigs were divided into 4 groups: normal group,sensitized group,asthma group and asthma plus ambroxal treated group. We adopted electron microscope histochemistry method to observe the ultrastructure of PSS. Results: (1)The pulmonary surfactant layer lost its normal structure; congregated into pieces in the alveolar cavity and the lamellar bodies in type Ⅱ pneumonocytes were vacuolized in asthma group. (2) The pulmonary surfactant layer was continuous and the lamellar bodies in type Ⅱ pneumonocytes was slightly vacuolized in the asthma plus ambroxol treated group. (3) The ultrastructure of the sensitized group was similar to that of the asthma plus ambroxol treated group. Conclusion: The ultrastructure of PSS is obviously abnormal in asthma group. Ambroxol administration can reduce the ultrastructure change in PSS after asthma attack.
, 百拇医药
KEY WORDS：ambroxol; asthma; pulmonary surfactants; ultrastructure▲
近年来有资料表明，哮喘时存在肺表面活性物质相对不足或功能不良[1,2]。给予外源性肺表面活性物质可以缓解哮喘[3]。我们初步研究证实了这一关系的存在[4]，同时也观察到哮喘发作后肺泡Ⅱ型上皮细胞及肺表面活性物质层结构有异常改变。本研究观察肺表面活性物质刺激剂氨溴索对哮喘后肺表面活性物质系统(PSS)超微结构的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物及处理 体质量(300±50) g的健康雄性豚鼠(第二军医大学实验动物中心提供) 16只，随机分成正常组、致敏组、哮喘组、哮喘+氨溴索组，每组4只。哮喘组豚鼠腹腔注射10%卵蛋白(上海东风生物试剂厂生产)溶液100 mg/kg致敏，3周后以1%卵蛋白溶液超声雾化吸入激发哮喘，出现口唇青紫、呼吸急促等症状，形成哮喘模型。致敏组致敏方法同哮喘组，但3周后不予激发。哮喘+氨溴索组为致敏同时给予氨溴索7.5 mg/(kg.d)，每日2次插管喂食，持续3周，3周后予以1%卵蛋白溶液超声雾化激发哮喘。
, 百拇医药
1.2 肺组织电镜标本的制备
1.2.1 试剂 钌红一液：(1)钌红10 mg/ml；(2) 0.3 mol/L二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.30)；(3) 18%戊二醛；(4) 1.8% 单宁酸。将上述4种液体储存于4℃冰箱中备用，临用时按2∶2∶1∶1的比例配制混匀即可。钌红二液：(1) 钌红10 mg/ml； (2)0.3 mol/L二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.30)；(3)5.0%四氧化锇。将上述3种液体储存于4℃冰箱中备用，临用时按1∶1∶1的比例配制混匀即可。
1.2.2 取材 各组豚鼠铡头处死，立即剪开前胸壁取出肺脏，切取近肺门处截面约2 mm×10 mm肺组织条，放置在滴有钌红一液的硬纸板上，然后再从各条块切取大约1 mm×1 mm×1 mm的组织块投入有钌红二液的青霉素小瓶中，并用针筒对小瓶抽气，以排除组织内残留气体，直到组织块沉至瓶底。
1.2.3 电镜观察 固定，包埋，切片，染色采用Luft的钌红-四氧化锇复合染色法[5]，H-800透射电镜观察。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 哮喘后PSS超微结构改变 肺表面活性物质层丧失正常的连续结构，出现断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象；肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化。
