低温保存大鼠同种异体主动脉移植后的排斥反应与治疗
作者：杨光 蔡振杰 汪曾炜 李莹
单位：杨光(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；蔡振杰(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；汪曾炜(沈阳军区总医院心血管外科)；李莹(第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西西安 710033)
关键词：主动脉；同种异体；环孢菌素A；脾脏切除
第四军医大学学报000531 摘 要: 目的 研究经低温保存的同种异体主动脉移植后的排斥反应，观察环孢素A与脾脏切除联合免疫抑制治疗对排斥反应的影响. 方法 经低温保存60 d的SD大鼠同种异体主动脉以端对端的方式异位植入SD大鼠的腹主动脉. 免疫抑制治疗组在移植术后摘除脾脏，从术后1 d开始给予环孢素A 15 mg.kg-1.d-1, ip. 分别于术后3，7，14，21和28 d分批处死受体大鼠，取出移植物，常规石蜡包埋，制成切片，进行免疫组织学染色以观察免疫球蛋白IgM和IgG的沉积情况. 结果 单纯手术组的移植物手术7 d后有明显的IgM沉积(
),手术21 d后有明显的IgG沉积(). 假移植手术对照组染色均为阴性(-). 免疫抑制治疗组术后第7日IgM沉积为可疑阳性(±)，术后14，21和28 d IgM沉积均为弱阳性(+). 免疫抑制治疗组术后21和28 d IgG沉积为弱阳性(+). 结论 低温保存的同种异体主动脉移植后有明显的免疫球蛋白IgM和IgG沉积，由此证明排斥反应的存在. 环孢素A与脾脏切除联合免疫抑制治疗对同种异体主动脉移植的排斥反应有明确的治疗作用.
, 百拇医药
中图号：R541.1 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)05-0617-04
Immunological rejection of cryopreserved aortic homograft implantation
YANG Guang, CAI Zhen-Jie,(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital)
WANG Zeng-Wei
(Department of Cardiovascular Surgery, Genral Hospital of Shenyang Command)
Li Ying
, 百拇医药
(Department of Pathophysiology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To investigate the immunological rejection of cryopreserved aortic homograft implantation and its immunological suppression treatment. METHODS The aortic homograft conduit which had been cryopreserved for 60 days were end to end heterotopically implanted into the abdominal aorta of SD rats. The rats in the immunosuppression group were splenectomized and given cyclosprine A 15 mg.kg-1.d-1 after implantation. The rats were sacrificed at the 3rd, 7th, 14th, 21st, and 28th days after implantation respectively,and the implanted homografts retrieved. The retrieved homografts were routinely paraffin embeded and 5 μm sections were made. The sections were immunohistochemically stained for IgM and IgG deposition with mouse-anti-rat IgM and IgG monoclone antibody. RESULTS The simple implantation group showed obvious IgM deposition at the 7th day after implantation, and IgG deposition at the 21st day after implantation. The immunosuppression group showed remarkable decrease in IgM and IgG deposition compared with the simple implantation group. CONCLUSION The cryopreserved aortic homograft retains antigenicity, and the implanted homograft manifests obvious immunological rejection. The immunosuppression treatment by cyclosporine A with splenectomy may have marked therapeutic effect.
