广东地区G6PD缺陷的基因突变型与临床表现
作者:张力 区小冰 佟莉贞 余一平
单位:张力(广州市儿童医院血液室 广州,510120);区小冰(广州市儿童医院血液室 广州,510120);佟莉贞(广州市儿童医院血液室 广州,510120);余一平(广州市儿童医院血液室 广州,510120)
关键词:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;基因突变型;PCR;临床表现
临床血液学杂志000201 摘 要:目的:分析87例G6PD缺陷患儿的基因突变型,简要探讨DNA碱基改变与临床表现之间的关系。方法:运用5对特异性引物,采用滤纸干血斑DNA扩增法,结合限制性内切酶分析技术。结果:①30例患儿为1376G→T突变,28例为1388G→A突变,6例为95A→G突变,1例为392G→T突变,未发现1024G→T突变。②各基因突变型均可导致严重的酶活性缺陷。结论:①1376、1388、95突变型是广东人及中国人中最常见的G6PD基因突变型。②G6PD基因的碱基改变与其临床表现有着极其密切的关系。
, 百拇医药
Analysis of the Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Mutations in GuangDong Province and the Relationship with Clinical Presentions
ZHANG Li OU Xiao-bing TONG Li-zhen YU Yi-ping
(Department of Hemotology,Guangzhou Chidren′s Hospital,Guangzhou,510120)
Abstract:Objective:To analyze the G6PD gene mutation in 87 cantonese G6PD deficient children and study the relationship between nucleotide substitution and clinical presention.Methods:PCR products of DNA were amplified directly from dried blood spots on filter paper using 5 pairs of primers followed by digestion with five restriction enzymes.Results:①Of the 87 samples 30 were G6PD gene 1376G→T mutation,28 were G6PD gene 1388G→A mutation,6 were G6PD gene 95A→G mutation and 1 was G6PD gene 392G→T mutation.No G6PD gene 1024G→T mutation was found.②All these genotypes probably result in severe G6PD activity deficiency.Conclusion:①The three G6PD gene mutations at nt 1376,1388 and 95 were the most common mutations in cantonese and Chinese.②The nucleotide substitution in G6PD gene was associated with the clinical presention.
, 百拇医药
Key words:Glucose-6-phosphate dehydrogenase Mutation PCR Clinical presention▲
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是磷酸戊糖旁路上的第1个关键酶,它在红细胞还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的生成上起着重要的作用,而NADPH对于细胞内自由基和H2O2毒性作用的清除是不可缺少的。由于成熟红细胞缺乏三羧酸循环,单磷酸已糖旁路(HMP)是唯一生成NADPH的途径,G6PD的缺陷会引起红细胞膜的损害,导致新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血等疾病。G6PD基因突变是造成酶活性降低的根本原因,迄今为止,已从DNA水平鉴定的突变型有78种,中国人中已报道的有12种,均为点突变〔1〕。G6PD缺陷症呈全球性、多民族分布,不同基因型所产生的表现型也不尽相同,例如中国人G6PD患者同美国黑人G6PD患者的临床表现就很不一样〔2〕。为了进一步阐明突变型及其表现型之间的关系,我们用滤纸干血斑DNA直接扩增法结合限制性内切酶分析技术,对广东地区87例G6PD患儿进行了基因研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象
