棉酚合并卡前列甲酯(PG05)抗早孕作用研究
作者：郑卫红 段红 王乃功
单位：郑卫红 段红 王乃功(湖北三峡学院医学院药理教研室 宜昌 443003)
关键词：醋酸棉酚；卡前列甲酯；抗早孕；3β-羟甾脱氢酶；雌二醇
西北药学杂志000109 摘要 观察棉酚合并PG05对小鼠的抗早孕作用。结果显示：单用棉酚75mg /(kg.d)，3d无抗早孕作用，而同样剂量棉酚与PG05 0.2mg/(kg.d)，合用2d可显著增 强抗早孕作用，使小鼠活胎数进一步减少；棉酚30μg/ml和(-)棉酚15μg/ml对大鼠黄体细 胞3β-HSD活性均有显著抑制作用，(+)棉酚15μg/ml和PG05 10μg/ml对此酶活性无影响 ；(-)棉酚15μg/ml还能抑制大鼠颗粒细胞雌二醇的分泌，提示棉酚增强PG05抗早孕作用可 能是从多环节影响胚胎正常发育。
, 百拇医药
Effects of gossypol acetic acid combined with 15-methyl PGF 2αmethyl ester(PG05) on early pregnancy mice
Zheng Weihong, Duan Hong and Wang Naigong
(Hubei Sanxia Medic al College, Yichang 443003)
ABSTRACT This study observed the pregnancy-interrupting acti on of gossypol acetic acid(GAA) combined with PG05. The results showed that admi nistration of GAA〔75mg/(kg.d),3d〕 alone couldnt interrupt the pregnancy. A nd the same dosage of GAA combined with PG05〔0.2mg/(kg.d),2d〕 enhanced sig nificantly the interrupting effect on early pregnancy mice. GAA(30μg/ml) and ( -) GAA(15μg/ml) inhibited markedly the activity of 3β-HSD of luteal cells in rat, but (+) GAA(15μg/ml) and PG05(10μg/ml) had no inhibitory effect. (-)GA A(15μg/ml) also inhibited significantly basal estradiol production of granulosa in rat. It indicated that the enhanced interrupting effect of PG05 on early pre gnancy resulted from further decrease of progesterone production induced by both GAA and PG05.
, 百拇医药
KEY WORDS gossypol acetic acid; 15-methyl PGF2α meth yl ester; termination of early pregnancy; 3β-HSD; estradiol
醋酸棉酚(GAA)具有抗雄性生育作用早有报道。但因长期应用可引起 低钾血症等副作用，使其应用受到限制。也有实验证明，棉酚对大鼠有明显的抗着床和抗早 孕作用〔1，2〕。本实验应用棉酚与已知抗生育药卡前列甲酯(PG05)合用，观察二 者是否有协同抗早孕作用，并从细胞水平对其作用机制进行初步探讨。
1 材料
1.1 动物 ICR小鼠及Wistar大鼠(中国医学科学院实验 动物中心)。
1.2 试剂与药品 醋酸棉酚(中国医学科学院药物研究所 ，纯度为99.5%)；PG05(东北制药总厂)；孕马血清促性腺激素(PMSG 500u，天津实 验动物中心)；HCG(上海生物化学制药厂)；孕烯醇酮、NAD+(SIGMA公司)；M199(GIBCD公 司)；牛血清白蛋白(BSA，上海生物化学研究所)；3H-孕酮放射免疫测定盒(上海生 物制品研究所)。
, 百拇医药
2 方法
2.1 抗早孕实验 将体重26～30g的ICR雌小鼠按2雌1雄 合笼，每日晨查阴栓，查出阴栓当天为妊娠d1。妊娠小鼠40只随机分为4组，分别于妊娠d7 开始。对照组：0.5%甲基纤维素灌胃d3；PG05组：sc.PG05 0.2mg/(kg.d)2d；合并用 药组：ig GAA 75mg/(kg.d)3d，sc. PG05 0.2mg/(kg.d)2d。各组于妊娠d14处死， 剖腹检查子宫角胚胎，记录每只小鼠的活胎数。