, 百拇医药
Keywords: aortic; homograft; cyclosporine A; splenectomy
0 引言
自1966年Ross应用同种异体主动脉进行右室流出道重建以来，同种异体主动脉在临床上的应用越来越广泛. 目前同种异体主动脉的取材，灭菌处理以及低温保存的方法趋于成熟[1,2]. 但是，移植物远期的钙化与退变仍不可避免，其原因在很大程度上与免疫排斥反应有关[3,4]. 我们从移植后排斥反应方面进行研究，为临床免疫治疗提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性SD大鼠30只，供体体质量180～230 g，受体体质量250～300 g，均由本校实验动物中心提供. 随机分为3组，每组5只，A组：单纯移植组；B组：免疫抑制治疗组，动物移植手术后摘除脾脏，给予环孢素A(CsA)治疗(15 mg.kg-1.d-1)； C组：假移植手术对照组. ①灭菌液的组成：RPMI 1640培养基(Gibco公司)，100 mL.L-1小牛血清(华美生物工程公司)，先锋霉素240 g.L-1，林可霉素120 mg.L-1，多粘菌素B 100 mg.L-1，万古霉素50 mg.L-1，两性霉素B 25 mg.L-1. ②冻存液Ⅰ的组成：RPMI 1640培养基，100 mL.L-1小牛血清，25 g.L-1二甲基亚砜；冻存液Ⅱ的组成：RPMI 1640培养基，100 mL.L-1小牛血清，50 g.L-1二甲基亚砜；冻存液Ⅲ的组成：RPMI 1640培养基，100 mL.L-1小牛血清，100 g.L-1二甲基亚砜. SD大鼠用250 g.L-1乌拉坦(800 mg.kg-1) ip麻醉后，无菌操作正中开胸，将主动脉瓣连同升主动脉剪下，立即置于含肝素的4℃生理盐水中清洗，清洗后将其移入4℃灭菌液中保存24 h，灭菌后将其依次置于4℃冻存液Ⅰ和Ⅱ中平衡15 min，然后置于冻存液Ⅲ中冻存，4℃～-40℃降温速度约1℃.min-1，达到-40℃后投入液氮中(-196℃). 复苏时在37℃水浴中迅速融解，将二甲基亚砜置换出.
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1.2 方法 采用同种异体主动脉管道异位植入腹主动脉的方法[4,5]. SD大鼠用250 mg.L-1乌拉坦(800 mg.kg-1) ip麻醉，无菌条件下纵切腹部显露腹主动脉，14倍手术显微镜下分离腹主动脉，在移植点的近端和远端用血管夹阻断血流，切断腹主动脉，以端对端的吻合方式将主动脉管道植入受体的腹主动脉. 吻合完毕后免疫抑制治疗组的大鼠摘除脾脏并给予CsA 15 mg.kg-1.d-1治疗. 假移植手术对照组的大鼠将腹主动脉切断后直接吻合. 术后继续饲养，待取材. 每组动物分别于移植后3，7，14，21和28 d取材，每次每组处死大鼠5只，取出移植物，40 mL.L-1多聚甲醛固定6～24 h，常规脱水石蜡包埋，制成5 μm的切片，待免疫组织化学染色.
1.2.1 免疫组织化学实验 小鼠抗大鼠IgM mAb (Sigma公司),小鼠抗大鼠IgG mAb (Sigma公司),羊抗小鼠IgG ABC试剂盒(Vector公司);阴性对照染色抗体为鼠抗人血型抗原A mAb(华美生物工程公司);阳性对照采用同种异体主动脉移植4 wk后的标本. ABC法染色：小鼠抗大鼠IgM和IgG mAb(第1抗体)稀释至1∶1000，生物素化羊抗小鼠IgG抗体(第2抗体)稀释至1∶200，Avidin标记的ABC复合体稀释至1∶200. 第1抗体在37℃反应60 min,再加入生物素化第2抗体37℃下反应30 min,然后加入avidin标记的HRP复合体反应60 min,标本最后加DAB-H2O2液显色,复染,室温下自然干燥,脱水,透明,封片后光学显微镜下观察.
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1.2.2 染色结果的判定 根据染色(阳性为棕褐色)的程度和范围积分(0～5)[6]: 0分，阴性; 1分,极弱阳性; 2分,弱阳性; 3分,中度阳性; 4分,强阳性; 5分,极强阳性.
统计学处理：检测结果用
±s表示，采用t检验进行统计学分析，P<0.05为具有显著性差异.
