内源性一氧化碳对缺氧大鼠肺组织血小板源性生长因子-B基因表达的影响
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：甄国华 张珍祥 徐永健
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室
关键词：
中华内科杂志000919 血小板源性生长因子(PDGF)能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，肺动脉平滑肌细胞的过度增殖是造成慢性阻塞性肺疾病缺氧性肺动脉高压肺血管重构的主要原因。我们以往的实验发现，氯血红素可以促进内源性CO的产生，抑制大鼠缺氧性肺动脉高压的形成。本研究观察了氯血红素对缺氧大鼠肺组织PDGF-B基因表达的影响。
一、材料和方法
1. 模型复制与分组：常压缺氧15 d复制缺氧性肺动脉高压动物模型。雄性Wistar大鼠24只，体重200～300 g，随机分为3组，每组8只。A组：正常对照组，不做任何处理；B组：单纯缺氧组，在每次缺氧前半小时注射15 mg/kg体重生理盐水； C组：氯血红素干预组，每次缺氧前半小时腹腔注射15 mg/kg体重氯血红素。
, 百拇医药
2. 右心室收缩压(RVSP)的测定：经右侧颈外静脉插管至右心室，导管另一端通过压力传感器接多导生理记录仪(日本Nihon Kohden)，记录右室压力峰值作为RVSP。
3.动脉血碳氧血红蛋白(COHb)含量的测定: 按乐宏元等[1]方法，取左侧颈总动脉血0.1 ml,取10 μl溶血后加Na2S2O4 25 mg，将血中多组分的血红蛋白转化为Hb和COHb两个组分。在721-100型分光光度计上用420 nm和432 nm两个波长比色，记录吸光度值(A)，依比尔定律建立方程式，计算出COHb的百分含量。
4.免疫组织化学染色：用小鼠抗大鼠血管壁细胞增殖核抗原(PCNA)、PDGF-B抗体(美国Santa Cruz)，按SABC试剂盒说明进行操作，DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药 5.原位杂交：人工合成PDGF-B寡核苷酸探针，按随机引物法用Dig进行标记。以PBS代替探针做杂交反应阴性对照，具体操作按原位杂交试剂盒(武汉Boster)说明进行。
6.图像分析：用QTM90型图像分析仪对切片进行灰度扫描，以阴性对照的肺腺泡内动脉管壁的灰度为1，分别记录PDGF-B、PCNA蛋白及PDGF-B mRNA 染色的相对强度。
7.统计学方法：t检验。
二、结果
1.三组大鼠RVSP、血中COHb含量：见表1。
表1 各组大鼠RVSP及COHb含量的变化(
±s) 组别
鼠数(只)
, 百拇医药
RVSP(mm Hg)
COHb(%)
A组
8
33.3±3.1
0.98±0.36
B组
8
63.6±3.4*
2.75±0.45*
C组
8
, 百拇医药
52.8±3.3*△
3.38±0.41*▲
注：1 mm Hg=0.133 kPa 与A组比较，*P<0.01;与B组比较，△P<0.01，▲P<0.05 2. 大鼠PCNA、PDGF-B及PDGF-B mRNA相对强度：见表2。
表2 大鼠PCNA、PDGF-B及PDGF-BmRNA相对强度(±s) 组别
鼠数(只)
PCNA
PDGF-B
, 百拇医药
PDGF-B mRNA
A组
8
1.03±0.17
1.02±0.11
1.01±0.16
B组
8
2.51±0.64*
3.43±0.93*
3.65±0.87*
, 百拇医药 C组
8
1.74±0.41*△
1.64±0.51△▲
2.01±0.60*△
注：与A组比较，*P<0.01,▲P<0.05;与B组比较，△P<0.01 3.免疫组化及原位杂交结果：见图1～6。
讨论 PDGF被认为是在缺氧性肺动脉高压肺血管构型重建中起重要作用的生长因子[2]，可以促进肺动脉平滑肌细胞增殖。PCNA为核增殖抗原，可以客观地反映平滑肌细胞增殖的数量及分布[3]。原位杂交及免疫组化染色结果显示，缺氧使大鼠肺组织中PDGF-B mRNA及蛋白表达增强，与以往的报道一致[2]。同时，缺氧也使PCNA表达增强，说明缺氧促进了管壁细胞的增殖。
, 百拇医药
氯血红素为血红素氧合酶(HO)促进剂，可诱导HO基因表达增强，HO在体内将血红素分解产生CO[4]。大鼠左侧颈总动脉所取动脉血中COHb的含量，间接地反映了肺组织内源性CO的产量。经氯血红素干预后产生的COHb较B组增多，同时RVSP下降，PDGF-B mRNA及PCNA、PDGF-B蛋白的表达较B组减少。说明氯血红素通过促进内源性CO产生，下调PDGF-B基因的表达，抑制其对肺动脉平滑肌细胞的促增殖作用，从而阻抑了缺氧性肺动脉高压的形成。内源性CO使PDGF-B基因表达下调的分子生物学机制有待于深入研究。
