流式细胞仪在膀胱癌多药耐受研究中的应用
作者：章小平 鲁功成 杨红枚
单位：章小平 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科 武汉，430022)；杨红枚(同济医科大学附属协和医院检验科)
关键词：膀胱癌；多药耐受相关蛋白；流式细胞术
临床泌尿外科杂志000913 摘要 目的：探讨流式细胞仪(FCM)在膀胱癌多药耐受研究中的应用。方法：利用蛋白质印迹、免疫细胞化学和FCM检测并比较膀胱癌多药耐受细胞EJ/MRP的多药耐受糖蛋白(P-gp)和多药耐受相关蛋白(MRP)的表达；利用FCM检测了EJ/MRP药物耐受的功能水平。结果：EJ/MRP高表达MRP，无明显P-gp表达，FCM的检测结果与蛋白质印迹、免疫细胞化学的结果一致，但检测更简便；功能检测显示柔红霉素(DNR)可以作为FCM检测MRP功能的发光探针，细胞外排药物的功能增强至少是MRP高表达的膀胱癌细胞内药物聚集减少的一个重要原因。结论：FCM是检测膀胱癌多药耐受蛋白质表达水平和MRP功能水平的好方法，DNR是FCM检测MRP功能的良好探针。
, http://www.100md.com
The application of flow cytometer in multidrug resistant study of bladder carcinoma
ZHANG Xiao-ping LU Gong-cheng
(Department of Urology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
YANG Hong-mei
(Department of Clinical Laboratory,Union Hospital,Tongji Medical University)
Abstract Purpose:To observe the application of flow cytometer (FCM) in multidrug resistant (MDR) study of bladder carcinoma.Methods:The expression of P-glycoprotein (P-gp) and multidrug resistant associated protein (MRP) of EJ/MRP,a multidrug resistant cell line of bladder carcinoma,was tested by western blot,immunocytochemistry and FCM method.The function level of drug resistance of EJ/MRP was also detected by FCM.Results:EJ/MRP over-expressed MRP but without obvious P-gp expression.The results of protein detection by FCM were consistent with those by western blot and immunocytochemistry,but more convenient.The function detection showed daunorubicin (DNR) could be used as a probe to detect the function of MRP by FCM,and the increase of efflux of intracellular drug was at least an important cause to lead to the decrease of intracellular drug accumulation.Conclusions:FCM is a good method to detect MDR protein and MRP function of bladder carcinoma,and DNR is a good probe to detect MRP function by FCM.
, 百拇医药
Key words Bladder carcinoma Multidrug resistant-associated protein Flow cytometry
流式细胞仪(FCM)作为一种先进的细胞检测仪器在基础研究和临床实践的各个方面正受到日益广泛的重视与应用。我们以膀胱癌为对象观察了FCM在肿瘤多药耐受(MDR)研究中的应用。
1 材料和方法
1.1 细胞系及培养