通过高铁血红蛋白还原率法〔3〕和四氮唑蓝法〔4〕筛查确诊为G6PD缺陷的广东藉患儿87例,男76例,女11例,其相互间无亲缘关系。
1.2 标本的采集
静脉血直接滴于滤纸(S&S)上,自然晾干后置-20℃保存。
1.3 引物及限制性内切酶
引物设计参照台湾张建国等〔5〕(序列从略)及相应的内切酶(见表1)。由台北荣民总医院医学研究部萧广仁博士提供。
表1 G6PD各突变型酶切图谱分析 突变
, 百拇医药
位点
扩增片
段(bp)
限制性
内切酶
切点
酶切片段大小
1376
181
BfrⅠ
C/TTAAC
N:169,12 M:153,16,12
1388
, 百拇医药
220
NdeⅠ
CA/TATG
N:220 M:200,20
95
139
MluⅠ
A/CGCGT
N:126,13 M:99,27,13
1024
184
MboⅡ
, 百拇医药
GAAG(N8)
N:162,22 M:125,37,22
392
321
BanⅠ
G/GPyPuCC
N:262,59 M:237,25,59
M=突变,N=正常
1.4 聚合酶链式反应
用直径3 mm的滤纸干血斑直接进行PCR扩增。干血斑先经甲醇∶丙酮(1∶1)混合剂处理,置60℃烤箱使溶剂挥发,加入PCR反应所需的各种试剂。95℃水浴10 min,60℃水浴20 min,最后加入Taq DNA聚合酶进行PCR循环。PCR反应在DNA扩增仪(Hema 480)上自动进行:95℃ 1 min,59℃ 1 min,74℃ 30 s,1个循环;95℃ 1 min,58℃ 50 s,74℃ 30 s,33个循环;最后74℃延伸5 min。取PCR产物5 μl与1 μl上样液混合,进行2%琼脂糖电泳,溴化乙锭染色后紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.5 产物的酶切分析
取5-10 μl PCR产物,用适当的限制性内切酶消化,按商品说明之缓冲液温度消化过夜。然后取消化产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,溴化乙锭染色后置于紫外灯下观察结果。
2 结果
①实验共检测了87例标本,除22例未能查明其突变性质外,余65例分别属于4种不同的碱基置换型点突变,其性质以及它们所占的百分比见表2。
表2 87例G6PD缺陷者基因突变型鉴定结果 突变位点
置换碱基
置换氨基酸
例数
%
, 百拇医药
1376
G→T
459Arg→Leu
30
34.5
1388
G→A
463Arg→His
28
32.2
95
A→G
32His→Arg
, 百拇医药
6
6.9
392
G→T
131Gly→Val
1
1.1
1024
G→T
342Leu→Phe
0
0.0
未定型
, http://www.100md.com
22
25.3
②本文的临床资料表明:1376突变、1388突变、95突变、392突变均可导致严重的酶活性缺陷,引起蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、遗传性非球型细胞贫血等疾病。现将其中65例已知基因型的G6PD缺陷患儿主要的临床表现类型及实验室检查结果列于表3,表4。
表3 65例G6PD缺陷者主要临床表现类型 临床表型
突变位点
1376
1388
95
392
蚕豆病
, 百拇医药
14
13
3
1
药物性溶血
13
13
3
感染性溶血
2
1
遗传非球型细胞溶血
1
, http://www.100md.com 1
总计
30
28
6
1
表4 65例G6PD缺陷者主要实验室检查结果 突变
位点
G6PD活性
(MHb法)
RBC
(1×1012)
, 百拇医药
Hb
(g/L)
Ret
(%)
溶血持
续d数
1376
0.20±0.18
1.86±0.57
59±13
4.5±2.7
4.32±1.77
1388
, 百拇医药
0.18±0.13
1.94±0.49
52±12
4.3±3.6
4.04±1.55
95
0.19±0.10
1.79±0.35
49±15
2.9±0.6
4.00±1.00
392
, http://www.100md.com
0.29±
2.41±
81±
5.2±
6.00±
3 讨论
实验结果表明:1 376M(34.5%)、1 388M(32.2%)、95M(6.9%)3种基因点突变占广东地区G6PD缺陷者突变型的73.6%,是广东人主要的G6PD基因突变型。在国内,杜传书等〔6〕曾报道,在36例广东藉G6PD缺陷症患者中的G6PD基因突变型,其中1 376M、1 388M、95M占72.2%;台湾省人中这3种突变占61.0%〔7〕;谢建生等〔8〕鉴定40例广西藉G6PD缺陷症患者,1 376M与1 388M突变占62.0%;杨明等〔9〕报道在贵州黔西县,这3种基因突变占83.9%。我们的结果亦表明,迄今为止,1 376M、1 388M、95M是中国人中发现的最常见的基因突变型。而且这3种突变型只在中国人中被发现,在世界其它民族中未见有报道。