2 结果
阳性对照标本IgM和IgG染色均为强阳性(
); 阴性抗体对照染色均为阴性(-);A组(单纯移植组)移植1 wk后有明显的IgM沉积(
～),B组(假移植手术对照组)基本为阴性(-)，C组(免疫抑制治疗组)移植后7 d IgM沉积为可疑阳性(±),移植后14, 21, 28 d IgM沉积为弱阳性(+)，染色积分见Tab 1. 标本IgG沉积结果如下：A组移植后21 d沉积为阳性()，移植后28 d沉积为强阳性(),B组移植后IgG沉积基本为阴性，C组移植后21 d显示弱阳性(+),染色积分见Tab 2. 同种异体主动脉移植后同时伴有下列病理改变：①内皮细胞脱落；②血管壁增厚；③血管壁炎性细胞浸润.
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表1 移植物IgM沉积染色积分
Tab 1 Score of IgM deposition in homografts (±s) Group
3 d
7 d
14 d
21 d
28 d
Abd
1
2.8±0.2
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4.8±0.2
4.5±0.3
4.2±0.2
Bd
0.8±0.2
1.5±0.3
1.8±0.2
1.2±0.2
1.2±0.2
C
0.5±0.3
0.2±0.2
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0.2±0.2
0.2±0.3
0.2±0.2
bP<0.01 vs B; dP<0.01 vs C.表2 移植物IgG沉积染色积分
Tab 2 Score of IgG deposition in homografts (±s) Group
3 d
7 d
14 d
21 d
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28 d
A
0.5±0.3
0
0.2±0.2
2.8±0.5bd
4.2±0.2bd
B
0.2±0.2
0.2±0.2
0.5±0.3
1.8±0.2a
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1.5±0.3a
C
0
0.2±0.2
0.5±0.3
0.2±0.2
0.5±0.3
bP<0.01 vs B; dP<0.01, aP<0.05 vs C.3 讨论
器官移植的免疫排斥反应是困扰器官移植的主要问题,许多学者对移植免疫排斥反应在理论和实践上进行了深入研究,但对同种异体主动脉移植排斥反应的研究和治疗的重视远远不如其他器官移植(如心脏移植,肾脏移植 肝脏移植等). 经低温(-196℃)保存的同种异体主动脉管道仍保持着细胞活性和抗原性，特别是内皮细胞和平滑肌细胞[7]. 低温保存的同种异体主动脉带瓣管道在移植后会激发受体的免疫系统而引起免疫排斥反应. 以往的同种异体管道移植后免疫排斥反应的研究大多采用移植物皮下包埋的方法[8]. 我们采用纤维外科技术将同种异体主动脉管道异位植入大鼠的腹主动脉的方法[5]进行排斥反应的研究，其优点如下：①成功率较高；②参入了血液动力学因素；③参入了血氧，PH值及血液各种成分的因素. Clark等[4]在临床病理研究中提出移植后存在排斥反应，并认为移植管道的退化与排斥反应有关. Mulligan等[5]在实验研究中发现主动脉移植后表达白细胞粘附分子，这也证实存在移植物排斥反应. 本实验中同种异体主动脉移植后同时伴有下列病理改变：①内皮细胞脱落；②血管壁增厚；③血管壁炎性细胞浸润. 利用免疫组织化学方法发现移植物上有IgM和IgG沉积和发生沉积，使我们对同种异体管道移植后的排斥反应得以进一步的了解. 临床实践中免疫抑制治疗在同种异体主动脉的应用并不广泛，这可能与对排斥反应的认识不足有关近年来单克隆抗体在移植免疫排斥反应治疗中的应用得到了飞速发展,抗CD3，CD4，CD8，CD2，CD28分子的mAb都(通过不同的作用机制)有明显的免疫抑制作用. 抗细胞因子(IL-2，TNF)和受体(IL-2R)的mAb以及抗白细胞粘附分子的mAb在移植免疫排斥反应的治疗中也表现了明显的效果. 尽管如此,以环孢菌素A(CsA)为代表的新一代免疫抑制剂在器官移植的免疫排斥反应治疗中仍占有主导地位. CsA的免疫抑制作用在于广泛地抑制淋巴因子的合成(IL-2,IFN-γ). 动物实验中,同种异体主动脉移植后CsA可显著抑制MHCⅡ类抗原分子的表达, 减少移植物上的T细胞,NK细胞和Mφ细胞的沉积,抑制IL-2合成和IL-2R的表达[6].