2.2 大鼠黄体细胞3β-羟甾脱氢酶(3β-HSD)活性测定 50～60g Wistar大鼠，sc. PMSG 60u，56h后，sc.HCG 30u。末次注射后d6将动物处死， 取卵巢，称重。按10mg/ml加入冰冷的0.25mol/L蔗糖溶液，匀浆，4℃离心(1500g)10min， 上清液测定酶活性。每只测定管加0.9ml基础培养介质(Tris 20mmol/L， NAD+ 0.5mmo l/L，孕烯醇酮4μg/ml， BSA 0.4mg/ml，pH＝7.5)；50μl胞浆，25μl药液，以20mmol/ L Tris补足至1.0ml。混合后放入37℃水浴15min，放入沸水中5min终止反应，再离心(2000 r/min)10min，取上清液，用RIA法测孕酮含量(pmol/mg)表示3β-HSD的活性。
, 百拇医药
2.3 颗粒细胞培养 取50～60g Wistar大鼠sc.PMSG 50u /只，48h后处死，取卵巢，放入M199培养基中，用4号针头轻轻刺破滤泡，使其放出颗粒细 胞，100目滤过，离心(1000r/min)5min，细胞沉淀悬浮于20ml含2%小牛血清的M199中。以血 细胞计数法计数，将细胞调整到106/ml。每组5只温孵管，每管加细胞悬液0.8ml，药液0 .1ml，以含2%小牛血清的M199补足至1.0ml，混合后，37℃水浴，通气(95% O2，5% CO 2)，振荡培养3h，置-20℃冰箱终止反应，解冻离心(2000r/min)10min，以RIA法测雌二 醇含量。
3 结果
3.1 棉酚合用PG05对小鼠的抗早孕作用 雌小鼠于妊娠7 、8d sc.PG05可使平均活胎数明显减少。服棉酚无抗早孕作用。二者合用，平均活胎数比PG 05组还少，说明棉酚可增强PG05抗早孕作用(表1)。
, 百拇医药
表1 棉酚合并PG05对小鼠的抗早孕作用(±s)
剂 量
活胎数(%)
对照
-
12.6±1.5(100)
PG05
(0.2mg/kg)×2
7.8±6.8*(61.9)
GAA
(75mg/kg)×3
, 百拇医药 13.5±1.8(107.1)
PG05+GAA
(0.2mg/kg)×2
(75mg/kg)×3
0.1±0.3△△(0.8)
与对照组比*P<0.05；X±S； 与PG05组比△△P<0.01
3.2 棉酚PG05合用对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响 棉酚30μg/ml可使黄体细胞3β-HSD的活性明显降低；PG05 10μg/ml对其无明显影响； 二者合用比单用棉酚活性有一定降低，但统计学差异不显著(表2)。
表2 棉酚与PG05合用对大鼠体外黄体细胞3β-HSD活 性的影响
, 百拇医药
剂量(μg/ml)
3β-HSD(pmol/mg)
对照
-
232.3±27.4
PG05
10
243.2±9.0
GAA
30
24.3±1.6**
PG05+GAA
, 百拇医药
10+30
21.6±2.1
**P<0.01与对照组比
3.3 棉酚光学异构体对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响 (-)棉酚15μg/ml对黄体细胞3β-HSD的活性具有明显抑制作用；而(+)棉酚对其无影 响，说明醋酸棉酚对3β-HSD活性的抑制作用主要来自(-)棉酚(表3)。
表3 棉酚光学异构体对大鼠体外黄体细胞3β-HSD活 性的影响
剂量(μg/ml)
3β-HSD(pmol/mg)
对照
-
, 百拇医药
245.2±13.2
(-)GAA
15
37.6±16.8**
(+)GAA
15
232.4±17.0
与对照组比**P<0.01
3.4 (-)棉酚对大鼠颗粒细胞分泌雌二醇的影响 (-) 棉酚15μg/ml可抑制大鼠颗粒细胞雌二醇的基础分泌(表4)。
表4 (-)棉酚对大鼠体外颗粒细胞分泌雌二醇的影响
, http://www.100md.com
剂量
雌二醇(fmol/ml)
基础组
-
250.8±24.0
(-)GAA
15μg/ml
181.4±15.0**
**P<0.01与基础分泌组比
4 讨论