膀胱癌细胞系EJ由北京医科大学肿瘤研究所赠送；EJ/MRP和EJ/Vect分别为转染含全长多药耐受相关蛋白(MRP)基因cDNA的pCI-neo/MRP载体和空载体pCI-neo，经G418持续压力筛选而建立的EJ亚系〔1〕。以含7%小牛血清、不含抗生素的RPMI 1640(Gibco产品)培养。设EJ/Vect细胞作为对照。
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1.2 细胞系蛋白质水平的检测
1.2.1 蛋白质免疫印迹(western immunoblot)：常规分离、提取和准备质膜蛋白质。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后在200 V电压下转膜30 min。将膜用羊血清封闭(以去除非特异性抗体结合)，4℃过夜后，分别用1∶500稀释的鼠抗人P-gp单抗JBS-1(武汉博士德公司)或1∶1 000稀释的鼠抗人MRP单抗QCRL-1(由MRP基因的发现者Cole S.P.C惠赠)将膜浸泡，作用1 h后洗膜，加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃作用0.5 h后再洗膜，加SABC试剂(武汉博士德公司)，37℃作用30 min后洗膜，加DAB显色后晾干、摄片。
1.2.2 免疫细胞化学法检测P-gp和MRP：利用免疫细胞化学SABC方法检测P-gp和MRP表达，方法见说明书。以PBS代替一抗为阴性对照。
1.2.3 FCM检测P-gp和MRP：将两种细胞传代、培养36 h后收获，1 000 r/min离心5～10 min，弃去上清。用冷的PBS洗2次，用-20℃ 80%的乙醇固定过夜。冷PBS洗3次，分别加100 μl的单抗JSB-1和单抗QRCL-1，37℃孵育40 min；冷PBS再洗2次，每管再加入100 μl FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶20)，37℃孵育40 min；冷PBS洗3次，用500 μl冷PBS混匀细胞后FCM(FAC Sort，Becton Dickinon)检测。以PBS代替一抗为阴性对照。每个标本检测的细胞数超过6 000个。
, 百拇医药
1.3 FCM检测细胞内药物聚集或滞留
各取长满单层的EJ/MRP和EJ/Vect细胞，加入可发红光的柔红霉素(daunorubicin，DNR)使培养基DNR终浓度达2 μmol/L。分别每30 min各取1瓶细胞，消化收获，冷PBS(0℃)吹洗、离心3次后，用500 μl冷PBS吹散细胞，在FCM上检测(激发光源波长488 nm，滤过光源波长575 nm)。把刚加入DNR即收获的细胞作为对照，时间设为0 min，以排除细胞自身发光和细胞非特异性粘附DNR的发光。取时间为横坐标，对数荧光度为纵坐标作图，观察DNR在两种细胞内的聚集情况。另各取3瓶细胞，在DNR作用下至胞内DNR处于稳定状态时，换用无DNR的培养液，定时观察细胞内DNR的外排情况。每个标本检测的细胞数超过6 000个。
2 结果
2.1 蛋白质印迹
, http://www.100md.com 免疫杂交显示EJ/MRP细胞在190 kDa处有一条较强的带，EJ/Vect无类似带，两种细胞都无明显的P-gp显带。
2.2 免疫细胞化学方法检测
免疫细胞化学SABC法检测发现EJ/MRP呈MRP阳性表达，表达部位主要位于细胞膜和细胞质，EJ/Vect未测及MRP的表达。两种细胞都无P-gp的表达。
2.3 FCM免疫荧光检测
EJ/MRP细胞的MRP对数荧光强度较EJ/Vect细胞明显提高，在坐标图中表现为明显右移，而两种细胞P-gp的对数荧光强度则无明显变化，在图坐标中表现为几乎重叠。进一步分析EJ/MRP荧光染色率分别为MRP 87.5%，P-gp 7.4%，EJ/Vect的荧光染率分别为MRP 14.2%，P-gp 5.3%。EJ/MRP的MRP荧光染色率较EJ/Vect的增加了6.2倍，两者差异有显著性意义(P<0.05)；而P-gp在转染MRP前后的荧光染色率反映都无明显表达。由于存在非特异性染色及FCM检测的高度敏感性，所以一种蛋白质染色率在10%以下不能肯定有该蛋白质表达。
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2.4 药物DNR在细胞内的聚集和滞留