2.2 哮喘+氨溴索组PSS超微结构改变 肺表面活性层基本连续；肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体少量空泡化(图1)。
图1 哮喘+氨溴索组PSS超微结构改变
Fig 1 Ultrastracture changes of PSS
in asthma plus ambroxol group
A: Ultrastructure changes of PSS in asthma+ambroxol group
, 百拇医药
(×20 000); B: Lemillaz bodies was slightly vacuolinged in type Ⅱ
pneumonocytes(×10 000)
2.3 致敏组PSS超微结构改变 致敏组PSS超微结构与哮喘+氨溴索组相似。
3 讨 论
PSS超微结构是由铺展在肺泡表面的活性物质层与合成和分泌表面活性物质的Ⅱ型上皮细胞构成[6], 肺表面活性物质在肺泡Ⅱ型上皮细胞的内质网中合成，通过高尔基复合体转运到板层体中贮存，因此板层体形态改变提示肺表面活性物质合成的增减。板层体通过胞吐作用被分泌入肺泡腔，最终形成吸附在末梢细支气管和肺泡表面的单分子膜，发挥降低末梢细支气管、肺泡气-液表面张力，防止呼气末末梢细支气管和肺泡萎陷的作用。肺表面活性物质层的破坏及肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体的空泡化，将直接影响肺表面活性物质的质与量，进而妨碍肺表面活性物质发挥正常作用。
, 百拇医药
本研究观察到正常组豚鼠肺泡表面有连续的肺表面活性物质层，肺泡Ⅱ型上皮细胞内有丰富的板层体。哮喘后PSS超微结构表现为肺表面活性物质层失去连续性，断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象；肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化。而致敏期间同步给予氨溴索，则于激发哮喘后观察PSS超微结构无哮喘发作后的相应变化。此客观变化说明肺表面活性物质层的明显破坏及板层体空泡化仅出现于哮喘发作后，其可能机制为：哮喘发作时炎性反应、组织缺氧使肺泡Ⅱ型上皮细胞破坏，继而肺表面活性物质合成及分泌障碍，炎性反应中渗出的血浆蛋白与肺表面活性物质结合导致肺表面活性物质失活，加之炎性水肿和粘液分泌又加速肺表面活性物质分解和清除，使肺表面活性物质量减少，此时机体反射性调节肺泡Ⅱ型上皮细胞代偿合成和分泌增加，但短时间PSS不能维持正常的合成和分泌，因此出现板层体的空泡化、肺表面活性物质层的断裂、脱落。因此我们认为，肺表面活性物质在哮喘发病中具有重要的作用，同时也表明氨溴索有明显减轻激发哮喘后PSS超微结构发生异常的作用，应用氨溴索还利于维持PSS的有效平衡。而寻找各种高效的肺表面活性物质刺激剂必将为哮喘的临床防治开拓又一途径。
, 百拇医药
作者简介：邓琳(1962～)，女(汉族)，主治医师，1996级军队中青年医学人才基金班学员
参考文献：
[1]Enhorning G. Surfactant research of interest to the clinician[J]. Prog Respir Res,1990, 25(2): 265-267.
[2]Liu M, Wang L, Enhorning G. Pulmonary surfactant dysfunction develops when the immunized guinea pig is chanllenge with ovalbumin aerosol[J]. Clin Exp Allergy,1995,25(11):1053-1060.
[3]Liu M, Wang L, Enhorning G. Pulmonary surfactant given prophylactically alleviates an asthma attack in guinea pigs[J]. Clin Exp Allergy, 1996,26(3):270-275.
, http://www.100md.com
[4]毋永正,方 凤,Liu M, 等.肺表面活性物质对实验性哮喘豚鼠的作用[J].第二军医大学学报，1997,18(4)：400-402.
[5]Luft JH. Ruthenium red and violet. Ⅱ. Fine structure localization in animal tissues[J]. Anat Rec, 1971,171(3):369-392.
[6]Smith FB.Role of the pulmonary surfactant system in lung diseases of adults[J]. NY State J Med,1983,83(6):851-856.