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在临床上常将CsA与硫唑嘌呤和甲基强的松龙联合应用,有明显的免疫抑制治疗效果[6, 9]. 这种传统的免疫抑制治疗方法主要针对细胞介导的免疫排斥反应,尽管在某种程度上也可抑制体液介导的免疫排斥反应(如通过抑制IL-6和IL-1的产生, 抑制MHC抗原的表达等对体液免疫反应有间接抑制作用),对体液免疫反应仍缺乏有力的抑制作用. 实验中我们发现同种异体主动脉移植后移植物上有明确的免疫球蛋白IgM和IgG的沉积,这表明体液免疫参与了同种异体主动脉移植的免疫排斥反应,这些免疫球蛋白可以通过补体依赖性细胞毒(CDC)和抗体依赖性细胞介导细胞毒(ADCC)作用对移植物造成损害. 因此在同种异体主动脉移植的免疫排斥反应治疗中有必要对体液免疫反应施加直接的正面的抑制作用. 脾脏切除对免疫反应,特别是体液免疫反应有较强的抑制作用. 在大鼠的异种心脏移植实验中发现单纯的CsA或脾脏切除的治疗效果远远不如两者联合使用的治疗效果[10], CsA+脾脏切除可显著降低血液中细胞毒性抗体的滴度,维持移植物的正常组织结构,减少移植物上的细胞毒性抗体IgM的沉积. Peterson等[11]发现CsA+脾脏切除在大鼠异种心脏移植中明显抑制IL-6的产生和MHCⅡ类抗原分子的表达. 我们从上述的方法中得到启示,并在同种异体主动脉移植的实验中采用了CsA+脾脏切除的治疗方法. 结果表明,CsA+脾脏切除可明显减少移植物上的IgM和IgG的沉积,CsA+脾脏切除对同种异体主动脉移植的免疫排斥反应有明显的治疗作用,从移植物钙化的角度可见CsA+脾脏切除治疗可减轻同种异体主动脉移植物的钙化. ①免疫球蛋白IgM和IgG沉积明显减少；②炎性细胞浸润明显减少；③血管壁增厚程度减轻. 这种治疗方法强调对细胞免疫和体液免疫的同时治疗作用. 当然在同种异体主动脉或肺动脉移植的排斥反应治疗中并非要进行脾脏切除,只能说这种治疗手段对我们探求有效的抗免疫排斥反应的方法提供了很好的线索. 本结果提示：经低温保存的同种异体主动脉管道在移植后有排斥反应存在. CsA与脾脏切除联合免疫抑制治疗对同种异体主动脉移植后的排斥反应有明确的治疗作用，这对临床工作有重要的指导意义.
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作者简介：杨 光(1964-)，男(汉族)，辽宁省盘锦市人. 博士, 主治医师， 讲师. Tel.(029)3373475 Email. Lying@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] O'Brien MF, McGrffin DC. Allograft aortic valve replacement: Long-term comparative clinical analysis of the viable cryopreserved and antibiotic 4℃ stored valves [J]. J Cardiac Surg, 1991; 6(Suppl):534-543.
[2] McNally R, Barwick R, Smith-Morse B. Actuarial analysis of a uniform and reliable preservation method for viable heart valve allograft [J]. Ann Thorac Surg, 1989; 48(3): 583-584.
, 百拇医药
[3] Lupinetti FM, Cobb S, Kioschos HC. Effect of immunological difference on rat aortic valve allograft calcification [J]. J Cardiac Surg, 1992; 7(1): 65-70.
[4] Clark DR, Campbell DN, Hayward AR. Degeneration of aortic valve allograft in young recipients. J Thorac Cardiovase Surg,1993; 105(5):934-942.
[5] Mulligan MS, Tsai TT, Kneebone JM. Effect of preservation techniques on in vivo expression of adhesion molecules by aortic valve allografts [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1994; 107(3): 717-723.