, 百拇医药
从本文的临床资料可以看出,4种基因突变型均能导致严重的酶活性缺陷和临床症状。根据WHO的分型均属于Class 2 varient(sever deficiency)。这与美国黑人G6PD缺陷患者(基因型主要为G6PDA及A-)的临床表现有很大的差异。因为美国黑人的基因突变型只引起轻度的酶缺陷和临床症状,极少会导致新生儿高胆红素血症和蚕豆病〔10〕,WHO的分型属于Class 3 varient(mild deficiency)。Beutler等〔11〕认为,NADP结合区位于386位和387位氨基酸Lys-Arg附近,Lys-Arg是NADP结合位点。G6P结合区位于205位氨基酸Lys附近,205位Lys为G6P结合位点。导致严重症状的突变,大都发生在NADP结合区或G6P结合区附近,而远离这两个结合区的突变,一般只引起较轻的临床症状。1376突变和1388突变分别导致459和463位氨基酸的被替换,这两个位置与NADP结合区很接近,而美国黑人的基因突变点离这两个结合区很远,且这两种突变又占了中国人G6PD缺陷患者基因突变型的大多数(66.7%),这可能就是为什么中国人G6PD患缺陷患者的临床症状比美国黑人G6PD患者重的原因。当然,除了不同的基因突变型以外,其它许多因素如营养、环境等都对G6PD缺陷患者的临床表现有很大的影响〔10〕。
, http://www.100md.com
95M突变占检测突变的6.9%。Beutler等〔2〕认为病情较重的突变多在羧基端,较轻的突变多在氨基端。cDNA 95位于氨基端的外显子Ⅱ,临床资料显示95M突变也可以引起严重的G6PD缺陷,这说明外显子Ⅱ在G6PD基因的表达上起着很重要的作用。
本次实验通过对G6PD缺陷患者基因突变型的鉴定及其临床表现的观察,推测了G6PD基因的结构和功能之间的关系。但要真正了解G6PD基因突变与酶活性之间的关系,要等到弄清楚G6PD的立体结构之后。■
参考文献:
[1]杨明.人类G6PD缺乏症的分子生物学研究进展.中华医学遗传学杂志,1995,12:159~162
[2]Beutler E.Tlucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.N Engl J Med,1991,324:169~174
, 百拇医药
[3]Brewer G J,Tarlov A R,Alving A S.The methemoglobin reduction test for primaquine-type sensitivity of erythrocytes.JAMA,1962,180:386~390
[4]杜传书,芮琳.红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的四氮唑蓝定量测定位.中华血液学杂志,1981,2:188~192
[5]Chang J G,Chiou S S,Perng L I,et al.Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency by natural and amplification created restrictive sites.Five mutation account for most G6PD deficiency in TaiWan.Blood,1992,80:1079~1082
, 百拇医药
[6]杜传书,王菁,陈路明,等.中国人中所见的六种葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变.中华血液学杂志,1993,14:395~398
[7]Yang C C,Hung Y M,Tan L K,et al.Study of the common southem chinese glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations in singapore and TaiWan.Clin Biochem Revs,1993,14:281~284
[8]谢建生,龙桂芳,蒋南华,等.两种常见的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测及临床分析.中华血液学杂志,1995,16:179~182
[9]杨明,杜传书.贵州黔西县G6PD基因突变型研究.中华血液学杂志,1996,17(4):188~191
[10]Beulter E.G6PD Deficiency.Blood,1994,84:3613~3636
[11]Beutler E,Kuhl W,Gelbart T,Forman L.DNAS sequence abnormalities of human glucose-6-phosphate dehydrogenase variants.J Biol Chem,1991,266:4145~4150
