内皮素、一氧化氮与老年动脉硬化闭塞症相互关系的探讨
作者：王春喜 王嘉桔 贾润英 段志泉
单位：王春喜(中国医科大学第一临床学院血管外科，沈阳 110001)；王嘉桔 贾润英(白求恩医科大学第三临床学院血管外科)；段志泉(中国医科大学第一临床学院血管外科，沈阳 110001)
关键词：内皮素；一氧化氮；动脉硬化闭塞症
中国老年学杂志000503摘 要 目的 从分子生物学角度探讨内皮素(ET)、一氧化氮(NO)与动脉硬化闭塞症(ASO)的相互关系。方法 选择96例ASO患者和86只模型，利用放射免疫、Griss、光电比色和逆转录PCR方法检测血浆ET、NO和血管一氧化氮合酶(NOS)活性、ET mRNA和NOS mRNA表达情况。结果 ASO患者和模型存在高ET血症和低NO血症，ASO病变血管存在低NOS活性、低NOS mRNA表达和高ET mRNA表达状态，并同ASO严重程度密切相关。结论 高ET血症、低NO血症、低NOS活性、低NOS mRNA表达和高ET mRNA表达状态同ASO的发生发展密切相关，ET、NO、NOS活性、NOS mRNA和ET mRNA表达的检测有助于ASO发病机制的探讨，有助于病情严重程度和治疗效果的判断。
, 百拇医药
The relationship between endothelins,nitric oxide and atherosclerosis obliterans
Wang Chunxi,Wang Jiaju,Jia Runying et al
(Vascular Surgery Department of the First Hospital Affiliated with China Medical University,Shenyang 110001)
Abstract：Objective The relationship and its clinical significances between endothelins(ET),nitric oxide(NO),and atherosclerosis obliterans(ASO) were investigated.Methods 96 ASO patients and 56 ASO rabbit models were selected with their plasma ET,NO,NOS activity,and ET-mRNA,NOS-mRNA expression determined by radioimmunoassy,colorimetry and RT-PCR methods.Results The ASO patients and models had high plasma ET levels and low plasma NO levels related with the severity of ASO,but the ET mRNA expressions were increased gradually,the NOS mRNA expressions and the NOS activity decreased gradually. All the above changes gradually returned to mormal after treated by PGE1.Conclusions The abnormalitis of ET,NO,NOS activity,ET mRNA,NOS mRNA expressions closely relate with ASO severity and play an important role in the ASO pathogenesis,and can be used to judge the severity of the condition and the effectiveness of treatments.
, 百拇医药
Key words Endothelins Nitric Oxide Atherosclerosis Obliterans
自80年代初期分离和发现了内皮素(ET)、一氧化氮(NO)，并证实其在心血管系统中具有重要的生理和病理生理作用以后，ET、NO与心血管疾病的研究一直是临床医学研究的热点〔1，2〕，尤其是与动脉粥样硬化(AS)之间的研究；动脉硬化闭塞症(ASO)是AS在肢体动脉的局部表现和终末阶段，故以ET和NO与AS病变的关系为基础，深入探讨二者与ASO的关系，具有较大的理论意义和临床价值。为此，我们应用分子生物学技术进行了本项研究，初步分析报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 96例ASO病人，均为髂股动脉闭塞，男81例，女15例，年龄65～85岁(平均71岁)。按我国ASO三期分类方法，Ⅰ期22例，Ⅱ期41例，Ⅲ期33例。应用常规静脉点滴PGE1，分别于治疗后0、2、5、8和14 w取周围静脉血制备血浆标本。另取40例本院健康查体者作为对照组。
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1.2 方法
1.2.1 模型制作 选用86只中国农牧大学实验动物中心提供的纯种雄性新西兰家兔，体重2.5～3.5 kg，10月龄；参照蔡海江〔3〕等方法，采用饲喂高胆固醇、注射牛血清白蛋白及4F球囊导管拖拉髂股动脉损伤内膜等综合措施，制备ASO模型，共20 w。于20 w时随机取4只行髂股动脉造影，处死后取髂股动脉作病理学检查(包括光镜和电镜)证实ASO形成。在制作模型过程中，分别于饲喂胆固醇前，后2、5、8、14和20 w随机处死8只模型兔，同时制备血液和髂股动脉标本，剩余模型供治疗用。