随着DNR作用时间延长，EJ/MRP和EJ/Vect细胞内DNR浓度都上升，前者上升的速度和幅度均小于后者。具体见图1。180 min时，两种细胞内DNR浓度达到一个稳定状态。此时EJ/MRP的DNR浓度只有EJ/Vect的67%。在DNR浓度达到稳定状态时换用无DNR的培养液，则可见EJ/MRP外排DNR速度稍快于EJ/Vect细胞。由此推断，在相同条件下，EJ/MRP细胞内的DNR聚集程度低于EJ/Vect细胞，前者DNR外排速度亦快于后者。
图1 药物DNR在EJ/Vect、EJ/MRP细胞内的聚集和滞留
3 讨论
检测耐药蛋白质的常用方法是蛋白质印迹和一般的免疫细胞化学方法，但这些方法操作较复杂，实验周期长，相比之下FCM检测耐药蛋白不仅具有简便、敏感、重复性好的优点，而且FCM能够精确计算阳性细胞的百分率，其准确性和重复性超过免疫组织化学方法的光镜观测。我们的研究表明，FCM检测的结果与蛋白质印迹和一般的免疫细胞化学方法的结果基本一致。虽然FCM检测不能显示蛋白质的具体表达部位，但FCM作为蛋白质检测的简便方法至少可以部分替代蛋白质印迹和一般的免疫细胞化学方法。我们体会，在FCM的耐药蛋白检测中应注意以下几个方面：①细胞要消化适当，如果消化不充分，细胞易两个或多个聚集在一起，影响检测结果；若消化过分，则破碎细胞增多，也会影响检测结果。②细胞是否固定取决于抗体的特性，如果抗体识别的位点位于细胞外膜，则可直接应用活细胞，无需固定；如果抗体识别的位点位于细胞内膜或细胞内，则需固定细胞以便抗体进入细胞。③细胞收集时离心速度宜控制在1 000～1 500 r/min之间，否则易使细胞破碎，尤其当细胞固定后。
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目前已有的资料充分表明P-gp是一种跨细胞膜的药物泵，能将进入细胞内的一些化疗药物泵出细胞外从而导致MDR。至于对MRP在功能细胞中的分布部位、功能和作用方式则一直存在不同看法，但目前至少肯定MRP的部分功能与P-gp相似，即具有跨膜药物泵的功能〔2〕。因此检测肿瘤细胞内药物聚集和外排是评价P-gp和MRP介导的MDR水平的很有说服力的一个方面。利用特定发光染料的FCM检测是评价MDR细胞功能水平的好方法〔3〕，它与同位素标记的方法相比，过程简单，无同位素污染和损伤。检测P-gp的常用发光探针是Rh123和DNR。最近一项研究比较了Rh123，DNR和Calcein-Am在检测P-gp和MRP中的敏感性，发现Calcein-Am不能被P-gp有效地外排，Rh123不能被MRP有效地外排〔4〕，故我们使用DNR作为探针检测P-gp和MRP功能。由于膀胱癌细胞EJ/MRP稳定高表达MRP而无P-gp的表达，通过FCM检测后我们发现，DNR是FCM检测MRP介导的MDR的一种良好发光探针；EJ/MRP细胞内聚集的DNR浓度下降了33%，为解释DNR聚集减少的原因，又补充观察了细胞外排DNR的功能状况，结果认为细胞外排药物的功能增强至少是膀胱癌细胞内聚集药物减少的一个重要原因。
, 百拇医药
本研究进一步表明，FCM是检测膀胱癌多药耐受蛋白质表达水平和蛋白质功能水平的好方法，DNR是FCM检测MRP功能的良好探针，预计FCM在其他肿瘤的多药耐受蛋白质检测中也具有类似作用。
国家自然科学基金资助项目(编号 39670723)
参考文献
1，章小平，杨红枚，鲁功成.膀胱癌MRP亚克隆的建立及其MDR表型.中华肿瘤杂志，2000，22：8～10
2，Zaman G J R,Flens M J,Van Leusden M R,et al.The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8822～8826
, http://www.100md.com
3，Perez-Simon J A,Valverde B,Martinez A,et al.Related articles correlation of rhodamine 123 efflux by neoplastic plasma cells with clinical and biological characteristics of multiple myeloma.Cytometry,1999,15,38:24～29
4，Feller N,Kuiper C M,Lankelma J,et al.Functional detection of MDR1/P170 and MRP/P190-mediated multidrug resitance in tumor cells by flow cytometry.Br J Cancer,1995,72:543～549
(收稿日期：2000-05-31), 百拇医药