自1978年男用节育药全国协作组发现棉酚对雄性有抗生育作用后〔3〕，棉酚对雌性 动物生殖系统的影响也开始引起人们注意。已发现醋酸棉酚可降低孕大鼠血清孕酮水平，并 有明显抗着床和抗早孕作用〔1，2〕。已知抗早孕药PG05既可抑制HCG刺激黄体细 胞分泌cAMP，又能拮抗8Br-cAMP刺激黄体细胞分泌孕酮〔4〕，是临床常用的抗早 孕药。本文结果显示，棉酚显著抑制大鼠黄体细胞3β-HSD的活性。3β-HSD催化孕烯醇酮 转化成为孕酮，是孕激素生成中的一个关键酶，在雌激素的生成中也起重要作用。3β-HSD 活性的降低标志着孕烯醇酮转化成孕酮的生物合成受到抑制。孕酮短缺，特别是在妊娠早期 可致妊娠终止。棉酚抑制黄体细胞3β-HSD的活性，降低其孕酮分泌可能是其抗早孕作用的 主要机制。本实验棉酚75mg/(kg.d)3d无明显抗早孕作用，可能与小鼠不如大鼠对棉酚敏 感有关。消旋棉酚拆分研究显示，(-)棉酚为有生物活性的光学异构体。在大鼠妊娠早期摘 除卵巢，胚胎将终止发育，需补充外源性雌酮和孕酮才能维持正常妊娠。本文也观察到(-) 棉酚可显著抑制大鼠颗粒细胞分泌雌二醇的作用。说明棉酚可能从多环节作用，而影响妊娠 的正常维持，从而增强PG05抗早孕作用。
, 百拇医药
参考文献
【1】 袁其晓，高德伟，李春忠.醋酸棉酚在雌性大鼠的 抗着床作用及其机理分析.生殖与避孕，1983，3(2)：25
【2】 王乃功，李凤源，李和平，等.醋酸棉酚对雌性大 鼠的抗早孕作用.药学学报，1984，19(11)：808
【3】 男用节育药全国协作组.一种新的男性节育药—— 棉酚.中华医学杂志，1978，58：455
【4】 王乃功，关慕贞，左晓春.(±)和(+)15-甲基PG F2α甲酯的抗早孕作用.中国医学科学院学报，1994，16(3)：210
(收稿：1999-09-12), http://www.100md.com
单位：郑卫红 段红 王乃功(湖北三峡学院医学院药理教研室 宜昌 443003)
关键词：醋酸棉酚；卡前列甲酯；抗早孕；3β-羟甾脱氢酶；雌二醇
西北药学杂志000109 摘要 观察棉酚合并PG05对小鼠的抗早孕作用。结果显示：单用棉酚75mg /(kg.d)，3d无抗早孕作用，而同样剂量棉酚与PG05 0.2mg/(kg.d)，合用2d可显著增 强抗早孕作用，使小鼠活胎数进一步减少；棉酚30μg/ml和(-)棉酚15μg/ml对大鼠黄体细 胞3β-HSD活性均有显著抑制作用，(+)棉酚15μg/ml和PG05 10μg/ml对此酶活性无影响 ；(-)棉酚15μg/ml还能抑制大鼠颗粒细胞雌二醇的分泌，提示棉酚增强PG05抗早孕作用可 能是从多环节影响胚胎正常发育。
, 百拇医药
Effects of gossypol acetic acid combined with 15-methyl PGF 2αmethyl ester(PG05) on early pregnancy mice
Zheng Weihong, Duan Hong and Wang Naigong
(Hubei Sanxia Medic al College, Yichang 443003)
ABSTRACT This study observed the pregnancy-interrupting acti on of gossypol acetic acid(GAA) combined with PG05. The results showed that admi nistration of GAA〔75mg/(kg.d),3d〕 alone couldnt interrupt the pregnancy. A nd the same dosage of GAA combined with PG05〔0.2mg/(kg.d),2d〕 enhanced sig nificantly the interrupting effect on early pregnancy mice. GAA(30μg/ml) and ( -) GAA(15μg/ml) inhibited markedly the activity of 3β-HSD of luteal cells in rat, but (+) GAA(15μg/ml) and PG05(10μg/ml) had no inhibitory effect. (-)GA A(15μg/ml) also inhibited significantly basal estradiol production of granulosa in rat. It indicated that the enhanced interrupting effect of PG05 on early pre gnancy resulted from further decrease of progesterone production induced by both GAA and PG05.