收稿日期：1999-08-18
修稿日期：1999-11-29, 百拇医药
单位：方凤(第二军医大学长海医院儿科，上海 200433)；方超萍(第二军医大学长海医院儿科，上海 200433)；毋永正(第二军医大学长海医院儿科，上海 200433)；邓琳(湖北省宜昌市第一人民医院儿科，宜昌市 443000)
关键词：氨溴索；哮喘；肺表面活性剂；超微结构
第二军医大学学报000226 摘 要：目的：观察氨溴索对哮喘豚鼠肺表面活性物质系统(pulmonary surfactant system,PSS)超微结构的影响。方法：16只豚鼠分4组，即正常组、致敏组、哮喘组、哮喘+氨溴索组，采用电子显微镜组织化学法观察各组PSS超微结构的变化。结果：电镜下超微结构显示：(1)哮喘组PSS层丧失正常的连续结构，出现断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象，肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化。(2)哮喘+氨溴索组PSS层基本连续，肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体少量空泡化。(3)致敏组PSS超微结构与哮喘+氨溴索组相似。结论：PSS超微结构于哮喘后出现明显异常。应用氨溴索可减轻哮喘后PSS超微结构的异常变化。
, 百拇医药
分类号：R 562.25 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0180-02
Effects of ambroxol on pulmonary surfactant system
ultrastructure in asthma guinea-pigs
FANG Feng
(Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
FANG Chao-Ping
, 百拇医药
(Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
WU Yong-Zheng
(Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
DENG Lin
(Department of Pediatrics, the First People′s Hospital of Yichang,Yichang 443000, Hubei, China)
, 百拇医药
ABSTRACT：Objective: To explore the effects of ambroxol on pulmonary surfactant system(PSS) ultrastructure of asthma guinea-pigs. Methods: Sixteen guinea-pigs were divided into 4 groups: normal group,sensitized group,asthma group and asthma plus ambroxal treated group. We adopted electron microscope histochemistry method to observe the ultrastructure of PSS. Results: (1)The pulmonary surfactant layer lost its normal structure; congregated into pieces in the alveolar cavity and the lamellar bodies in type Ⅱ pneumonocytes were vacuolized in asthma group. (2) The pulmonary surfactant layer was continuous and the lamellar bodies in type Ⅱ pneumonocytes was slightly vacuolized in the asthma plus ambroxol treated group. (3) The ultrastructure of the sensitized group was similar to that of the asthma plus ambroxol treated group. Conclusion: The ultrastructure of PSS is obviously abnormal in asthma group. Ambroxol administration can reduce the ultrastructure change in PSS after asthma attack.
, 百拇医药
KEY WORDS：ambroxol; asthma; pulmonary surfactants; ultrastructure▲
近年来有资料表明，哮喘时存在肺表面活性物质相对不足或功能不良[1,2]。给予外源性肺表面活性物质可以缓解哮喘[3]。我们初步研究证实了这一关系的存在[4]，同时也观察到哮喘发作后肺泡Ⅱ型上皮细胞及肺表面活性物质层结构有异常改变。本研究观察肺表面活性物质刺激剂氨溴索对哮喘后肺表面活性物质系统(PSS)超微结构的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物及处理 体质量(300±50) g的健康雄性豚鼠(第二军医大学实验动物中心提供) 16只，随机分成正常组、致敏组、哮喘组、哮喘+氨溴索组，每组4只。哮喘组豚鼠腹腔注射10%卵蛋白(上海东风生物试剂厂生产)溶液100 mg/kg致敏，3周后以1%卵蛋白溶液超声雾化吸入激发哮喘，出现口唇青紫、呼吸急促等症状，形成哮喘模型。致敏组致敏方法同哮喘组，但3周后不予激发。哮喘+氨溴索组为致敏同时给予氨溴索7.5 mg/(kg.d)，每日2次插管喂食，持续3周，3周后予以1%卵蛋白溶液超声雾化激发哮喘。
, 百拇医药
1.2 肺组织电镜标本的制备
