儿童型脊肌萎缩症基因诊断的研究
作者：唐北沙 谭斯品 杨期明 严新翔
单位：410008湖南医科大学湘雅医院神经内科
关键词：儿童型脊肌萎缩症；运动神经元生存基因；PCR-酶切
临床神经病学杂志000207 【摘要】 目的 探讨儿童型脊肌萎缩症(CSMA)的基因诊断方法。方法 应用PCR-酶切分析法对7例CSMA患儿进行运动神经元生存(SMN)基因的基因诊断分析。结果 7例CSMA患儿SMN基因7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切后,6例仅剩下165 bp与125 bp片段，表现有SMN基因7号、8号外显子缺失；1例仅剩下165 bp片段，表现有SMN基因7号外显子缺失。结论 PCR-酶切检测SMN基因7号、8号外显子缺失可作为儿童型脊肌萎缩症的可靠的基因诊断方法。
A study on gene diagnosis in childhood-onset spinal muscular atrophy
, 百拇医药
Tang Beisha,Tan Sipin,Yang Qiming
Department of Neurology, Xiang Ya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Objective To investigate the gene diagnosis of childhood-onset spinal muscular atrophy(CSMA). Methods PCR-enzyme digestion was used to perform the survival motor neuron (SMN) genetic diagnosis of 7 patients with CSMA.Results PCR produ-cts of the SMN gene exon 7 and exon 8 in 7 patients with CSMA were digested by DraI，DdeI enzyme,in which 6 patients left only 165 bp and 125 bp,they all showed the deletion of SMN gene exon 7 and exon 8;another patient left only 165 bp that showed the deletion of SMN gene exon 7.Conclusion The deletion of SMN gene exon 7 and exon 8 examined by PCR-enzyme digestion could be recommended as an accurate gene diagnostic method for CSMA.
, 百拇医药
【Key words】 Childhood-onset spinal muscular atrophy SMN gene PCR-enzyme digestion
儿童型脊肌萎缩症(CSMA)是一种较常见的累及神经系统的常染色体隐性遗传性疾病，其发病率为1/6000～1/10000。根据发病年龄和病程分为3个亚型[1]，均定位在5q13.3区域，具有基因同源性[2,3]。该病有两个疾病相关基因被克隆，一个是运动神经元生存基因(SMN)[4]，另一个是神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)[5]。经突变分析证实，93%的CSMA病人为SMN基因7号、8号外显子联合缺失[4,6]，而NAIP可能与疾病的严重程度有关[7]。我们应用PCR-酶切技术对7例CSMA患儿进行了SMN基因诊断分析。
1 对象与方法
, 百拇医药
1.1 对象 7例CSMA患儿由湖南医科大学附属湘雅医院神经内科门诊提供。男4例，女3例，起病年龄6～35个月，平均28个月。按照Munsat[1] SMA诊断标准，Ⅰ型1例,Ⅱ型2例，Ⅲ型4例。临床表现为学龄前肌张力明显降低和自主运动的丧失。肌肉活检示肌纤维明显萎缩，肌电图示脊髓前角细胞受损。其父母表型正常。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 取外周血10 ml(肝素抗凝)，采用酚-氯仿法提取。
1.2.2 PCR引物及反应条件 外显子7与8 PCR扩增的引物序列依照相应文献合成[8]。SMN基因与其同源拷贝BCD 541cen基因7号外显子存在碱基C-T(CDNA第840位碱基)差异，8号外显子存在碱基G-A(CDNA第1155位碱基)差异，可分别在BCD 541cen PCR产物中形成DraI、DdeI的酶切位点。酶切后PCR产物与初级PCR产物同时电泳，经染色显色后判定结果。
, 百拇医药
1.2.3 PCR反应体系 40 μl：dNTPs(2 mM) 4 μl,10×PCR buffer 4 μl, Mg2+(25 mM) 2.4 μl ,上下游引物(100 ng/μl)各1 μl，模板(150 ng/μl)1 μl，Taq酶(4 U/μl)0.4 μl，外显子7加入PCR水26.2 μl。外显子8加入PCR水25.2 μl。
外显子7 PCR反应条件(Perking-Elmer480型PCR仪)95℃预变性3分钟，95℃变性40秒，59℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共32个循环。外显子8 PCR反应条件(Perking-Elmer 480型PCR仪)95℃预变性10分钟，72℃3分钟，72℃时加入稀释成1.5 U/μl的Taq酶1 μl,95℃变性40秒,55℃退火40秒,72℃延伸1分钟,共30个循环。Taq酶及相应的配套buffer,dNTPs均购自Sangon公司。