, 百拇医药
图1 A组大鼠肺腺泡内动脉(IAPA)管壁血小板源性生长因子(PDGF)-B及血管壁细胞增殖核抗原(PCNA)染色阴性 免疫组化染色 ×400 图2 B组大鼠IAPA管壁PDGF-B及PCNA阳性染色。PDGF-B阳性染色表现为棕黄色，环绕IAPA管壁。PCNA阳性染色是位于IAPA管壁平滑肌层的棕黄色沉淀 免疫组化染色 ×400 图3 C组大鼠IAPA管壁PDGF-B、PCNA阳性着色较B组明显减弱，但高于A组 免疫组化染色 ×400 图4 A组大鼠IAPA管壁PDGF-B mRNA表达呈阴性 原位杂交 ×200 图5 B组大鼠IAPA管壁PDGF-B mRNA表达呈阳性，表现为环绕IAPA的棕黄色沉淀 原位杂交 ×200 图6 C组大鼠IAPA管壁PDGF-B mRNA表达呈阳性，但较B组明显减弱 原位杂交 ×200
参考文献
1，乐宏元，宋小兴，刘和平. 一氧化碳血红蛋白双波长定量测量. 临床检验杂志, 1996,14:87-88.
, 百拇医药
2，Katayose R. Increased expression of PDGF A- and B-chain genes in rat lungs with hypoxic pulmonary hypertension. Am J Physiol, 1993, 264:L100-L106.
3，Celis JE, Bravo R, Larsen PM, et al. Cyclin: a nuclear protein whose level correlates directly with the proliferative state of normal as well as transformed cells. Leuk Res, 1984,8:143-157.
4，Levere RD, Martasek P, Escalants B, et al. Effect of heme arginate administration on blood pressure in spontaneously hypertensive rats. J Clin Invest, 1990, 86:213-219.
(收稿日期：2000-01-28), http://www.100md.com
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室
关键词：
中华内科杂志000919 血小板源性生长因子(PDGF)能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，肺动脉平滑肌细胞的过度增殖是造成慢性阻塞性肺疾病缺氧性肺动脉高压肺血管重构的主要原因。我们以往的实验发现，氯血红素可以促进内源性CO的产生，抑制大鼠缺氧性肺动脉高压的形成。本研究观察了氯血红素对缺氧大鼠肺组织PDGF-B基因表达的影响。
一、材料和方法
1. 模型复制与分组：常压缺氧15 d复制缺氧性肺动脉高压动物模型。雄性Wistar大鼠24只，体重200～300 g，随机分为3组，每组8只。A组：正常对照组，不做任何处理；B组：单纯缺氧组，在每次缺氧前半小时注射15 mg/kg体重生理盐水； C组：氯血红素干预组，每次缺氧前半小时腹腔注射15 mg/kg体重氯血红素。
, 百拇医药
2. 右心室收缩压(RVSP)的测定：经右侧颈外静脉插管至右心室，导管另一端通过压力传感器接多导生理记录仪(日本Nihon Kohden)，记录右室压力峰值作为RVSP。
3.动脉血碳氧血红蛋白(COHb)含量的测定: 按乐宏元等[1]方法，取左侧颈总动脉血0.1 ml,取10 μl溶血后加Na2S2O4 25 mg，将血中多组分的血红蛋白转化为Hb和COHb两个组分。在721-100型分光光度计上用420 nm和432 nm两个波长比色，记录吸光度值(A)，依比尔定律建立方程式，计算出COHb的百分含量。
4.免疫组织化学染色：用小鼠抗大鼠血管壁细胞增殖核抗原(PCNA)、PDGF-B抗体(美国Santa Cruz)，按SABC试剂盒说明进行操作，DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。
, 百拇医药 5.原位杂交：人工合成PDGF-B寡核苷酸探针，按随机引物法用Dig进行标记。以PBS代替探针做杂交反应阴性对照，具体操作按原位杂交试剂盒(武汉Boster)说明进行。
6.图像分析：用QTM90型图像分析仪对切片进行灰度扫描，以阴性对照的肺腺泡内动脉管壁的灰度为1，分别记录PDGF-B、PCNA蛋白及PDGF-B mRNA 染色的相对强度。
