膀胱癌多药耐受相关蛋白和P53的表达及相关性分析
作者：章小平 鲁功成 杨红枚
单位：章小平 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科，武汉，430022)；杨红枚(同济医科大学附属协和医院检验科)
关键词：多药耐受相关蛋白；蛋白质P53；膀胱肿瘤
临床泌尿外科杂志000815 摘要 目的：分析膀胱癌多药耐受相关蛋白(MRP)、突变型P53(mtP53)的表达及两者的相关性。方法：利用链霉亲和素生物素酶复合物法(SABC法)检测了93例膀胱癌和10例正常膀胱粘膜的MRP、mtP53表达，并分析了两者表达的相关性。结果：膀胱癌与正常膀胱粘膜间的MRP、mtP53表达差异分别有显著性意义(P<0.05)和极显著性意义(P<0.01)；MRP和mtP53表达具有较强的相关性(r=0.682，P<0.01)。结论：膀胱癌MRP、mtP53的表达显著增强，两者表达具有密切的相关性。
, http://www.100md.com The expression of multidrug-resistant associated protein and P53 in bladder carcinoma and their correlative analysis
ZHANG Xiao-ping LU Gong-cheng
(Department of Urology,Xiehe Hosoital,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
YANG Hong-mei
(Department of Clinical laboratory,Xiehe Hosoital,Tongji Medical University)
Abstract Purpose:To observe the expression of multidrug-resistant associated protein (MRP) and mutant P53 (mtP53) in human bladder carcinoma, and to analyse their correlation.Methods:MRP and mtP53 expression in 93 samples of bladder carcinoma and 10 normal bladder mucosa samples were detected by using immunohistochemical streptavidin-biotin-enzyme complex(SABC) method, and their correlation was also analysed.Results:There has statistical difference in MRP expression (P<0.05) and significantly statistical difference in mtP53 expression (P<0.01) between malignant tumors and normal mucosa, respectively. There has strong correlation between MRP and mtP53 expression(r=0.682,P<0.01).Conclusions:Our studies revealed that the expression of MRP and mtP53 in bladder carcinoma increased obviously and there existed close correlation between them.
, 百拇医药
Key words Multidrug resistant-associated protein Protein p53 Bladder tumor
多药耐受糖蛋白(P-gp)和多药耐受相关蛋白(MRP)都是介导膀胱肿瘤多药耐受(MDR)的重要因素，但有关膀胱肿瘤标本MRP表达的研究较少。近来一些研究表明，癌基因的激活或抑癌基因的失活和MDR基因高表达有关，其中突变型P53(mtP53)作为与膀胱肿瘤发生、发展相关性最高的癌基因，与膀胱癌MRP表达的关系尚未见报道。为了探讨膀胱癌MRP和P53的表达及其相关性，我们采用SABC法对1996年9月～1998年11月收集经病理检查证实的膀胱癌石蜡标本93例进行了组织学分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 组织标本
本组膀胱癌石蜡标本93例，其中移行上皮细胞癌(TCC)86例，鳞癌(SC)3例，腺癌(AC)3例，膀胱透明细胞癌侵及膀胱壁全层伴左腹股沟淋巴结转移1例。另取正常膀胱粘膜10例作为对照。
, 百拇医药
1.2 检测方法
采用链霉素亲和素生物素酶复合物法(SABC法)进行免疫组织化学染色，对相邻的连续切片在相同条件下分别检测了MRP和mtP53的表达。SABC试剂盒和鼠抗人mtP53单克隆抗体BP53-12(Sigma公司产品)购自博士得公司，MRP单克隆抗体QCRL-1由加拿大Cole博士惠赠。