, 百拇医药
KEY WORDS gossypol acetic acid; 15-methyl PGF2α meth yl ester; termination of early pregnancy; 3β-HSD; estradiol
醋酸棉酚(GAA)具有抗雄性生育作用早有报道。但因长期应用可引起 低钾血症等副作用，使其应用受到限制。也有实验证明，棉酚对大鼠有明显的抗着床和抗早 孕作用〔1，2〕。本实验应用棉酚与已知抗生育药卡前列甲酯(PG05)合用，观察二 者是否有协同抗早孕作用，并从细胞水平对其作用机制进行初步探讨。
1 材料
1.1 动物 ICR小鼠及Wistar大鼠(中国医学科学院实验 动物中心)。
1.2 试剂与药品 醋酸棉酚(中国医学科学院药物研究所 ，纯度为99.5%)；PG05(东北制药总厂)；孕马血清促性腺激素(PMSG 500u，天津实 验动物中心)；HCG(上海生物化学制药厂)；孕烯醇酮、NAD+(SIGMA公司)；M199(GIBCD公 司)；牛血清白蛋白(BSA，上海生物化学研究所)；3H-孕酮放射免疫测定盒(上海生 物制品研究所)。
, 百拇医药
2 方法
2.1 抗早孕实验 将体重26～30g的ICR雌小鼠按2雌1雄 合笼，每日晨查阴栓，查出阴栓当天为妊娠d1。妊娠小鼠40只随机分为4组，分别于妊娠d7 开始。对照组：0.5%甲基纤维素灌胃d3；PG05组：sc.PG05 0.2mg/(kg.d)2d；合并用 药组：ig GAA 75mg/(kg.d)3d，sc. PG05 0.2mg/(kg.d)2d。各组于妊娠d14处死， 剖腹检查子宫角胚胎，记录每只小鼠的活胎数。
2.2 大鼠黄体细胞3β-羟甾脱氢酶(3β-HSD)活性测定 50～60g Wistar大鼠，sc. PMSG 60u，56h后，sc.HCG 30u。末次注射后d6将动物处死， 取卵巢，称重。按10mg/ml加入冰冷的0.25mol/L蔗糖溶液，匀浆，4℃离心(1500g)10min， 上清液测定酶活性。每只测定管加0.9ml基础培养介质(Tris 20mmol/L， NAD+ 0.5mmo l/L，孕烯醇酮4μg/ml， BSA 0.4mg/ml，pH＝7.5)；50μl胞浆，25μl药液，以20mmol/ L Tris补足至1.0ml。混合后放入37℃水浴15min，放入沸水中5min终止反应，再离心(2000 r/min)10min，取上清液，用RIA法测孕酮含量(pmol/mg)表示3β-HSD的活性。
, 百拇医药
2.3 颗粒细胞培养 取50～60g Wistar大鼠sc.PMSG 50u /只，48h后处死，取卵巢，放入M199培养基中，用4号针头轻轻刺破滤泡，使其放出颗粒细 胞，100目滤过，离心(1000r/min)5min，细胞沉淀悬浮于20ml含2%小牛血清的M199中。以血 细胞计数法计数，将细胞调整到106/ml。每组5只温孵管，每管加细胞悬液0.8ml，药液0 .1ml，以含2%小牛血清的M199补足至1.0ml，混合后，37℃水浴，通气(95% O2，5% CO 2)，振荡培养3h，置-20℃冰箱终止反应，解冻离心(2000r/min)10min，以RIA法测雌二 醇含量。
3 结果
3.1 棉酚合用PG05对小鼠的抗早孕作用 雌小鼠于妊娠7 、8d sc.PG05可使平均活胎数明显减少。服棉酚无抗早孕作用。二者合用，平均活胎数比PG 05组还少，说明棉酚可增强PG05抗早孕作用(表1)。
, 百拇医药
表1 棉酚合并PG05对小鼠的抗早孕作用(±s)
剂 量
活胎数(%)
对照
-
12.6±1.5(100)
PG05
(0.2mg/kg)×2
7.8±6.8*(61.9)
GAA
(75mg/kg)×3
, 百拇医药 13.5±1.8(107.1)
PG05+GAA
(0.2mg/kg)×2
(75mg/kg)×3