1.2.2 ASO家兔模型的治疗 选择ASO模型40只，静脉应用PGE1，用药后2、5、8、10 w各处死8只ASO模型兔作对照，余8只治疗14 w后处死。
1.3 测定方法 血浆ET采用放射免疫法，NO采用Griss法，NOS采用分光光度法，药盒均由解放军总医院东亚所提供。ET mRNA、cNOS mRNA和iNOS mRNA表达采用反转录-聚合酶链反应(PCR)法〔4，5〕，均以β-actin作内参计算mRNA表达量。引物由中国科学院上海生物所提供。PCR热循环仪为480型。模型由血管造影、光镜、电镜等病理检查证实。
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1.4 统计学处理 平均值用x±s表示，采用Studen's t检验。
2 结 果
2.1 ASO患者血浆ET、NO含量与病变程度和治疗时间的关系 见表1、表2。ASO患者存在高ET血症和低NO血症，随ASOⅠ～Ⅲ逐渐加重，且随临床有效治疗逐渐趋于正常水平。
表1 ASO患者不同期血浆ET、NO含量(
±s)
n
ET(ng/L)
NO(μmol/L)
正常对照组
, 百拇医药
40
41.78±11.65
5.30±0.37
ASOⅠ期
22
74.49±7.48
2.46±0.68
ASOⅡ期
41
94.81±10.65
2.36±0.34
ASOⅢ期
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16
106.86±16.93
1.86±0.27
注：组间两两比较P<0.01
2.2 ASO实验动物模型制作过程中ET、NO、NOS活性及ET、NOS、mRNA基因表达的动态观察 见表3、表4。
随动物模型病变加重，尽管血浆ET呈不规则上升，但ET mRNA表达仍呈持续规律性增加。而血浆NO、血管NOS mRNA表达则呈规律性减少；而在治疗后上述指标则呈相反变化。表2 ASO患者血浆ET、NO含量及PGE1治疗后变化(±s)
对照组(n=30)
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病人组(n=96)
治疗前
治疗2 w
治疗5 w
治疗8 w
治疗14 w
ET(ng/L)
41.78±11.65
94.30±8.921)
72.44±10.111)2)
70.11±9.321)2)
, http://www.100md.com
50.44±11.221)3)
47.33±11.593)
NO(μmol/L)
5.30±0.37
2.46±0.681)
2.87±0.431)2)
2.95±0.411)2)
3.02±0.681)3)
5.21±0.443)
, 百拇医药
治疗前与对照组比较：1)P<0.01；治疗前与治疗后比较：1)P<0.05，2)P<0.01表3 ASO家兔模型制作过程中血ET NO及病变血管NOS活性ET mRNA和NOS mRNA表达结果(±s) 组别
n
ET
NO
NOS活性
iNOS mRNA
cNOS mRNA
ET mRNA
造模0 w
, http://www.100md.com
8
80.22±11.88
10.44±1.29
0.232±0.111
0.211±0.012
0.573±0.102
0.298±0.092
造模2 w
8
92.33±14.891)
9.22±1.34
, http://www.100md.com 0.219±0.092
0.201±0.0091)
0.439±0.0921)
0.391±0.0871)
造模5 w
8
140.44±20.232)
6.57±1.021)
0.211±0.0751)
0.184±0.0082)
, http://www.100md.com
0.413±0.0822)
0.423±0.0722)
造模8 w
8
832.56±36.782)
5.42±1.192)
0.143±0.0712)
0.143±0.0712)
0.397±0.0332)
0.679±0.0982)
, 百拇医药
造模14 w
8
957.66±141.221)
5.55±1.412)
0.143±0.0822)
0.123±0.0672)
0.357±0.0372)
0.712±0.0962)
造模20 w
8
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844.58±92.332)
5.72±1.112)
0.134±0.0572)
0.129±0.0122)
0.339±0.0572)
0.822±0.1002)
与制模前比较：1)P<0.05，2)P<0.01表4 ASO家兔模型PGE1治疗前后ET、NO及其mRNA表达结果(±s)
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n
ET
NO
NOS活性
iNOS mRNA
cNOS mRNA
ET mRNA
造模0 w
8
844.58±92.33
5.72±1.11
0.134±0.057
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0.129±0.012
0.339±0.057
0.822±0.100
造模2 w
8
729.59±88.221)
5.98±1.231)
0.133±0.049
0.133±0.0141)