将石蜡标本切片浸入0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)中，用微波炉加热至96～100℃，持续20～30 min。冷却后滴加抗原修复液，在室温中置10 min，用蒸馏水洗3次后，滴加正常工作血清封闭液，在室温中置10 min。甩去多余液体，加上P53单抗(按1∶400稀释)或MRP单抗(按1∶200稀释)，在4℃温度中过夜；用0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃中置20 min，再用0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加试剂SABC，在37℃中置20 min，用0.01 mol/L PBS洗5 min×4次，置放DAB显色，镜下控制显色时间。用蒸馏水洗涤停止显色，用苏木素轻度复染，分别进行脱水、透明、封片，在显微镜下观察。以PBS分别代替QCRL-1和BP53-12为阴性对照，以我们自建的转染全长MRP cDNA的EJ/ERP细胞为MRP阳性对照，以乳腺癌标本为P53阳性对照(由博士得公司提供)。
, 百拇医药
1.3 结果判定
每一切片随机选择3个视野，利用免疫图像分析系统分别测定肿瘤细胞的阳性染色百分率，求取平均阳性染色百分率，同时观察染色部位和染色强度。肿瘤细胞MRP阳性染色百分率<10%为阴性，≥10%为阳性；肿瘤细胞mtP53完全没有染色为阴性，反之则为阳性。膀胱癌和正常膀胱粘膜中的MRP或mtP53表达的比较用χ2检验进行分析，MRP和mtP53表达的相关性用直线回归进行分析。
2 结果
2.1 MRP和mtP53在膀胱癌和正常膀胱粘膜中的表达
结果见表1。
表1 MRP和mtP53在膀胱癌和正常粘膜中的表达例 组织
例数
, http://www.100md.com
MRP表达
mtP53表达
阴性
阳性
阴性
阳性
正常膀胱
10
7
3
9
1
TCC
, http://www.100md.com 86
26
60
20
66
SC
3
0
3
0
3
AC
3
1
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2
1
2
透明细胞癌
1
0
1
0
1
由表1可知，正常膀胱粘膜有一定程度的MRP表达(30%)，染色强度低；只有1例有mtP53表达，核染色弱。膀胱癌的MRP表达率明显上升(71%)，其中TCC的MRP表达率为70%，与正常膀胱粘膜MRP表达率相比差异有显著性意义(P<0.05)；膀胱癌的mtP53表达率为77%，其中TCC的mtP53表达率为77%，与正常膀胱粘膜相比差异有极显著性意义(P<0.01)。由此可见，膀胱癌的MRP和mtP53表达较正常膀胱粘膜有显著升高；大部分肿瘤细胞的MRP阳性部位位于细胞膜和细胞质中；mtP53染色以核染色为主。
, 百拇医药
2.2 膀胱癌MRP和mtP53表达的相关性
分别对每个标本的MRP、mtP53阳性细胞染色率进行直线回归分析，结果发现MRP表达和mtP53表达具有明显的相关性(r=0.682，P<0.01)。
3 讨论
膀胱癌具有容易获得MDR的生物学特性，而MDR是导致膀胱癌临床化疗失败的重要原因。Park和Grossman等已经证实P-gp表达水平与膀胱癌的恶性行为、病理学分级、分期、肿瘤复发及化疗效果密切相关。新近发现的MRP也是介导膀胱癌MDR的重要因素。Hasegawa在体外用阿霉素诱导发现MRP、P-gp和Topo Ⅱ高表达。Kim等〔1〕也发现了阿霉素诱导的耐药膀胱癌细胞MRP、P-gp、Topo Ⅱ和GSH/GST高表达，并认为细胞是通过MRP而不是P-gp外泵胞内药物，且Topo Ⅱ和GSH/GST在非P-gp介导的MDR中也起重要作用。我们将MRP cDNA转入膀胱癌EJ细胞，发现转染子MRP高表达而无P-gp表达，呈典型的MDR表型〔2〕。而Kubo〔3〕、Clifford〔4〕和本文研究揭示MRP与临床膀胱癌MDR有密切关系。P53是重要的抑癌基因之一，也是许多恶性肿瘤中十分常见的共同基因损伤目标，已有的资料(包括本文观察结果)均表明P53结构改变及表达异常和膀胱癌的发生、发展密切相关。
, 百拇医药
许多化疗药物可导致肿瘤细胞凋亡、DNA修复能力下降，而众多癌基因和抑癌基因与细胞凋亡、DNA损伤修复能力密切相关。因此，研究癌基因和抑癌基因与化疗及MDR的关系已成为肿瘤研究的新趋向。Chin等作体外实验发现ras、mtP53基因可激活P-gp的编码基因mdrl的启动子，从而诱导mdrl表达；而Lim认为乳癌中P53和P-gp常常共表达，提示预后差；国内高振强等〔6〕将mtP53基因转入人肺癌细胞，发现mtP53基因可以增加肺癌细胞的耐药性，进一步检测发现转染子P-gp表达没有增高，MRP表达稍有增高，由此推测mtP53相关的耐药性和MRP有一定关系；Wang等〔6〕发现野生型P53(wtP53)可以下调MRP的转录水平；但在胃癌的研究中发现两者并无相关性〔7〕。上述研究说明，mtP53使MRP表达增强，而wtP53使MRP表达降低，在一些肿瘤中两者表达呈相关关系，提示预后不佳。本文研究发现，在膀胱癌中，MRP和P53常常共表达，且两者具有密切的相关性。这种相关性提示肿瘤MDR是一个多因素作用的复杂生物过程，与癌基因的激活或抑癌基因的失活等密切相关。但膀胱癌中MRP和P53的共同表达是否受某一共同途径调控或两者存在因果关系，是否与膀胱癌临床化疗效果、患者预后有关还有待于更深入的研究。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助课题
参考文献
1，Kim W J,Kakehi Y,Yoshida O.Multifactorial involvement of multidrug resistance-associated (correction of resiswtance) protein,DNA topoisomerase Ⅱ and glutathione/glutathione-s-transferase in non P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human bladder cancer cells.Int J Urol,1997,4:583～590