, http://www.100md.com
[6] Lemstrom KB, Bruning JH. Triple drug immunosuppression sig-nificantly reduces immne activation and allograft arteriosclerosis in cytomegalovirus-infected rat aortic allografts and induces early latency of viral infection [J]. Am J Pathol， 1994;144(6):1334-1347.
[7] Khattb HEL, Lupinetti FM. Antigenicity of fresh and cryopreserved rat valve allograft [J]. Transplantation,1990; 49(4): 765-767 .
[8] Schoen FJ, Levy RJ, Nwlson AC. Onset and progression of experimental bioprosthetic heart valve calcification [J]. Lab Invest,1985; 52(5): 523-529.
, http://www.100md.com
[9] Petri K, Koskinen, Karl B. How cyclosporine modifies histological and molecular events in the vascular wall during chronic rejection of rat cardiac allograft [J]. Am J Pathol， 1995;146(4):972-980.
[10] Morito Monden, Valdivia LA. A crucial effect of splenectomy on prolonging cardiac xenograft survival in combination with cyclosporine [J]. Surgery， 1989;105(4):535-542.
[11] Peterson SM, Stralka CT. Combination of cyclosporine and splenectomy suppresses interleukin-6 production and major histocompatibility complex classII expression and prolongs cardiac xenograft survival [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1994;107(4):1001-1005.
收稿日期：2000-01-18； 修回日期：2000-02-08, 百拇医药
单位：杨光(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；蔡振杰(第四军医大学西京医院心血管外科中心)；汪曾炜(沈阳军区总医院心血管外科)；李莹(第四军医大学基础部病理生理学教研室，陕西西安 710033)
关键词：主动脉；同种异体；环孢菌素A；脾脏切除
第四军医大学学报000531 摘 要: 目的 研究经低温保存的同种异体主动脉移植后的排斥反应，观察环孢素A与脾脏切除联合免疫抑制治疗对排斥反应的影响. 方法 经低温保存60 d的SD大鼠同种异体主动脉以端对端的方式异位植入SD大鼠的腹主动脉. 免疫抑制治疗组在移植术后摘除脾脏，从术后1 d开始给予环孢素A 15 mg.kg-1.d-1, ip. 分别于术后3，7，14，21和28 d分批处死受体大鼠，取出移植物，常规石蜡包埋，制成切片，进行免疫组织学染色以观察免疫球蛋白IgM和IgG的沉积情况. 结果 单纯手术组的移植物手术7 d后有明显的IgM沉积(
),手术21 d后有明显的IgG沉积(). 假移植手术对照组染色均为阴性(-). 免疫抑制治疗组术后第7日IgM沉积为可疑阳性(±)，术后14，21和28 d IgM沉积均为弱阳性(+). 免疫抑制治疗组术后21和28 d IgG沉积为弱阳性(+). 结论 低温保存的同种异体主动脉移植后有明显的免疫球蛋白IgM和IgG沉积，由此证明排斥反应的存在. 环孢素A与脾脏切除联合免疫抑制治疗对同种异体主动脉移植的排斥反应有明确的治疗作用., 百拇医药
中图号：R541.1 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)05-0617-04
Immunological rejection of cryopreserved aortic homograft implantation
YANG Guang, CAI Zhen-Jie,(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital)
WANG Zeng-Wei
(Department of Cardiovascular Surgery, Genral Hospital of Shenyang Command)
Li Ying
, 百拇医药
(Department of Pathophysiology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To investigate the immunological rejection of cryopreserved aortic homograft implantation and its immunological suppression treatment. METHODS The aortic homograft conduit which had been cryopreserved for 60 days were end to end heterotopically implanted into the abdominal aorta of SD rats. The rats in the immunosuppression group were splenectomized and given cyclosprine A 15 mg.kg-1.d-1 after implantation. The rats were sacrificed at the 3rd, 7th, 14th, 21st, and 28th days after implantation respectively,and the implanted homografts retrieved. The retrieved homografts were routinely paraffin embeded and 5 μm sections were made. The sections were immunohistochemically stained for IgM and IgG deposition with mouse-anti-rat IgM and IgG monoclone antibody. RESULTS The simple implantation group showed obvious IgM deposition at the 7th day after implantation, and IgG deposition at the 21st day after implantation. The immunosuppression group showed remarkable decrease in IgM and IgG deposition compared with the simple implantation group. CONCLUSION The cryopreserved aortic homograft retains antigenicity, and the implanted homograft manifests obvious immunological rejection. The immunosuppression treatment by cyclosporine A with splenectomy may have marked therapeutic effect.