单位：章小平 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科 武汉，430022)；杨红枚(同济医科大学附属协和医院检验科)
关键词：膀胱癌；多药耐受相关蛋白；流式细胞术
临床泌尿外科杂志000913 摘要 目的：探讨流式细胞仪(FCM)在膀胱癌多药耐受研究中的应用。方法：利用蛋白质印迹、免疫细胞化学和FCM检测并比较膀胱癌多药耐受细胞EJ/MRP的多药耐受糖蛋白(P-gp)和多药耐受相关蛋白(MRP)的表达；利用FCM检测了EJ/MRP药物耐受的功能水平。结果：EJ/MRP高表达MRP，无明显P-gp表达，FCM的检测结果与蛋白质印迹、免疫细胞化学的结果一致，但检测更简便；功能检测显示柔红霉素(DNR)可以作为FCM检测MRP功能的发光探针，细胞外排药物的功能增强至少是MRP高表达的膀胱癌细胞内药物聚集减少的一个重要原因。结论：FCM是检测膀胱癌多药耐受蛋白质表达水平和MRP功能水平的好方法，DNR是FCM检测MRP功能的良好探针。
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The application of flow cytometer in multidrug resistant study of bladder carcinoma
ZHANG Xiao-ping LU Gong-cheng
(Department of Urology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
YANG Hong-mei
(Department of Clinical Laboratory,Union Hospital,Tongji Medical University)
Abstract Purpose:To observe the application of flow cytometer (FCM) in multidrug resistant (MDR) study of bladder carcinoma.Methods:The expression of P-glycoprotein (P-gp) and multidrug resistant associated protein (MRP) of EJ/MRP,a multidrug resistant cell line of bladder carcinoma,was tested by western blot,immunocytochemistry and FCM method.The function level of drug resistance of EJ/MRP was also detected by FCM.Results:EJ/MRP over-expressed MRP but without obvious P-gp expression.The results of protein detection by FCM were consistent with those by western blot and immunocytochemistry,but more convenient.The function detection showed daunorubicin (DNR) could be used as a probe to detect the function of MRP by FCM,and the increase of efflux of intracellular drug was at least an important cause to lead to the decrease of intracellular drug accumulation.Conclusions:FCM is a good method to detect MDR protein and MRP function of bladder carcinoma,and DNR is a good probe to detect MRP function by FCM.
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Key words Bladder carcinoma Multidrug resistant-associated protein Flow cytometry
流式细胞仪(FCM)作为一种先进的细胞检测仪器在基础研究和临床实践的各个方面正受到日益广泛的重视与应用。我们以膀胱癌为对象观察了FCM在肿瘤多药耐受(MDR)研究中的应用。
1 材料和方法