2，章小平，鲁功成，杨红枚.膀胱癌稳定表达MRP亚克隆的一些生物学特征.中华实验外科杂志，2000，5：255～256
, http://www.100md.com
3，Kubo H,Sumizawa T,Koga K,et al.Expression on the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in urothelial carcinomas.Int J Cancer,1996,69:488～484
4，Clifford S C,Neal D E,Lunec J.Alterations in expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in high-grade transitional cell carcinoma of the bladder.Br J Cancer,1996,73:659～666
5，高振强，高志萍，刘喜富，等.逆转录病毒介导的突变型P53基因增加人肺癌细胞耐药性研究.中国科学(C辑)，1997，27：168～172
, 百拇医药
6，Oshika Y,Nakamura M,Tokunaga T,et al.Multidrug resistance-associated protein and mutant P53 protein expression in non-small cell lung cancer.Mod Pathol,1998,11:1059～1063
7，Endo K,Machara Y,Ichiyoshi Y,et al.Multidrug resistance-associated protein expression in clinical gastric carcinoma.Cancer,1996,77(Suppl 8):1681～1687
收稿 2000-04-27, 百拇医药
单位：章小平 鲁功成(同济医科大学附属协和医院泌尿外科，武汉，430022)；杨红枚(同济医科大学附属协和医院检验科)
关键词：多药耐受相关蛋白；蛋白质P53；膀胱肿瘤
临床泌尿外科杂志000815 摘要 目的：分析膀胱癌多药耐受相关蛋白(MRP)、突变型P53(mtP53)的表达及两者的相关性。方法：利用链霉亲和素生物素酶复合物法(SABC法)检测了93例膀胱癌和10例正常膀胱粘膜的MRP、mtP53表达，并分析了两者表达的相关性。结果：膀胱癌与正常膀胱粘膜间的MRP、mtP53表达差异分别有显著性意义(P<0.05)和极显著性意义(P<0.01)；MRP和mtP53表达具有较强的相关性(r=0.682，P<0.01)。结论：膀胱癌MRP、mtP53的表达显著增强，两者表达具有密切的相关性。
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ZHANG Xiao-ping LU Gong-cheng
(Department of Urology,Xiehe Hosoital,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
YANG Hong-mei
(Department of Clinical laboratory,Xiehe Hosoital,Tongji Medical University)
Abstract Purpose:To observe the expression of multidrug-resistant associated protein (MRP) and mutant P53 (mtP53) in human bladder carcinoma, and to analyse their correlation.Methods:MRP and mtP53 expression in 93 samples of bladder carcinoma and 10 normal bladder mucosa samples were detected by using immunohistochemical streptavidin-biotin-enzyme complex(SABC) method, and their correlation was also analysed.Results:There has statistical difference in MRP expression (P<0.05) and significantly statistical difference in mtP53 expression (P<0.01) between malignant tumors and normal mucosa, respectively. There has strong correlation between MRP and mtP53 expression(r=0.682,P<0.01).Conclusions:Our studies revealed that the expression of MRP and mtP53 in bladder carcinoma increased obviously and there existed close correlation between them.