0.345±0.0421)
, http://www.100md.com
0.652±0.142
造模5 w
8
700.23±84.232)
5.15±1.032)
0.167±0.0691)
0.145±0.0092)
0.351±0.0512)
0.544±0.1922)
造模8 w
, 百拇医药
8
208.12±45.662)
9.22±1.192)
0.192±0.0582)
0.214±0.0142)
0.433±0.0932)
0.439±0.3212)
造模14 w
8
98.44±58.222)
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9.23±1.432)
0.212±0.0492)
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0.423±0.0822)
0.423±0.2122)
与治疗前比较：1)P<0.05，2)P<0.01
3 讨 论
3.1 ET、NO及其基因表达在ASO形成中的作用和地位 目前认为内皮损伤、脂质渗入、平滑肌增殖、自由基损伤、血栓形成等诸多因素在AS-ASO的形成过程中均起到重要作用，并认为内皮细胞损伤是其重要的始动环节〔6～8〕。内皮细胞在生物、化学和物理等有害因子作用下，释放和代谢功能遭到破坏，继发各种细胞因子、生长因子、粘附蛋白等活性物质基因高表达，共同参与AS的产生，构成AS向ASO形成和发展的连锁反应；1992年Ross重新修正的损伤反应学说的基本内容即为上述观点〔9〕。ET、NO是内皮细胞分泌和产生的一对血管活性因子，前者具有强烈的血管收缩、促进平滑肌增生和血小板聚集的作用，NO则与之相反，二者相互制约，共同维持血管舒缩功能的稳定和血液的正常流动。内皮损伤后ET合成增多而NO合成减少，从而为AS向ASO形成和发展提供了条件。本实验ASO动物模型和不同病期的ASO病人血液ET、NO和血管NOS活性、ET mRNA、NOS mRNA基因表达结果，亦表明ET、NO及其基因异常表达在ASO形成过程中具有重要的发病学意义。
, 百拇医药
3.2 ET、NO与ASO病变严重程度的关系 本组动物实验和临床资料表明，ASO患者及动物模型随病情加重血浆ET逐渐升高、血浆NO逐渐降低，ET、NO mRNA表达及其相应的变化与ASO病变程度密切相关。临床分期的主要依据是肢体缺血表现的程度，而缺血程度不仅取决于AS病变的范围、动脉闭塞的高度、长度、发展速度，而且取决于肢体血液流量减少的绝对量，取决于严重缺血造成的动脉内皮细胞损害程度。基于上述观点，ET、NO及其基因表达的变化，除取决于动脉本身病变外，还取决于闭塞远段血管及其侧枝血管内皮细胞的损伤程度。
3.3 ET、NO、ET mRNA、NOS mRNA检测的临床意义 本研究表明，ET、NO及其基因表达同ASO病变程度有着密切关系，可作为诊断和判断病情严重性的依据；同时表明，NO、ET及其基因表达的异常变化，随治疗时间的延长和病情的好转逐渐趋于正常，可见ET、NO、ET mRNA、NOS mRNA检测为判定疗效提供了客观指标，也为PGE1治疗机制的探讨提供了新的理论依据；ASO是一个慢性疾病，获得良好治疗效果亦较缓慢；PGE1治疗ASO一般2个疗程以上(15～20 d为一疗程)，缺血性病变才会有根本的好转〔6〕。本组资料亦展示出与临床相吻合的结果，即治疗14 w时，ET、NO才趋于正常。
, 百拇医药
治疗ASO的药物较多，虽均有改善肢体血液循环的作用，但又各有其特点。基因疗法是治疗ASO的新的发展趋势〔10，11〕。本实验结果为应用ET拮抗剂、NO供体及从ET、NOS基因角度选用基因治疗方案提供了理论依据，也为疗效判定制定了分子水平和基因水平的实验标准。 中国博士后基金资助项目
作者简介：王春喜，37岁，主治医师，博士后，主要从事动脉硬化闭塞症基础和临床研究
参考文献
1，Cohen RA.The role of nitric oxide and other endothelium-derived vasoactive substances in vascular disease.Prog Cardiovasc Dis，1995：38(2)，105：
2，汤 健，唐朝枢.内皮素基础与临床.第1版.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1994：1-6
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3，蔡海江，高 达，朱敏天 et al.免疫性损伤对家兔动脉硬化的影响.中华心血管病杂志，1979；7(4)：287
4，Sessa WC,Harison JK,Luthin DR et al.Genomic analysis and expression patterns reveral distinct genes for endothelinal and brain nitric oxide synthase.Hypertention，1993；12：934
5，Yan ZQ,Yokota T,Zhang W et al.Expression of inducible nitric oxide synthase inhibits platelet adhession and restores blood flow in the injured artery.Circ Res，1996；79：38