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Keywords: aortic; homograft; cyclosporine A; splenectomy
0 引言
自1966年Ross应用同种异体主动脉进行右室流出道重建以来，同种异体主动脉在临床上的应用越来越广泛. 目前同种异体主动脉的取材，灭菌处理以及低温保存的方法趋于成熟[1,2]. 但是，移植物远期的钙化与退变仍不可避免，其原因在很大程度上与免疫排斥反应有关[3,4]. 我们从移植后排斥反应方面进行研究，为临床免疫治疗提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性SD大鼠30只，供体体质量180～230 g，受体体质量250～300 g，均由本校实验动物中心提供. 随机分为3组，每组5只，A组：单纯移植组；B组：免疫抑制治疗组，动物移植手术后摘除脾脏，给予环孢素A(CsA)治疗(15 mg.kg-1.d-1)； C组：假移植手术对照组. ①灭菌液的组成：RPMI 1640培养基(Gibco公司)，100 mL.L-1小牛血清(华美生物工程公司)，先锋霉素240 g.L-1，林可霉素120 mg.L-1，多粘菌素B 100 mg.L-1，万古霉素50 mg.L-1，两性霉素B 25 mg.L-1. ②冻存液Ⅰ的组成：RPMI 1640培养基，100 mL.L-1小牛血清，25 g.L-1二甲基亚砜；冻存液Ⅱ的组成：RPMI 1640培养基，100 mL.L-1小牛血清，50 g.L-1二甲基亚砜；冻存液Ⅲ的组成：RPMI 1640培养基，100 mL.L-1小牛血清，100 g.L-1二甲基亚砜. SD大鼠用250 g.L-1乌拉坦(800 mg.kg-1) ip麻醉后，无菌操作正中开胸，将主动脉瓣连同升主动脉剪下，立即置于含肝素的4℃生理盐水中清洗，清洗后将其移入4℃灭菌液中保存24 h，灭菌后将其依次置于4℃冻存液Ⅰ和Ⅱ中平衡15 min，然后置于冻存液Ⅲ中冻存，4℃～-40℃降温速度约1℃.min-1，达到-40℃后投入液氮中(-196℃). 复苏时在37℃水浴中迅速融解，将二甲基亚砜置换出.
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1.2 方法 采用同种异体主动脉管道异位植入腹主动脉的方法[4,5]. SD大鼠用250 mg.L-1乌拉坦(800 mg.kg-1) ip麻醉，无菌条件下纵切腹部显露腹主动脉，14倍手术显微镜下分离腹主动脉，在移植点的近端和远端用血管夹阻断血流，切断腹主动脉，以端对端的吻合方式将主动脉管道植入受体的腹主动脉. 吻合完毕后免疫抑制治疗组的大鼠摘除脾脏并给予CsA 15 mg.kg-1.d-1治疗. 假移植手术对照组的大鼠将腹主动脉切断后直接吻合. 术后继续饲养，待取材. 每组动物分别于移植后3，7，14，21和28 d取材，每次每组处死大鼠5只，取出移植物，40 mL.L-1多聚甲醛固定6～24 h，常规脱水石蜡包埋，制成5 μm的切片，待免疫组织化学染色.