电泳 PCR产物用6%聚丙烯酰胺胶电泳，电压80 V，时间1小时，0.5溴化乙啶(EB)染色后，紫外灯下观察结果、照相。
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2 结 果
PCR产物经聚丙烯酰胺检测，7号外显子PCR产物长191 bp,8号外显子PCR产物长188 bp。7号外显子PCR产物经DraI酶切，正常个体酶切后可出现191 bp与165 bp两个条带，8号外显子PCR产物经DdeI酶切后出现188 bp与125 bp两个条带。患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切仅剩下165 bp条带，8号外显子PCR产物经DdeI酶切后剩下125 bp条带。6例CSMA患儿7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切仅剩下165 bp与125 bp条带，故CSMA患儿有SMN基因7号、8号外显子缺失。1例CSMA患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切后仅剩下165 bp条带，显示患儿有SMN基因7号外显子缺失，而未见8号外显子缺失。
3 讨 论
CSMA是一种较常见的常染色体隐性遗传性疾病，国外报道该遗传病的婴儿发病率为1/6000至1/10000不等，携带有该基因的频率为1/80。建立该种遗传病的基因诊断方法，对于防止带有该种遗传病的患儿出生、提高人口素质有着极其重要的意义。1995年初Lefebvre等[4]及Roy等[5]两个实验室分别克隆分离出2个SMA疾病相关基因，各命名为SMN和NAIP，均位于5q13.3。据国内外文献报道[4、6]，93%的CSMA患儿基因诊断结果表现为SMN基因7号、8号外显子联合缺失，5.7%表现为SMN基因7号外显子缺失，另外1.3%虽未发现该基因7号、8号外显子缺失，但在第6、7号内含子的编码区存在点突变等现象。中国台北研究发现SMN基因7号、8号外显子联合缺失达100%[9]。本研究中的7例CSMA患儿经PCR-酶切，基因诊断结果与上述文献报道的结果基本相符，说明CSMA患儿的SMN基因缺失频率较高,SMN基因7号、8号外显子联合缺失是CSMA患儿基因缺失的最常见类型。因此，SMN基因缺失的PCR-酶切检测可作为CSMA患儿的可靠的基因诊断手段,对CSMA家系的遗传咨询及产前诊断具有重要意义。
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参 考 文 献
1.Munsat TL,Davies KE. International SMA consortium meeting. Neuromuscular Disord, 1992,2:423
2.Brzustowicz LM, Lehner T, Castilla LH, et al. Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular to 5q11.2～13.3. Nature, 1990,344:540
3.Gilliam TC, Brzustowicz LM, Castilla LH, et al. Genetic homogeneity between acute and chronic forms of spinal muscular atrophy. Nature, 1990,345:823
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4.Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995,80:155
5.Roy N, Mahadevan MS, Mclean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is a partially deleted in individual with spinal muscular atrophy. Cell, 1995, 80:167
6.Rodrignes NR, Owen N, Talbot K, et al. Gene deletions in spinal muscular atrophy. J Med Genet, 1996, 33:93
, 百拇医药
7.Burle P,Burglen L,Clermont O,et al.Large scale deletions of the 5q13 region are specific to Werding-Hoffmann disease.J Med Genet,1996,33:281
8.Gerit Van der Steege.PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy. Lancet, 1996,345:985
9.Chang JG, Jong YJ, Huang JM, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinese. Am J Hum Genet,1995, 57:1503
(收稿1999-11-03 修回2000-01-27), 百拇医药