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6，王嘉桔.抗血小板疗法.实用周围血管疾病学，第1版.海口：南海出版社，1995：65-69
7，Harrison DG.Endothelial dysfunction in atherosclerosis.Basic Res Cardiol，1994；89(suppl)：87
8，Wrinkles JA,Alberts GF,Brosi E et al.Endothelin-1 and endothelins receptor mRNA expression in normal and atherosclerotic human arteries.Biochem Biophys Res Commun，1993；191(3)：1 081
9，Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:A perspetive for the 1990s.Nature，1993；362：801
, 百拇医药
10，Deleyen HE,Dzau VJ.Gene therapy inhibiting neointim vascular lension:In vivo transfer of endothelins cell nitric oxide synthase gene.Proc Natl Acad Sci USA，1995；92：1137
11，赵民清.BQ123多聚核苷酸携带B半乳糖苷酶基因向血管平滑肌细胞靶向导入.北京医科大学学报，1994；26：135
收稿日期：1999-06-29
修回日期：1999-12-31, 百拇医药
单位：王春喜(中国医科大学第一临床学院血管外科，沈阳 110001)；王嘉桔 贾润英(白求恩医科大学第三临床学院血管外科)；段志泉(中国医科大学第一临床学院血管外科，沈阳 110001)
关键词：内皮素；一氧化氮；动脉硬化闭塞症
中国老年学杂志000503摘 要 目的 从分子生物学角度探讨内皮素(ET)、一氧化氮(NO)与动脉硬化闭塞症(ASO)的相互关系。方法 选择96例ASO患者和86只模型，利用放射免疫、Griss、光电比色和逆转录PCR方法检测血浆ET、NO和血管一氧化氮合酶(NOS)活性、ET mRNA和NOS mRNA表达情况。结果 ASO患者和模型存在高ET血症和低NO血症，ASO病变血管存在低NOS活性、低NOS mRNA表达和高ET mRNA表达状态，并同ASO严重程度密切相关。结论 高ET血症、低NO血症、低NOS活性、低NOS mRNA表达和高ET mRNA表达状态同ASO的发生发展密切相关，ET、NO、NOS活性、NOS mRNA和ET mRNA表达的检测有助于ASO发病机制的探讨，有助于病情严重程度和治疗效果的判断。
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The relationship between endothelins,nitric oxide and atherosclerosis obliterans
Wang Chunxi,Wang Jiaju,Jia Runying et al
(Vascular Surgery Department of the First Hospital Affiliated with China Medical University,Shenyang 110001)
Abstract：Objective The relationship and its clinical significances between endothelins(ET),nitric oxide(NO),and atherosclerosis obliterans(ASO) were investigated.Methods 96 ASO patients and 56 ASO rabbit models were selected with their plasma ET,NO,NOS activity,and ET-mRNA,NOS-mRNA expression determined by radioimmunoassy,colorimetry and RT-PCR methods.Results The ASO patients and models had high plasma ET levels and low plasma NO levels related with the severity of ASO,but the ET mRNA expressions were increased gradually,the NOS mRNA expressions and the NOS activity decreased gradually. All the above changes gradually returned to mormal after treated by PGE1.Conclusions The abnormalitis of ET,NO,NOS activity,ET mRNA,NOS mRNA expressions closely relate with ASO severity and play an important role in the ASO pathogenesis,and can be used to judge the severity of the condition and the effectiveness of treatments.