1.2.1 免疫组织化学实验 小鼠抗大鼠IgM mAb (Sigma公司),小鼠抗大鼠IgG mAb (Sigma公司),羊抗小鼠IgG ABC试剂盒(Vector公司);阴性对照染色抗体为鼠抗人血型抗原A mAb(华美生物工程公司);阳性对照采用同种异体主动脉移植4 wk后的标本. ABC法染色：小鼠抗大鼠IgM和IgG mAb(第1抗体)稀释至1∶1000，生物素化羊抗小鼠IgG抗体(第2抗体)稀释至1∶200，Avidin标记的ABC复合体稀释至1∶200. 第1抗体在37℃反应60 min,再加入生物素化第2抗体37℃下反应30 min,然后加入avidin标记的HRP复合体反应60 min,标本最后加DAB-H2O2液显色,复染,室温下自然干燥,脱水,透明,封片后光学显微镜下观察.
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1.2.2 染色结果的判定 根据染色(阳性为棕褐色)的程度和范围积分(0～5)[6]: 0分，阴性; 1分,极弱阳性; 2分,弱阳性; 3分,中度阳性; 4分,强阳性; 5分,极强阳性.
统计学处理：检测结果用
±s表示，采用t检验进行统计学分析，P<0.05为具有显著性差异.2 结果
阳性对照标本IgM和IgG染色均为强阳性(
); 阴性抗体对照染色均为阴性(-);A组(单纯移植组)移植1 wk后有明显的IgM沉积(～),B组(假移植手术对照组)基本为阴性(-)，C组(免疫抑制治疗组)移植后7 d IgM沉积为可疑阳性(±),移植后14, 21, 28 d IgM沉积为弱阳性(+)，染色积分见Tab 1. 标本IgG沉积结果如下：A组移植后21 d沉积为阳性()，移植后28 d沉积为强阳性(),B组移植后IgG沉积基本为阴性，C组移植后21 d显示弱阳性(+),染色积分见Tab 2. 同种异体主动脉移植后同时伴有下列病理改变：①内皮细胞脱落；②血管壁增厚；③血管壁炎性细胞浸润., http://www.100md.com
表1 移植物IgM沉积染色积分
Tab 1 Score of IgM deposition in homografts (
±s) Group3 d
7 d
14 d
21 d
28 d
Abd
1
2.8±0.2
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4.8±0.2
4.5±0.3
4.2±0.2
Bd
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1.2±0.2
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C
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0.2±0.2
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bP<0.01 vs B; dP<0.01 vs C.表2 移植物IgG沉积染色积分
Tab 2 Score of IgG deposition in homografts (
±s) Group3 d
7 d
14 d
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28 d
A
0.5±0.3
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2.8±0.5bd
4.2±0.2bd
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1.8±0.2a
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0.5±0.3
bP<0.01 vs B; dP<0.01, aP<0.05 vs C.3 讨论
器官移植的免疫排斥反应是困扰器官移植的主要问题,许多学者对移植免疫排斥反应在理论和实践上进行了深入研究,但对同种异体主动脉移植排斥反应的研究和治疗的重视远远不如其他器官移植(如心脏移植,肾脏移植 肝脏移植等). 经低温(-196℃)保存的同种异体主动脉管道仍保持着细胞活性和抗原性，特别是内皮细胞和平滑肌细胞[7]. 低温保存的同种异体主动脉带瓣管道在移植后会激发受体的免疫系统而引起免疫排斥反应. 以往的同种异体管道移植后免疫排斥反应的研究大多采用移植物皮下包埋的方法[8]. 我们采用纤维外科技术将同种异体主动脉管道异位植入大鼠的腹主动脉的方法[5]进行排斥反应的研究，其优点如下：①成功率较高；②参入了血液动力学因素；③参入了血氧，PH值及血液各种成分的因素. Clark等[4]在临床病理研究中提出移植后存在排斥反应，并认为移植管道的退化与排斥反应有关. Mulligan等[5]在实验研究中发现主动脉移植后表达白细胞粘附分子，这也证实存在移植物排斥反应. 本实验中同种异体主动脉移植后同时伴有下列病理改变：①内皮细胞脱落；②血管壁增厚；③血管壁炎性细胞浸润. 利用免疫组织化学方法发现移植物上有IgM和IgG沉积和发生沉积，使我们对同种异体管道移植后的排斥反应得以进一步的了解. 临床实践中免疫抑制治疗在同种异体主动脉的应用并不广泛，这可能与对排斥反应的认识不足有关近年来单克隆抗体在移植免疫排斥反应治疗中的应用得到了飞速发展,抗CD3，CD4，CD8，CD2，CD28分子的mAb都(通过不同的作用机制)有明显的免疫抑制作用. 抗细胞因子(IL-2，TNF)和受体(IL-2R)的mAb以及抗白细胞粘附分子的mAb在移植免疫排斥反应的治疗中也表现了明显的效果. 尽管如此,以环孢菌素A(CsA)为代表的新一代免疫抑制剂在器官移植的免疫排斥反应治疗中仍占有主导地位. CsA的免疫抑制作用在于广泛地抑制淋巴因子的合成(IL-2,IFN-γ). 动物实验中,同种异体主动脉移植后CsA可显著抑制MHCⅡ类抗原分子的表达, 减少移植物上的T细胞,NK细胞和Mφ细胞的沉积,抑制IL-2合成和IL-2R的表达[6].