单位：410008湖南医科大学湘雅医院神经内科
关键词：儿童型脊肌萎缩症；运动神经元生存基因；PCR-酶切
临床神经病学杂志000207 【摘要】 目的 探讨儿童型脊肌萎缩症(CSMA)的基因诊断方法。方法 应用PCR-酶切分析法对7例CSMA患儿进行运动神经元生存(SMN)基因的基因诊断分析。结果 7例CSMA患儿SMN基因7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切后,6例仅剩下165 bp与125 bp片段，表现有SMN基因7号、8号外显子缺失；1例仅剩下165 bp片段，表现有SMN基因7号外显子缺失。结论 PCR-酶切检测SMN基因7号、8号外显子缺失可作为儿童型脊肌萎缩症的可靠的基因诊断方法。
A study on gene diagnosis in childhood-onset spinal muscular atrophy
, 百拇医药
Tang Beisha,Tan Sipin,Yang Qiming
Department of Neurology, Xiang Ya Hospital of Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Objective To investigate the gene diagnosis of childhood-onset spinal muscular atrophy(CSMA). Methods PCR-enzyme digestion was used to perform the survival motor neuron (SMN) genetic diagnosis of 7 patients with CSMA.Results PCR produ-cts of the SMN gene exon 7 and exon 8 in 7 patients with CSMA were digested by DraI，DdeI enzyme,in which 6 patients left only 165 bp and 125 bp,they all showed the deletion of SMN gene exon 7 and exon 8;another patient left only 165 bp that showed the deletion of SMN gene exon 7.Conclusion The deletion of SMN gene exon 7 and exon 8 examined by PCR-enzyme digestion could be recommended as an accurate gene diagnostic method for CSMA.
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【Key words】 Childhood-onset spinal muscular atrophy SMN gene PCR-enzyme digestion
儿童型脊肌萎缩症(CSMA)是一种较常见的累及神经系统的常染色体隐性遗传性疾病，其发病率为1/6000～1/10000。根据发病年龄和病程分为3个亚型[1]，均定位在5q13.3区域，具有基因同源性[2,3]。该病有两个疾病相关基因被克隆，一个是运动神经元生存基因(SMN)[4]，另一个是神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)[5]。经突变分析证实，93%的CSMA病人为SMN基因7号、8号外显子联合缺失[4,6]，而NAIP可能与疾病的严重程度有关[7]。我们应用PCR-酶切技术对7例CSMA患儿进行了SMN基因诊断分析。
1 对象与方法
, 百拇医药
1.1 对象 7例CSMA患儿由湖南医科大学附属湘雅医院神经内科门诊提供。男4例，女3例，起病年龄6～35个月，平均28个月。按照Munsat[1] SMA诊断标准，Ⅰ型1例,Ⅱ型2例，Ⅲ型4例。临床表现为学龄前肌张力明显降低和自主运动的丧失。肌肉活检示肌纤维明显萎缩，肌电图示脊髓前角细胞受损。其父母表型正常。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 取外周血10 ml(肝素抗凝)，采用酚-氯仿法提取。
1.2.2 PCR引物及反应条件 外显子7与8 PCR扩增的引物序列依照相应文献合成[8]。SMN基因与其同源拷贝BCD 541cen基因7号外显子存在碱基C-T(CDNA第840位碱基)差异，8号外显子存在碱基G-A(CDNA第1155位碱基)差异，可分别在BCD 541cen PCR产物中形成DraI、DdeI的酶切位点。酶切后PCR产物与初级PCR产物同时电泳，经染色显色后判定结果。
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1.2.3 PCR反应体系 40 μl：dNTPs(2 mM) 4 μl,10×PCR buffer 4 μl, Mg2+(25 mM) 2.4 μl ,上下游引物(100 ng/μl)各1 μl，模板(150 ng/μl)1 μl，Taq酶(4 U/μl)0.4 μl，外显子7加入PCR水26.2 μl。外显子8加入PCR水25.2 μl。