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Key words Multidrug resistant-associated protein Protein p53 Bladder tumor
多药耐受糖蛋白(P-gp)和多药耐受相关蛋白(MRP)都是介导膀胱肿瘤多药耐受(MDR)的重要因素，但有关膀胱肿瘤标本MRP表达的研究较少。近来一些研究表明，癌基因的激活或抑癌基因的失活和MDR基因高表达有关，其中突变型P53(mtP53)作为与膀胱肿瘤发生、发展相关性最高的癌基因，与膀胱癌MRP表达的关系尚未见报道。为了探讨膀胱癌MRP和P53的表达及其相关性，我们采用SABC法对1996年9月～1998年11月收集经病理检查证实的膀胱癌石蜡标本93例进行了组织学分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 组织标本
本组膀胱癌石蜡标本93例，其中移行上皮细胞癌(TCC)86例，鳞癌(SC)3例，腺癌(AC)3例，膀胱透明细胞癌侵及膀胱壁全层伴左腹股沟淋巴结转移1例。另取正常膀胱粘膜10例作为对照。
, 百拇医药
1.2 检测方法
采用链霉素亲和素生物素酶复合物法(SABC法)进行免疫组织化学染色，对相邻的连续切片在相同条件下分别检测了MRP和mtP53的表达。SABC试剂盒和鼠抗人mtP53单克隆抗体BP53-12(Sigma公司产品)购自博士得公司，MRP单克隆抗体QCRL-1由加拿大Cole博士惠赠。
将石蜡标本切片浸入0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)中，用微波炉加热至96～100℃，持续20～30 min。冷却后滴加抗原修复液，在室温中置10 min，用蒸馏水洗3次后，滴加正常工作血清封闭液，在室温中置10 min。甩去多余液体，加上P53单抗(按1∶400稀释)或MRP单抗(按1∶200稀释)，在4℃温度中过夜；用0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃中置20 min，再用0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加试剂SABC，在37℃中置20 min，用0.01 mol/L PBS洗5 min×4次，置放DAB显色，镜下控制显色时间。用蒸馏水洗涤停止显色，用苏木素轻度复染，分别进行脱水、透明、封片，在显微镜下观察。以PBS分别代替QCRL-1和BP53-12为阴性对照，以我们自建的转染全长MRP cDNA的EJ/ERP细胞为MRP阳性对照，以乳腺癌标本为P53阳性对照(由博士得公司提供)。
, 百拇医药
1.3 结果判定
每一切片随机选择3个视野，利用免疫图像分析系统分别测定肿瘤细胞的阳性染色百分率，求取平均阳性染色百分率，同时观察染色部位和染色强度。肿瘤细胞MRP阳性染色百分率<10%为阴性，≥10%为阳性；肿瘤细胞mtP53完全没有染色为阴性，反之则为阳性。膀胱癌和正常膀胱粘膜中的MRP或mtP53表达的比较用χ2检验进行分析，MRP和mtP53表达的相关性用直线回归进行分析。
2 结果
2.1 MRP和mtP53在膀胱癌和正常膀胱粘膜中的表达
结果见表1。
表1 MRP和mtP53在膀胱癌和正常粘膜中的表达例 组织
例数
, http://www.100md.com
MRP表达
mtP53表达
阴性
阳性
阴性
阳性
正常膀胱
10
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, http://www.100md.com 86
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由表1可知，正常膀胱粘膜有一定程度的MRP表达(30%)，染色强度低；只有1例有mtP53表达，核染色弱。膀胱癌的MRP表达率明显上升(71%)，其中TCC的MRP表达率为70%，与正常膀胱粘膜MRP表达率相比差异有显著性意义(P<0.05)；膀胱癌的mtP53表达率为77%，其中TCC的mtP53表达率为77%，与正常膀胱粘膜相比差异有极显著性意义(P<0.01)。由此可见，膀胱癌的MRP和mtP53表达较正常膀胱粘膜有显著升高；大部分肿瘤细胞的MRP阳性部位位于细胞膜和细胞质中；mtP53染色以核染色为主。
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2.2 膀胱癌MRP和mtP53表达的相关性
分别对每个标本的MRP、mtP53阳性细胞染色率进行直线回归分析，结果发现MRP表达和mtP53表达具有明显的相关性(r=0.682，P<0.01)。
3 讨论