1.1 细胞系及培养
膀胱癌细胞系EJ由北京医科大学肿瘤研究所赠送；EJ/MRP和EJ/Vect分别为转染含全长多药耐受相关蛋白(MRP)基因cDNA的pCI-neo/MRP载体和空载体pCI-neo，经G418持续压力筛选而建立的EJ亚系〔1〕。以含7%小牛血清、不含抗生素的RPMI 1640(Gibco产品)培养。设EJ/Vect细胞作为对照。
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1.2 细胞系蛋白质水平的检测
1.2.1 蛋白质免疫印迹(western immunoblot)：常规分离、提取和准备质膜蛋白质。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后在200 V电压下转膜30 min。将膜用羊血清封闭(以去除非特异性抗体结合)，4℃过夜后，分别用1∶500稀释的鼠抗人P-gp单抗JBS-1(武汉博士德公司)或1∶1 000稀释的鼠抗人MRP单抗QCRL-1(由MRP基因的发现者Cole S.P.C惠赠)将膜浸泡，作用1 h后洗膜，加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃作用0.5 h后再洗膜，加SABC试剂(武汉博士德公司)，37℃作用30 min后洗膜，加DAB显色后晾干、摄片。
1.2.2 免疫细胞化学法检测P-gp和MRP：利用免疫细胞化学SABC方法检测P-gp和MRP表达，方法见说明书。以PBS代替一抗为阴性对照。
1.2.3 FCM检测P-gp和MRP：将两种细胞传代、培养36 h后收获，1 000 r/min离心5～10 min，弃去上清。用冷的PBS洗2次，用-20℃ 80%的乙醇固定过夜。冷PBS洗3次，分别加100 μl的单抗JSB-1和单抗QRCL-1，37℃孵育40 min；冷PBS再洗2次，每管再加入100 μl FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶20)，37℃孵育40 min；冷PBS洗3次，用500 μl冷PBS混匀细胞后FCM(FAC Sort，Becton Dickinon)检测。以PBS代替一抗为阴性对照。每个标本检测的细胞数超过6 000个。
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1.3 FCM检测细胞内药物聚集或滞留
各取长满单层的EJ/MRP和EJ/Vect细胞，加入可发红光的柔红霉素(daunorubicin，DNR)使培养基DNR终浓度达2 μmol/L。分别每30 min各取1瓶细胞，消化收获，冷PBS(0℃)吹洗、离心3次后，用500 μl冷PBS吹散细胞，在FCM上检测(激发光源波长488 nm，滤过光源波长575 nm)。把刚加入DNR即收获的细胞作为对照，时间设为0 min，以排除细胞自身发光和细胞非特异性粘附DNR的发光。取时间为横坐标，对数荧光度为纵坐标作图，观察DNR在两种细胞内的聚集情况。另各取3瓶细胞，在DNR作用下至胞内DNR处于稳定状态时，换用无DNR的培养液，定时观察细胞内DNR的外排情况。每个标本检测的细胞数超过6 000个。
2 结果
2.1 蛋白质印迹
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2.2 免疫细胞化学方法检测
免疫细胞化学SABC法检测发现EJ/MRP呈MRP阳性表达，表达部位主要位于细胞膜和细胞质，EJ/Vect未测及MRP的表达。两种细胞都无P-gp的表达。
2.3 FCM免疫荧光检测
EJ/MRP细胞的MRP对数荧光强度较EJ/Vect细胞明显提高，在坐标图中表现为明显右移，而两种细胞P-gp的对数荧光强度则无明显变化，在图坐标中表现为几乎重叠。进一步分析EJ/MRP荧光染色率分别为MRP 87.5%，P-gp 7.4%，EJ/Vect的荧光染率分别为MRP 14.2%，P-gp 5.3%。EJ/MRP的MRP荧光染色率较EJ/Vect的增加了6.2倍，两者差异有显著性意义(P<0.05)；而P-gp在转染MRP前后的荧光染色率反映都无明显表达。由于存在非特异性染色及FCM检测的高度敏感性，所以一种蛋白质染色率在10%以下不能肯定有该蛋白质表达。
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2.4 药物DNR在细胞内的聚集和滞留