外显子7 PCR反应条件(Perking-Elmer480型PCR仪)95℃预变性3分钟，95℃变性40秒，59℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共32个循环。外显子8 PCR反应条件(Perking-Elmer 480型PCR仪)95℃预变性10分钟，72℃3分钟，72℃时加入稀释成1.5 U/μl的Taq酶1 μl,95℃变性40秒,55℃退火40秒,72℃延伸1分钟,共30个循环。Taq酶及相应的配套buffer,dNTPs均购自Sangon公司。
电泳 PCR产物用6%聚丙烯酰胺胶电泳，电压80 V，时间1小时，0.5溴化乙啶(EB)染色后，紫外灯下观察结果、照相。
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2 结 果
PCR产物经聚丙烯酰胺检测，7号外显子PCR产物长191 bp,8号外显子PCR产物长188 bp。7号外显子PCR产物经DraI酶切，正常个体酶切后可出现191 bp与165 bp两个条带，8号外显子PCR产物经DdeI酶切后出现188 bp与125 bp两个条带。患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切仅剩下165 bp条带，8号外显子PCR产物经DdeI酶切后剩下125 bp条带。6例CSMA患儿7号、8号外显子PCR产物经DraI、DdeI酶切仅剩下165 bp与125 bp条带，故CSMA患儿有SMN基因7号、8号外显子缺失。1例CSMA患儿7号外显子PCR产物经DraI酶切后仅剩下165 bp条带，显示患儿有SMN基因7号外显子缺失，而未见8号外显子缺失。
3 讨 论
CSMA是一种较常见的常染色体隐性遗传性疾病，国外报道该遗传病的婴儿发病率为1/6000至1/10000不等，携带有该基因的频率为1/80。建立该种遗传病的基因诊断方法，对于防止带有该种遗传病的患儿出生、提高人口素质有着极其重要的意义。1995年初Lefebvre等[4]及Roy等[5]两个实验室分别克隆分离出2个SMA疾病相关基因，各命名为SMN和NAIP，均位于5q13.3。据国内外文献报道[4、6]，93%的CSMA患儿基因诊断结果表现为SMN基因7号、8号外显子联合缺失，5.7%表现为SMN基因7号外显子缺失，另外1.3%虽未发现该基因7号、8号外显子缺失，但在第6、7号内含子的编码区存在点突变等现象。中国台北研究发现SMN基因7号、8号外显子联合缺失达100%[9]。本研究中的7例CSMA患儿经PCR-酶切，基因诊断结果与上述文献报道的结果基本相符，说明CSMA患儿的SMN基因缺失频率较高,SMN基因7号、8号外显子联合缺失是CSMA患儿基因缺失的最常见类型。因此，SMN基因缺失的PCR-酶切检测可作为CSMA患儿的可靠的基因诊断手段,对CSMA家系的遗传咨询及产前诊断具有重要意义。
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参 考 文 献
1.Munsat TL,Davies KE. International SMA consortium meeting. Neuromuscular Disord, 1992,2:423
2.Brzustowicz LM, Lehner T, Castilla LH, et al. Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular to 5q11.2～13.3. Nature, 1990,344:540
3.Gilliam TC, Brzustowicz LM, Castilla LH, et al. Genetic homogeneity between acute and chronic forms of spinal muscular atrophy. Nature, 1990,345:823
, http://www.100md.com
4.Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995,80:155
5.Roy N, Mahadevan MS, Mclean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is a partially deleted in individual with spinal muscular atrophy. Cell, 1995, 80:167
6.Rodrignes NR, Owen N, Talbot K, et al. Gene deletions in spinal muscular atrophy. J Med Genet, 1996, 33:93
, 百拇医药
7.Burle P,Burglen L,Clermont O,et al.Large scale deletions of the 5q13 region are specific to Werding-Hoffmann disease.J Med Genet,1996,33:281
8.Gerit Van der Steege.PCR-based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy. Lancet, 1996,345:985
9.Chang JG, Jong YJ, Huang JM, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinese. Am J Hum Genet,1995, 57:1503
(收稿1999-11-03 修回2000-01-27), 百拇医药