7.统计学方法：t检验。
二、结果
1.三组大鼠RVSP、血中COHb含量：见表1。
表1 各组大鼠RVSP及COHb含量的变化(
±s) 组别鼠数(只)
, 百拇医药
RVSP(mm Hg)
COHb(%)
A组
8
33.3±3.1
0.98±0.36
B组
8
63.6±3.4*
2.75±0.45*
C组
8
, 百拇医药
52.8±3.3*△
3.38±0.41*▲
注：1 mm Hg=0.133 kPa 与A组比较，*P<0.01;与B组比较，△P<0.01，▲P<0.05 2. 大鼠PCNA、PDGF-B及PDGF-B mRNA相对强度：见表2。
表2 大鼠PCNA、PDGF-B及PDGF-BmRNA相对强度(
±s) 组别鼠数(只)
PCNA
PDGF-B
, 百拇医药
PDGF-B mRNA
A组
8
1.03±0.17
1.02±0.11
1.01±0.16
B组
8
2.51±0.64*
3.43±0.93*
3.65±0.87*
, 百拇医药 C组
8
1.74±0.41*△
1.64±0.51△▲
2.01±0.60*△
注：与A组比较，*P<0.01,▲P<0.05;与B组比较，△P<0.01 3.免疫组化及原位杂交结果：见图1～6。
讨论 PDGF被认为是在缺氧性肺动脉高压肺血管构型重建中起重要作用的生长因子[2]，可以促进肺动脉平滑肌细胞增殖。PCNA为核增殖抗原，可以客观地反映平滑肌细胞增殖的数量及分布[3]。原位杂交及免疫组化染色结果显示，缺氧使大鼠肺组织中PDGF-B mRNA及蛋白表达增强，与以往的报道一致[2]。同时，缺氧也使PCNA表达增强，说明缺氧促进了管壁细胞的增殖。
, 百拇医药
氯血红素为血红素氧合酶(HO)促进剂，可诱导HO基因表达增强，HO在体内将血红素分解产生CO[4]。大鼠左侧颈总动脉所取动脉血中COHb的含量，间接地反映了肺组织内源性CO的产量。经氯血红素干预后产生的COHb较B组增多，同时RVSP下降，PDGF-B mRNA及PCNA、PDGF-B蛋白的表达较B组减少。说明氯血红素通过促进内源性CO产生，下调PDGF-B基因的表达，抑制其对肺动脉平滑肌细胞的促增殖作用，从而阻抑了缺氧性肺动脉高压的形成。内源性CO使PDGF-B基因表达下调的分子生物学机制有待于深入研究。
, 百拇医药
图1 A组大鼠肺腺泡内动脉(IAPA)管壁血小板源性生长因子(PDGF)-B及血管壁细胞增殖核抗原(PCNA)染色阴性 免疫组化染色 ×400 图2 B组大鼠IAPA管壁PDGF-B及PCNA阳性染色。PDGF-B阳性染色表现为棕黄色，环绕IAPA管壁。PCNA阳性染色是位于IAPA管壁平滑肌层的棕黄色沉淀 免疫组化染色 ×400 图3 C组大鼠IAPA管壁PDGF-B、PCNA阳性着色较B组明显减弱，但高于A组 免疫组化染色 ×400 图4 A组大鼠IAPA管壁PDGF-B mRNA表达呈阴性 原位杂交 ×200 图5 B组大鼠IAPA管壁PDGF-B mRNA表达呈阳性，表现为环绕IAPA的棕黄色沉淀 原位杂交 ×200 图6 C组大鼠IAPA管壁PDGF-B mRNA表达呈阳性，但较B组明显减弱 原位杂交 ×200
参考文献
1，乐宏元，宋小兴，刘和平. 一氧化碳血红蛋白双波长定量测量. 临床检验杂志, 1996,14:87-88.
, 百拇医药
2，Katayose R. Increased expression of PDGF A- and B-chain genes in rat lungs with hypoxic pulmonary hypertension. Am J Physiol, 1993, 264:L100-L106.
3，Celis JE, Bravo R, Larsen PM, et al. Cyclin: a nuclear protein whose level correlates directly with the proliferative state of normal as well as transformed cells. Leuk Res, 1984,8:143-157.
4，Levere RD, Martasek P, Escalants B, et al. Effect of heme arginate administration on blood pressure in spontaneously hypertensive rats. J Clin Invest, 1990, 86:213-219.
(收稿日期：2000-01-28), http://www.100md.com