(收稿日期:1999-06-07), 百拇医药
单位:张力(广州市儿童医院血液室 广州,510120);区小冰(广州市儿童医院血液室 广州,510120);佟莉贞(广州市儿童医院血液室 广州,510120);余一平(广州市儿童医院血液室 广州,510120)
关键词:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;基因突变型;PCR;临床表现
临床血液学杂志000201 摘 要:目的:分析87例G6PD缺陷患儿的基因突变型,简要探讨DNA碱基改变与临床表现之间的关系。方法:运用5对特异性引物,采用滤纸干血斑DNA扩增法,结合限制性内切酶分析技术。结果:①30例患儿为1376G→T突变,28例为1388G→A突变,6例为95A→G突变,1例为392G→T突变,未发现1024G→T突变。②各基因突变型均可导致严重的酶活性缺陷。结论:①1376、1388、95突变型是广东人及中国人中最常见的G6PD基因突变型。②G6PD基因的碱基改变与其临床表现有着极其密切的关系。
, 百拇医药
Analysis of the Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Mutations in GuangDong Province and the Relationship with Clinical Presentions
ZHANG Li OU Xiao-bing TONG Li-zhen YU Yi-ping
(Department of Hemotology,Guangzhou Chidren′s Hospital,Guangzhou,510120)
Abstract:Objective:To analyze the G6PD gene mutation in 87 cantonese G6PD deficient children and study the relationship between nucleotide substitution and clinical presention.Methods:PCR products of DNA were amplified directly from dried blood spots on filter paper using 5 pairs of primers followed by digestion with five restriction enzymes.Results:①Of the 87 samples 30 were G6PD gene 1376G→T mutation,28 were G6PD gene 1388G→A mutation,6 were G6PD gene 95A→G mutation and 1 was G6PD gene 392G→T mutation.No G6PD gene 1024G→T mutation was found.②All these genotypes probably result in severe G6PD activity deficiency.Conclusion:①The three G6PD gene mutations at nt 1376,1388 and 95 were the most common mutations in cantonese and Chinese.②The nucleotide substitution in G6PD gene was associated with the clinical presention.
, 百拇医药
Key words:Glucose-6-phosphate dehydrogenase Mutation PCR Clinical presention▲
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是磷酸戊糖旁路上的第1个关键酶,它在红细胞还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的生成上起着重要的作用,而NADPH对于细胞内自由基和H2O2毒性作用的清除是不可缺少的。由于成熟红细胞缺乏三羧酸循环,单磷酸已糖旁路(HMP)是唯一生成NADPH的途径,G6PD的缺陷会引起红细胞膜的损害,导致新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血等疾病。G6PD基因突变是造成酶活性降低的根本原因,迄今为止,已从DNA水平鉴定的突变型有78种,中国人中已报道的有12种,均为点突变〔1〕。G6PD缺陷症呈全球性、多民族分布,不同基因型所产生的表现型也不尽相同,例如中国人G6PD患者同美国黑人G6PD患者的临床表现就很不一样〔2〕。为了进一步阐明突变型及其表现型之间的关系,我们用滤纸干血斑DNA直接扩增法结合限制性内切酶分析技术,对广东地区87例G6PD患儿进行了基因研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象