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在临床上常将CsA与硫唑嘌呤和甲基强的松龙联合应用,有明显的免疫抑制治疗效果[6, 9]. 这种传统的免疫抑制治疗方法主要针对细胞介导的免疫排斥反应,尽管在某种程度上也可抑制体液介导的免疫排斥反应(如通过抑制IL-6和IL-1的产生, 抑制MHC抗原的表达等对体液免疫反应有间接抑制作用),对体液免疫反应仍缺乏有力的抑制作用. 实验中我们发现同种异体主动脉移植后移植物上有明确的免疫球蛋白IgM和IgG的沉积,这表明体液免疫参与了同种异体主动脉移植的免疫排斥反应,这些免疫球蛋白可以通过补体依赖性细胞毒(CDC)和抗体依赖性细胞介导细胞毒(ADCC)作用对移植物造成损害. 因此在同种异体主动脉移植的免疫排斥反应治疗中有必要对体液免疫反应施加直接的正面的抑制作用. 脾脏切除对免疫反应,特别是体液免疫反应有较强的抑制作用. 在大鼠的异种心脏移植实验中发现单纯的CsA或脾脏切除的治疗效果远远不如两者联合使用的治疗效果[10], CsA+脾脏切除可显著降低血液中细胞毒性抗体的滴度,维持移植物的正常组织结构,减少移植物上的细胞毒性抗体IgM的沉积. Peterson等[11]发现CsA+脾脏切除在大鼠异种心脏移植中明显抑制IL-6的产生和MHCⅡ类抗原分子的表达. 我们从上述的方法中得到启示,并在同种异体主动脉移植的实验中采用了CsA+脾脏切除的治疗方法. 结果表明,CsA+脾脏切除可明显减少移植物上的IgM和IgG的沉积,CsA+脾脏切除对同种异体主动脉移植的免疫排斥反应有明显的治疗作用,从移植物钙化的角度可见CsA+脾脏切除治疗可减轻同种异体主动脉移植物的钙化. ①免疫球蛋白IgM和IgG沉积明显减少；②炎性细胞浸润明显减少；③血管壁增厚程度减轻. 这种治疗方法强调对细胞免疫和体液免疫的同时治疗作用. 当然在同种异体主动脉或肺动脉移植的排斥反应治疗中并非要进行脾脏切除,只能说这种治疗手段对我们探求有效的抗免疫排斥反应的方法提供了很好的线索. 本结果提示：经低温保存的同种异体主动脉管道在移植后有排斥反应存在. CsA与脾脏切除联合免疫抑制治疗对同种异体主动脉移植后的排斥反应有明确的治疗作用，这对临床工作有重要的指导意义.
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作者简介：杨 光(1964-)，男(汉族)，辽宁省盘锦市人. 博士, 主治医师， 讲师. Tel.(029)3373475 Email. Lying@fmmu.edu.cn
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收稿日期：2000-01-18； 修回日期：2000-02-08, 百拇医药