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Key words Endothelins Nitric Oxide Atherosclerosis Obliterans
自80年代初期分离和发现了内皮素(ET)、一氧化氮(NO)，并证实其在心血管系统中具有重要的生理和病理生理作用以后，ET、NO与心血管疾病的研究一直是临床医学研究的热点〔1，2〕，尤其是与动脉粥样硬化(AS)之间的研究；动脉硬化闭塞症(ASO)是AS在肢体动脉的局部表现和终末阶段，故以ET和NO与AS病变的关系为基础，深入探讨二者与ASO的关系，具有较大的理论意义和临床价值。为此，我们应用分子生物学技术进行了本项研究，初步分析报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 96例ASO病人，均为髂股动脉闭塞，男81例，女15例，年龄65～85岁(平均71岁)。按我国ASO三期分类方法，Ⅰ期22例，Ⅱ期41例，Ⅲ期33例。应用常规静脉点滴PGE1，分别于治疗后0、2、5、8和14 w取周围静脉血制备血浆标本。另取40例本院健康查体者作为对照组。
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1.2 方法
1.2.1 模型制作 选用86只中国农牧大学实验动物中心提供的纯种雄性新西兰家兔，体重2.5～3.5 kg，10月龄；参照蔡海江〔3〕等方法，采用饲喂高胆固醇、注射牛血清白蛋白及4F球囊导管拖拉髂股动脉损伤内膜等综合措施，制备ASO模型，共20 w。于20 w时随机取4只行髂股动脉造影，处死后取髂股动脉作病理学检查(包括光镜和电镜)证实ASO形成。在制作模型过程中，分别于饲喂胆固醇前，后2、5、8、14和20 w随机处死8只模型兔，同时制备血液和髂股动脉标本，剩余模型供治疗用。
1.2.2 ASO家兔模型的治疗 选择ASO模型40只，静脉应用PGE1，用药后2、5、8、10 w各处死8只ASO模型兔作对照，余8只治疗14 w后处死。
1.3 测定方法 血浆ET采用放射免疫法，NO采用Griss法，NOS采用分光光度法，药盒均由解放军总医院东亚所提供。ET mRNA、cNOS mRNA和iNOS mRNA表达采用反转录-聚合酶链反应(PCR)法〔4，5〕，均以β-actin作内参计算mRNA表达量。引物由中国科学院上海生物所提供。PCR热循环仪为480型。模型由血管造影、光镜、电镜等病理检查证实。
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1.4 统计学处理 平均值用x±s表示，采用Studen's t检验。
2 结 果
2.1 ASO患者血浆ET、NO含量与病变程度和治疗时间的关系 见表1、表2。ASO患者存在高ET血症和低NO血症，随ASOⅠ～Ⅲ逐渐加重，且随临床有效治疗逐渐趋于正常水平。
表1 ASO患者不同期血浆ET、NO含量(
±s)n
ET(ng/L)
NO(μmol/L)
正常对照组
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40
41.78±11.65
5.30±0.37
ASOⅠ期
22
74.49±7.48
2.46±0.68
ASOⅡ期
41
94.81±10.65
2.36±0.34
ASOⅢ期
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16
106.86±16.93
1.86±0.27
注：组间两两比较P<0.01
2.2 ASO实验动物模型制作过程中ET、NO、NOS活性及ET、NOS、mRNA基因表达的动态观察 见表3、表4。
随动物模型病变加重，尽管血浆ET呈不规则上升，但ET mRNA表达仍呈持续规律性增加。而血浆NO、血管NOS mRNA表达则呈规律性减少；而在治疗后上述指标则呈相反变化。表2 ASO患者血浆ET、NO含量及PGE1治疗后变化(
±s)对照组(n=30)
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病人组(n=96)
治疗前
治疗2 w
治疗5 w
治疗8 w
治疗14 w
ET(ng/L)
41.78±11.65
94.30±8.921)
72.44±10.111)2)
70.11±9.321)2)
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50.44±11.221)3)
47.33±11.593)
NO(μmol/L)
5.30±0.37
2.46±0.681)
2.87±0.431)2)
2.95±0.411)2)
3.02±0.681)3)
5.21±0.443)
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治疗前与对照组比较：1)P<0.01；治疗前与治疗后比较：1)P<0.05，2)P<0.01表3 ASO家兔模型制作过程中血ET NO及病变血管NOS活性ET mRNA和NOS mRNA表达结果(
±s) 组别n
ET
NO
NOS活性
iNOS mRNA
cNOS mRNA
ET mRNA
造模0 w
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8
80.22±11.88
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造模2 w
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造模5 w