1.2.1 试剂 钌红一液：(1)钌红10 mg/ml；(2) 0.3 mol/L二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.30)；(3) 18%戊二醛；(4) 1.8% 单宁酸。将上述4种液体储存于4℃冰箱中备用，临用时按2∶2∶1∶1的比例配制混匀即可。钌红二液：(1) 钌红10 mg/ml； (2)0.3 mol/L二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.30)；(3)5.0%四氧化锇。将上述3种液体储存于4℃冰箱中备用，临用时按1∶1∶1的比例配制混匀即可。
1.2.2 取材 各组豚鼠铡头处死，立即剪开前胸壁取出肺脏，切取近肺门处截面约2 mm×10 mm肺组织条，放置在滴有钌红一液的硬纸板上，然后再从各条块切取大约1 mm×1 mm×1 mm的组织块投入有钌红二液的青霉素小瓶中，并用针筒对小瓶抽气，以排除组织内残留气体，直到组织块沉至瓶底。
1.2.3 电镜观察 固定，包埋，切片，染色采用Luft的钌红-四氧化锇复合染色法[5]，H-800透射电镜观察。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 哮喘后PSS超微结构改变 肺表面活性物质层丧失正常的连续结构，出现断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象；肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化。
2.2 哮喘+氨溴索组PSS超微结构改变 肺表面活性层基本连续；肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体少量空泡化(图1)。
图1 哮喘+氨溴索组PSS超微结构改变
Fig 1 Ultrastracture changes of PSS
in asthma plus ambroxol group
A: Ultrastructure changes of PSS in asthma+ambroxol group
, 百拇医药
(×20 000); B: Lemillaz bodies was slightly vacuolinged in type Ⅱ
pneumonocytes(×10 000)
2.3 致敏组PSS超微结构改变 致敏组PSS超微结构与哮喘+氨溴索组相似。
3 讨 论
PSS超微结构是由铺展在肺泡表面的活性物质层与合成和分泌表面活性物质的Ⅱ型上皮细胞构成[6], 肺表面活性物质在肺泡Ⅱ型上皮细胞的内质网中合成，通过高尔基复合体转运到板层体中贮存，因此板层体形态改变提示肺表面活性物质合成的增减。板层体通过胞吐作用被分泌入肺泡腔，最终形成吸附在末梢细支气管和肺泡表面的单分子膜，发挥降低末梢细支气管、肺泡气-液表面张力，防止呼气末末梢细支气管和肺泡萎陷的作用。肺表面活性物质层的破坏及肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体的空泡化，将直接影响肺表面活性物质的质与量，进而妨碍肺表面活性物质发挥正常作用。
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本研究观察到正常组豚鼠肺泡表面有连续的肺表面活性物质层，肺泡Ⅱ型上皮细胞内有丰富的板层体。哮喘后PSS超微结构表现为肺表面活性物质层失去连续性，断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象；肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化。而致敏期间同步给予氨溴索，则于激发哮喘后观察PSS超微结构无哮喘发作后的相应变化。此客观变化说明肺表面活性物质层的明显破坏及板层体空泡化仅出现于哮喘发作后，其可能机制为：哮喘发作时炎性反应、组织缺氧使肺泡Ⅱ型上皮细胞破坏，继而肺表面活性物质合成及分泌障碍，炎性反应中渗出的血浆蛋白与肺表面活性物质结合导致肺表面活性物质失活，加之炎性水肿和粘液分泌又加速肺表面活性物质分解和清除，使肺表面活性物质量减少，此时机体反射性调节肺泡Ⅱ型上皮细胞代偿合成和分泌增加，但短时间PSS不能维持正常的合成和分泌，因此出现板层体的空泡化、肺表面活性物质层的断裂、脱落。因此我们认为，肺表面活性物质在哮喘发病中具有重要的作用，同时也表明氨溴索有明显减轻激发哮喘后PSS超微结构发生异常的作用，应用氨溴索还利于维持PSS的有效平衡。而寻找各种高效的肺表面活性物质刺激剂必将为哮喘的临床防治开拓又一途径。
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作者简介：邓琳(1962～)，女(汉族)，主治医师，1996级军队中青年医学人才基金班学员
参考文献：
[1]Enhorning G. Surfactant research of interest to the clinician[J]. Prog Respir Res,1990, 25(2): 265-267.
[2]Liu M, Wang L, Enhorning G. Pulmonary surfactant dysfunction develops when the immunized guinea pig is chanllenge with ovalbumin aerosol[J]. Clin Exp Allergy,1995,25(11):1053-1060.
[3]Liu M, Wang L, Enhorning G. Pulmonary surfactant given prophylactically alleviates an asthma attack in guinea pigs[J]. Clin Exp Allergy, 1996,26(3):270-275.
, http://www.100md.com
[4]毋永正,方 凤,Liu M, 等.肺表面活性物质对实验性哮喘豚鼠的作用[J].第二军医大学学报，1997,18(4)：400-402.
[5]Luft JH. Ruthenium red and violet. Ⅱ. Fine structure localization in animal tissues[J]. Anat Rec, 1971,171(3):369-392.
[6]Smith FB.Role of the pulmonary surfactant system in lung diseases of adults[J]. NY State J Med,1983,83(6):851-856.
收稿日期：1999-08-18
修稿日期：1999-11-29, 百拇医药