随着DNR作用时间延长，EJ/MRP和EJ/Vect细胞内DNR浓度都上升，前者上升的速度和幅度均小于后者。具体见图1。180 min时，两种细胞内DNR浓度达到一个稳定状态。此时EJ/MRP的DNR浓度只有EJ/Vect的67%。在DNR浓度达到稳定状态时换用无DNR的培养液，则可见EJ/MRP外排DNR速度稍快于EJ/Vect细胞。由此推断，在相同条件下，EJ/MRP细胞内的DNR聚集程度低于EJ/Vect细胞，前者DNR外排速度亦快于后者。
图1 药物DNR在EJ/Vect、EJ/MRP细胞内的聚集和滞留
3 讨论
检测耐药蛋白质的常用方法是蛋白质印迹和一般的免疫细胞化学方法，但这些方法操作较复杂，实验周期长，相比之下FCM检测耐药蛋白不仅具有简便、敏感、重复性好的优点，而且FCM能够精确计算阳性细胞的百分率，其准确性和重复性超过免疫组织化学方法的光镜观测。我们的研究表明，FCM检测的结果与蛋白质印迹和一般的免疫细胞化学方法的结果基本一致。虽然FCM检测不能显示蛋白质的具体表达部位，但FCM作为蛋白质检测的简便方法至少可以部分替代蛋白质印迹和一般的免疫细胞化学方法。我们体会，在FCM的耐药蛋白检测中应注意以下几个方面：①细胞要消化适当，如果消化不充分，细胞易两个或多个聚集在一起，影响检测结果；若消化过分，则破碎细胞增多，也会影响检测结果。②细胞是否固定取决于抗体的特性，如果抗体识别的位点位于细胞外膜，则可直接应用活细胞，无需固定；如果抗体识别的位点位于细胞内膜或细胞内，则需固定细胞以便抗体进入细胞。③细胞收集时离心速度宜控制在1 000～1 500 r/min之间，否则易使细胞破碎，尤其当细胞固定后。
, http://www.100md.com
目前已有的资料充分表明P-gp是一种跨细胞膜的药物泵，能将进入细胞内的一些化疗药物泵出细胞外从而导致MDR。至于对MRP在功能细胞中的分布部位、功能和作用方式则一直存在不同看法，但目前至少肯定MRP的部分功能与P-gp相似，即具有跨膜药物泵的功能〔2〕。因此检测肿瘤细胞内药物聚集和外排是评价P-gp和MRP介导的MDR水平的很有说服力的一个方面。利用特定发光染料的FCM检测是评价MDR细胞功能水平的好方法〔3〕，它与同位素标记的方法相比，过程简单，无同位素污染和损伤。检测P-gp的常用发光探针是Rh123和DNR。最近一项研究比较了Rh123，DNR和Calcein-Am在检测P-gp和MRP中的敏感性，发现Calcein-Am不能被P-gp有效地外排，Rh123不能被MRP有效地外排〔4〕，故我们使用DNR作为探针检测P-gp和MRP功能。由于膀胱癌细胞EJ/MRP稳定高表达MRP而无P-gp的表达，通过FCM检测后我们发现，DNR是FCM检测MRP介导的MDR的一种良好发光探针；EJ/MRP细胞内聚集的DNR浓度下降了33%，为解释DNR聚集减少的原因，又补充观察了细胞外排DNR的功能状况，结果认为细胞外排药物的功能增强至少是膀胱癌细胞内聚集药物减少的一个重要原因。
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本研究进一步表明，FCM是检测膀胱癌多药耐受蛋白质表达水平和蛋白质功能水平的好方法，DNR是FCM检测MRP功能的良好探针，预计FCM在其他肿瘤的多药耐受蛋白质检测中也具有类似作用。
国家自然科学基金资助项目(编号 39670723)
参考文献
1，章小平，杨红枚，鲁功成.膀胱癌MRP亚克隆的建立及其MDR表型.中华肿瘤杂志，2000，22：8～10
2，Zaman G J R,Flens M J,Van Leusden M R,et al.The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8822～8826
, http://www.100md.com
3，Perez-Simon J A,Valverde B,Martinez A,et al.Related articles correlation of rhodamine 123 efflux by neoplastic plasma cells with clinical and biological characteristics of multiple myeloma.Cytometry,1999,15,38:24～29
4，Feller N,Kuiper C M,Lankelma J,et al.Functional detection of MDR1/P170 and MRP/P190-mediated multidrug resitance in tumor cells by flow cytometry.Br J Cancer,1995,72:543～549
(收稿日期：2000-05-31), 百拇医药