膀胱癌具有容易获得MDR的生物学特性，而MDR是导致膀胱癌临床化疗失败的重要原因。Park和Grossman等已经证实P-gp表达水平与膀胱癌的恶性行为、病理学分级、分期、肿瘤复发及化疗效果密切相关。新近发现的MRP也是介导膀胱癌MDR的重要因素。Hasegawa在体外用阿霉素诱导发现MRP、P-gp和Topo Ⅱ高表达。Kim等〔1〕也发现了阿霉素诱导的耐药膀胱癌细胞MRP、P-gp、Topo Ⅱ和GSH/GST高表达，并认为细胞是通过MRP而不是P-gp外泵胞内药物，且Topo Ⅱ和GSH/GST在非P-gp介导的MDR中也起重要作用。我们将MRP cDNA转入膀胱癌EJ细胞，发现转染子MRP高表达而无P-gp表达，呈典型的MDR表型〔2〕。而Kubo〔3〕、Clifford〔4〕和本文研究揭示MRP与临床膀胱癌MDR有密切关系。P53是重要的抑癌基因之一，也是许多恶性肿瘤中十分常见的共同基因损伤目标，已有的资料(包括本文观察结果)均表明P53结构改变及表达异常和膀胱癌的发生、发展密切相关。
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许多化疗药物可导致肿瘤细胞凋亡、DNA修复能力下降，而众多癌基因和抑癌基因与细胞凋亡、DNA损伤修复能力密切相关。因此，研究癌基因和抑癌基因与化疗及MDR的关系已成为肿瘤研究的新趋向。Chin等作体外实验发现ras、mtP53基因可激活P-gp的编码基因mdrl的启动子，从而诱导mdrl表达；而Lim认为乳癌中P53和P-gp常常共表达，提示预后差；国内高振强等〔6〕将mtP53基因转入人肺癌细胞，发现mtP53基因可以增加肺癌细胞的耐药性，进一步检测发现转染子P-gp表达没有增高，MRP表达稍有增高，由此推测mtP53相关的耐药性和MRP有一定关系；Wang等〔6〕发现野生型P53(wtP53)可以下调MRP的转录水平；但在胃癌的研究中发现两者并无相关性〔7〕。上述研究说明，mtP53使MRP表达增强，而wtP53使MRP表达降低，在一些肿瘤中两者表达呈相关关系，提示预后不佳。本文研究发现，在膀胱癌中，MRP和P53常常共表达，且两者具有密切的相关性。这种相关性提示肿瘤MDR是一个多因素作用的复杂生物过程，与癌基因的激活或抑癌基因的失活等密切相关。但膀胱癌中MRP和P53的共同表达是否受某一共同途径调控或两者存在因果关系，是否与膀胱癌临床化疗效果、患者预后有关还有待于更深入的研究。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助课题
参考文献
1，Kim W J,Kakehi Y,Yoshida O.Multifactorial involvement of multidrug resistance-associated (correction of resiswtance) protein,DNA topoisomerase Ⅱ and glutathione/glutathione-s-transferase in non P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human bladder cancer cells.Int J Urol,1997,4:583～590
2，章小平，鲁功成，杨红枚.膀胱癌稳定表达MRP亚克隆的一些生物学特征.中华实验外科杂志，2000，5：255～256
, http://www.100md.com
3，Kubo H,Sumizawa T,Koga K,et al.Expression on the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in urothelial carcinomas.Int J Cancer,1996,69:488～484
4，Clifford S C,Neal D E,Lunec J.Alterations in expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in high-grade transitional cell carcinoma of the bladder.Br J Cancer,1996,73:659～666
5，高振强，高志萍，刘喜富，等.逆转录病毒介导的突变型P53基因增加人肺癌细胞耐药性研究.中国科学(C辑)，1997，27：168～172
, 百拇医药
6，Oshika Y,Nakamura M,Tokunaga T,et al.Multidrug resistance-associated protein and mutant P53 protein expression in non-small cell lung cancer.Mod Pathol,1998,11:1059～1063
7，Endo K,Machara Y,Ichiyoshi Y,et al.Multidrug resistance-associated protein expression in clinical gastric carcinoma.Cancer,1996,77(Suppl 8):1681～1687
收稿 2000-04-27, 百拇医药