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造模8 w
8
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5.42±1.192)
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0.143±0.0712)
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造模14 w
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造模20 w
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844.58±92.332)
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与制模前比较：1)P<0.05，2)P<0.01表4 ASO家兔模型PGE1治疗前后ET、NO及其mRNA表达结果(
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cNOS mRNA
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造模0 w
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844.58±92.33
5.72±1.11
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造模2 w
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造模5 w
8
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造模8 w
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0.214±0.0142)
0.433±0.0932)
0.439±0.3212)
造模14 w
8
98.44±58.222)
, http://www.100md.com
9.23±1.432)
0.212±0.0492)
0.249±0.0192)
0.423±0.0822)
0.423±0.2122)
与治疗前比较：1)P<0.05，2)P<0.01
3 讨 论
3.1 ET、NO及其基因表达在ASO形成中的作用和地位 目前认为内皮损伤、脂质渗入、平滑肌增殖、自由基损伤、血栓形成等诸多因素在AS-ASO的形成过程中均起到重要作用，并认为内皮细胞损伤是其重要的始动环节〔6～8〕。内皮细胞在生物、化学和物理等有害因子作用下，释放和代谢功能遭到破坏，继发各种细胞因子、生长因子、粘附蛋白等活性物质基因高表达，共同参与AS的产生，构成AS向ASO形成和发展的连锁反应；1992年Ross重新修正的损伤反应学说的基本内容即为上述观点〔9〕。ET、NO是内皮细胞分泌和产生的一对血管活性因子，前者具有强烈的血管收缩、促进平滑肌增生和血小板聚集的作用，NO则与之相反，二者相互制约，共同维持血管舒缩功能的稳定和血液的正常流动。内皮损伤后ET合成增多而NO合成减少，从而为AS向ASO形成和发展提供了条件。本实验ASO动物模型和不同病期的ASO病人血液ET、NO和血管NOS活性、ET mRNA、NOS mRNA基因表达结果，亦表明ET、NO及其基因异常表达在ASO形成过程中具有重要的发病学意义。
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3.2 ET、NO与ASO病变严重程度的关系 本组动物实验和临床资料表明，ASO患者及动物模型随病情加重血浆ET逐渐升高、血浆NO逐渐降低，ET、NO mRNA表达及其相应的变化与ASO病变程度密切相关。临床分期的主要依据是肢体缺血表现的程度，而缺血程度不仅取决于AS病变的范围、动脉闭塞的高度、长度、发展速度，而且取决于肢体血液流量减少的绝对量，取决于严重缺血造成的动脉内皮细胞损害程度。基于上述观点，ET、NO及其基因表达的变化，除取决于动脉本身病变外，还取决于闭塞远段血管及其侧枝血管内皮细胞的损伤程度。
3.3 ET、NO、ET mRNA、NOS mRNA检测的临床意义 本研究表明，ET、NO及其基因表达同ASO病变程度有着密切关系，可作为诊断和判断病情严重性的依据；同时表明，NO、ET及其基因表达的异常变化，随治疗时间的延长和病情的好转逐渐趋于正常，可见ET、NO、ET mRNA、NOS mRNA检测为判定疗效提供了客观指标，也为PGE1治疗机制的探讨提供了新的理论依据；ASO是一个慢性疾病，获得良好治疗效果亦较缓慢；PGE1治疗ASO一般2个疗程以上(15～20 d为一疗程)，缺血性病变才会有根本的好转〔6〕。本组资料亦展示出与临床相吻合的结果，即治疗14 w时，ET、NO才趋于正常。
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治疗ASO的药物较多，虽均有改善肢体血液循环的作用，但又各有其特点。基因疗法是治疗ASO的新的发展趋势〔10，11〕。本实验结果为应用ET拮抗剂、NO供体及从ET、NOS基因角度选用基因治疗方案提供了理论依据，也为疗效判定制定了分子水平和基因水平的实验标准。 中国博士后基金资助项目
作者简介：王春喜，37岁，主治医师，博士后，主要从事动脉硬化闭塞症基础和临床研究
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收稿日期：1999-06-29
修回日期：1999-12-31, 百拇医药