通过高铁血红蛋白还原率法〔3〕和四氮唑蓝法〔4〕筛查确诊为G6PD缺陷的广东藉患儿87例,男76例,女11例,其相互间无亲缘关系。
1.2 标本的采集
静脉血直接滴于滤纸(S&S)上,自然晾干后置-20℃保存。
1.3 引物及限制性内切酶
引物设计参照台湾张建国等〔5〕(序列从略)及相应的内切酶(见表1)。由台北荣民总医院医学研究部萧广仁博士提供。
表1 G6PD各突变型酶切图谱分析 突变
, 百拇医药
位点
扩增片
段(bp)
限制性
内切酶
切点
酶切片段大小
1376
181
BfrⅠ
C/TTAAC
N:169,12 M:153,16,12
1388
, 百拇医药
220
NdeⅠ
CA/TATG
N:220 M:200,20
95
139
MluⅠ
A/CGCGT
N:126,13 M:99,27,13
1024
184
MboⅡ
, 百拇医药
GAAG(N8)
N:162,22 M:125,37,22
392
321
BanⅠ
G/GPyPuCC
N:262,59 M:237,25,59
M=突变,N=正常
1.4 聚合酶链式反应
用直径3 mm的滤纸干血斑直接进行PCR扩增。干血斑先经甲醇∶丙酮(1∶1)混合剂处理,置60℃烤箱使溶剂挥发,加入PCR反应所需的各种试剂。95℃水浴10 min,60℃水浴20 min,最后加入Taq DNA聚合酶进行PCR循环。PCR反应在DNA扩增仪(Hema 480)上自动进行:95℃ 1 min,59℃ 1 min,74℃ 30 s,1个循环;95℃ 1 min,58℃ 50 s,74℃ 30 s,33个循环;最后74℃延伸5 min。取PCR产物5 μl与1 μl上样液混合,进行2%琼脂糖电泳,溴化乙锭染色后紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.5 产物的酶切分析
取5-10 μl PCR产物,用适当的限制性内切酶消化,按商品说明之缓冲液温度消化过夜。然后取消化产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,溴化乙锭染色后置于紫外灯下观察结果。
2 结果
①实验共检测了87例标本,除22例未能查明其突变性质外,余65例分别属于4种不同的碱基置换型点突变,其性质以及它们所占的百分比见表2。
表2 87例G6PD缺陷者基因突变型鉴定结果 突变位点
置换碱基
置换氨基酸
例数
%
, 百拇医药
1376
G→T
459Arg→Leu
30
34.5
1388
G→A
463Arg→His
28
32.2
95
A→G
32His→Arg
, 百拇医药
6
6.9
392
G→T
131Gly→Val
1
1.1
1024
G→T
342Leu→Phe
0
0.0
未定型
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22
25.3
②本文的临床资料表明:1376突变、1388突变、95突变、392突变均可导致严重的酶活性缺陷,引起蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、遗传性非球型细胞贫血等疾病。现将其中65例已知基因型的G6PD缺陷患儿主要的临床表现类型及实验室检查结果列于表3,表4。
表3 65例G6PD缺陷者主要临床表现类型 临床表型
突变位点
1376
1388
95
392
蚕豆病
, 百拇医药
14
13
3
1
药物性溶血
13
13
3
感染性溶血
2
1
遗传非球型细胞溶血
1
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总计
30
28
6
1
表4 65例G6PD缺陷者主要实验室检查结果 突变
位点
G6PD活性
(MHb法)
RBC
(1×1012)
, 百拇医药
Hb
(g/L)
Ret
(%)
溶血持
续d数
1376
0.20±0.18
1.86±0.57
59±13
4.5±2.7
4.32±1.77
1388
, 百拇医药
0.18±0.13
1.94±0.49
52±12
4.3±3.6
4.04±1.55
95
0.19±0.10
1.79±0.35
49±15
2.9±0.6
4.00±1.00
392
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0.29±
2.41±
81±
5.2±
6.00±
3 讨论
实验结果表明:1 376M(34.5%)、1 388M(32.2%)、95M(6.9%)3种基因点突变占广东地区G6PD缺陷者突变型的73.6%,是广东人主要的G6PD基因突变型。在国内,杜传书等〔6〕曾报道,在36例广东藉G6PD缺陷症患者中的G6PD基因突变型,其中1 376M、1 388M、95M占72.2%;台湾省人中这3种突变占61.0%〔7〕;谢建生等〔8〕鉴定40例广西藉G6PD缺陷症患者,1 376M与1 388M突变占62.0%;杨明等〔9〕报道在贵州黔西县,这3种基因突变占83.9%。我们的结果亦表明,迄今为止,1 376M、1 388M、95M是中国人中发现的最常见的基因突变型。而且这3种突变型只在中国人中被发现,在世界其它民族中未见有报道。