0.1±0.3△△(0.8)
与对照组比*P<0.05；X±S； 与PG05组比△△P<0.01
3.2 棉酚PG05合用对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响 棉酚30μg/ml可使黄体细胞3β-HSD的活性明显降低；PG05 10μg/ml对其无明显影响； 二者合用比单用棉酚活性有一定降低，但统计学差异不显著(表2)。
表2 棉酚与PG05合用对大鼠体外黄体细胞3β-HSD活 性的影响
, 百拇医药
剂量(μg/ml)
3β-HSD(pmol/mg)
对照
-
232.3±27.4
PG05
10
243.2±9.0
GAA
30
24.3±1.6**
PG05+GAA
, 百拇医药
10+30
21.6±2.1
**P<0.01与对照组比
3.3 棉酚光学异构体对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响 (-)棉酚15μg/ml对黄体细胞3β-HSD的活性具有明显抑制作用；而(+)棉酚对其无影 响，说明醋酸棉酚对3β-HSD活性的抑制作用主要来自(-)棉酚(表3)。
表3 棉酚光学异构体对大鼠体外黄体细胞3β-HSD活 性的影响
剂量(μg/ml)
3β-HSD(pmol/mg)
对照
-
, 百拇医药
245.2±13.2
(-)GAA
15
37.6±16.8**
(+)GAA
15
232.4±17.0
与对照组比**P<0.01
3.4 (-)棉酚对大鼠颗粒细胞分泌雌二醇的影响 (-) 棉酚15μg/ml可抑制大鼠颗粒细胞雌二醇的基础分泌(表4)。
表4 (-)棉酚对大鼠体外颗粒细胞分泌雌二醇的影响
, http://www.100md.com
剂量
雌二醇(fmol/ml)
基础组
-
250.8±24.0
(-)GAA
15μg/ml
181.4±15.0**
**P<0.01与基础分泌组比
4 讨论
自1978年男用节育药全国协作组发现棉酚对雄性有抗生育作用后〔3〕，棉酚对雌性 动物生殖系统的影响也开始引起人们注意。已发现醋酸棉酚可降低孕大鼠血清孕酮水平，并 有明显抗着床和抗早孕作用〔1，2〕。已知抗早孕药PG05既可抑制HCG刺激黄体细 胞分泌cAMP，又能拮抗8Br-cAMP刺激黄体细胞分泌孕酮〔4〕，是临床常用的抗早 孕药。本文结果显示，棉酚显著抑制大鼠黄体细胞3β-HSD的活性。3β-HSD催化孕烯醇酮 转化成为孕酮，是孕激素生成中的一个关键酶，在雌激素的生成中也起重要作用。3β-HSD 活性的降低标志着孕烯醇酮转化成孕酮的生物合成受到抑制。孕酮短缺，特别是在妊娠早期 可致妊娠终止。棉酚抑制黄体细胞3β-HSD的活性，降低其孕酮分泌可能是其抗早孕作用的 主要机制。本实验棉酚75mg/(kg.d)3d无明显抗早孕作用，可能与小鼠不如大鼠对棉酚敏 感有关。消旋棉酚拆分研究显示，(-)棉酚为有生物活性的光学异构体。在大鼠妊娠早期摘 除卵巢，胚胎将终止发育，需补充外源性雌酮和孕酮才能维持正常妊娠。本文也观察到(-) 棉酚可显著抑制大鼠颗粒细胞分泌雌二醇的作用。说明棉酚可能从多环节作用，而影响妊娠 的正常维持，从而增强PG05抗早孕作用。
, 百拇医药
参考文献
【1】 袁其晓，高德伟，李春忠.醋酸棉酚在雌性大鼠的 抗着床作用及其机理分析.生殖与避孕，1983，3(2)：25
【2】 王乃功，李凤源，李和平，等.醋酸棉酚对雌性大 鼠的抗早孕作用.药学学报，1984，19(11)：808
【3】 男用节育药全国协作组.一种新的男性节育药—— 棉酚.中华医学杂志，1978，58：455
【4】 王乃功，关慕贞，左晓春.(±)和(+)15-甲基PG F2α甲酯的抗早孕作用.中国医学科学院学报，1994，16(3)：210
(收稿：1999-09-12), http://www.100md.com