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从本文的临床资料可以看出,4种基因突变型均能导致严重的酶活性缺陷和临床症状。根据WHO的分型均属于Class 2 varient(sever deficiency)。这与美国黑人G6PD缺陷患者(基因型主要为G6PDA及A-)的临床表现有很大的差异。因为美国黑人的基因突变型只引起轻度的酶缺陷和临床症状,极少会导致新生儿高胆红素血症和蚕豆病〔10〕,WHO的分型属于Class 3 varient(mild deficiency)。Beutler等〔11〕认为,NADP结合区位于386位和387位氨基酸Lys-Arg附近,Lys-Arg是NADP结合位点。G6P结合区位于205位氨基酸Lys附近,205位Lys为G6P结合位点。导致严重症状的突变,大都发生在NADP结合区或G6P结合区附近,而远离这两个结合区的突变,一般只引起较轻的临床症状。1376突变和1388突变分别导致459和463位氨基酸的被替换,这两个位置与NADP结合区很接近,而美国黑人的基因突变点离这两个结合区很远,且这两种突变又占了中国人G6PD缺陷患者基因突变型的大多数(66.7%),这可能就是为什么中国人G6PD患缺陷患者的临床症状比美国黑人G6PD患者重的原因。当然,除了不同的基因突变型以外,其它许多因素如营养、环境等都对G6PD缺陷患者的临床表现有很大的影响〔10〕。
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95M突变占检测突变的6.9%。Beutler等〔2〕认为病情较重的突变多在羧基端,较轻的突变多在氨基端。cDNA 95位于氨基端的外显子Ⅱ,临床资料显示95M突变也可以引起严重的G6PD缺陷,这说明外显子Ⅱ在G6PD基因的表达上起着很重要的作用。
本次实验通过对G6PD缺陷患者基因突变型的鉴定及其临床表现的观察,推测了G6PD基因的结构和功能之间的关系。但要真正了解G6PD基因突变与酶活性之间的关系,要等到弄清楚G6PD的立体结构之后。■
参考文献:
[1]杨明.人类G6PD缺乏症的分子生物学研究进展.中华医学遗传学杂志,1995,12:159~162
[2]Beutler E.Tlucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.N Engl J Med,1991,324:169~174
, 百拇医药
[3]Brewer G J,Tarlov A R,Alving A S.The methemoglobin reduction test for primaquine-type sensitivity of erythrocytes.JAMA,1962,180:386~390
[4]杜传书,芮琳.红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的四氮唑蓝定量测定位.中华血液学杂志,1981,2:188~192
[5]Chang J G,Chiou S S,Perng L I,et al.Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency by natural and amplification created restrictive sites.Five mutation account for most G6PD deficiency in TaiWan.Blood,1992,80:1079~1082
, 百拇医药
[6]杜传书,王菁,陈路明,等.中国人中所见的六种葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变.中华血液学杂志,1993,14:395~398
[7]Yang C C,Hung Y M,Tan L K,et al.Study of the common southem chinese glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations in singapore and TaiWan.Clin Biochem Revs,1993,14:281~284
[8]谢建生,龙桂芳,蒋南华,等.两种常见的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测及临床分析.中华血液学杂志,1995,16:179~182
[9]杨明,杜传书.贵州黔西县G6PD基因突变型研究.中华血液学杂志,1996,17(4):188~191
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(收稿日期:1999-06-07), 百拇医药