快速周期伏安法在定量研究脑内核团多巴胺释放中的应用
作者：谢俊霞 周宇 姜宏
单位：谢俊霞 姜宏(青岛大学医学院生理教研室，青岛 266021)；周宇(中科院上海生理研 究所，上海 200031)
关键词：快速周期伏安法；电刺激；多巴胺；内侧前脑束；尾壳核
中国应用生理学杂志000422
摘要 目的和方法：采用快速周期伏安法(FCV)在体研究电刺激内侧前脑束(MFB)或腹侧 背盖区(VTA)诱发的纹状体(CPu)、伏核(Acb)或中央杏仁核(CAN)多巴胺(DA)释放的特点，探 索电刺激诱发不同核团DA释放的适宜刺激参数。结果：CPu、Acb与 CAN的 DA释 放量及释放动力学特征均有不同。结论：在应用 FCV技术研究脑内不同部位DA释 放时，应重视适宜刺激参数的选择及运用，以获取更好的实验结果。
, http://www.100md.com 中图分类号: R338.8文献标识码:B
文章编号:1000-6834(2000) 04-0365-03
MONITORING DOPAMINE RELEASE BY FAST CYCLIC
VOLTAMMETRY:AN IN VIVO STUDY
XIE Jun-Xia
(Department of Physiology. Medical College of Qingdao Universit y, Qingdao.266021)
ZHOU Yu
(Shanghai Institute of Physiology,Chinese Academy of Sc iences,Shanghai 200031)
, 百拇医药
JIANG Hong
(Department of Physiology. Medical College of Qingdao Universit y, Qingdao.266021)
ABSTRACT Aim and Methods: Using fast cyclic voltammetry (FCV) and carbon fibre mi croelectrode (CFMe), we monitored dopamine(DA) release from caudate putamen(CPu) ,nucleus accumbens(Acb) and central amygdaloid nucleus(CAN) of normal rats in v ivo, in order to find out the suitable parameters to evoke DA release of certa in area. DA release was evoked by electrical stimulation of medial forebrain bundl e(MFB) or ventral tegmental area(VTA). Results: DA release from CPu, Acb or CAN were different in contents and the characteristics of dynamics. Conclusion: Different parameters should be used according to the differe nt sites of stimulation in order to get the maximal DA release during the experi ment.
, 百拇医药
KEY WORDS: fast cyclic voltammetry; electrical stimul ation; dopamine; medial forebrain bundle; caudate putamen
伏安法(voltammetry)是一种在高效液相色谱法基础上发展起来的定量电化学检测技术( electrochemical detection，ECD)，快速周期伏安法(fast cyclic voltammetry，FCV)是 伏安检测技术中最常用的一种。本文旨在应用国内首家引进的FCV检测技术，研究电刺激诱 发的尾壳核(CPu)、伏核(Acb)及中央杏仁核(CAN)多巴胺(dopamine，DA)释放的特点，为应 用该方法研究不同脑区DA的释放提供可靠的刺激参数。
1 材料与方法
1.1 动物制备
, 百拇医药
选用体重为270～300 g的SD大鼠，雌雄不拘。水合氯醛腹腔注射麻醉。参照鼠脑立体定 位图谱[1]，在相当于CPu(Acb或CAN)和MFB(VTA)的同一侧颅骨表面上钻孔，分别置 放碳纤维工作电极和刺激电极。在两钻孔之间的合适位置钻第三个孔，放置Ag/AgCl参考电 极。
1.2 仪器
英国剑桥电子设计公司产Millar FCV分析仪，CED 1401 plus配件及相应软件，日本光 电公司产 SEN-7203电子刺激器，SS-2014 J刺激隔离器，VC-11双道记忆示波器，四川仪 表四厂产X-Y记录仪，西北光学仪器厂产WDF-V型大鼠专用立体定位仪，686微机，自制的 碳纤维微电极，同心圆刺激电极，Ag/AgCl参考电极。
1.3 实验方法
实验分3组，分别监测电刺激MFB诱发的CPu区和Acb区DA的释放及电刺激VTA诱发的CAN区 DA的释放。
, http://www.100md.com
1.3.1 电刺激 按照坐标：AP：-4.3 mm；ML:1.5 mm；V：-6.5 mm(AP ：-5.8 mm；ML:0.5 mm；V:-6.5 mm)，将标准双极同心圆刺激电极置于MFB(VTA)区域上 部。实验开始后，每隔5 min将刺激电极下移0.5 mm，并给予一定强度的脉冲方波电刺激， 直到在相应脑区记录出 DA释放。通常情况下当刺激电极尖端在脑表面下7.5～8.0mm时， 即可记录到 DA的释放。刺激电极与恒流隔离器相连，脉冲的时间选择和参数序列由脉冲发 生器控制。
1.3.2 碳纤维工作电极与FCV测定 脑内DA的释放通过嵌入在特制毛细玻 璃管内的单根碳纤维(直径7 μm)进行测定。按照座标：AP:+1.1 mm；ML:2.8 mm；V：-5 .5～6.0 mm将碳纤维微电极置于CPu区：参照AP:+1.5～2.5 mm；ML:1.0～2.0 mm；V ：5.5～6.5 mm座标将碳纤维微电极置于Acb区；以AP：-2.5 mm;ML:3.6 mm；V：-7.8 mm为座标将碳纤维微电极置于CAN区。
, http://www.100md.com
图1为用FCV监测各脑区DA释放的实验仪器及设备连接示意图。图2为FCV各波形的产生过 程。电刺激 MFB或VTA诱发释放的DA产生的氧化还原波形通过CED 1401 plus的特定计算机接 口输入微机，通过特定的CED Average软件可对波形进行即时的观察、贮存及联机或脱机分 析。DA的氧化电位设定为+600 mV，在整个实验过程中保持恒定。DA的释放波形可同时由“ 采样-接收”回路输出至X-Y记录仪上进行动态跟踪及连续描记。当电刺激MFB(VTA)诱发CPu 或Acb(CAN)区 DA的释放量达最大时，即固定该刺激电极位置并观察刺激强度、刺激脉冲及 刺激频率的输入/输出量效关系曲线，以确定出较理想的刺激参数。
Fig.1 Schematic diagram of experimental dev ices
a.working electrode;b.reference electrode and c.stimulation electrode
, 百拇医药
Fig.2 Trace of applied voltage wavefo rm to the carbonfibre microelectrode (A)
and the current waveform flowing in the microelectrode
when submerged in phosphate buffer (B).
(C)Subtractogram showing the oxidation (o) and reduction (r)
peaks. of evoked dopamine; and (D) a trace o f sample and
holding response to trains of 40 pulse at 60 Hz within
, http://www.100md.com
the CPu or A cb (left two traces) and the CAN(right two traces)
1.3.3 电极标定及数据处理 每次实验结束后，均在标准DA溶液内(0. 01～5.00 μmol/L)进行碳纤维微电极的离体校准，常规评价电极的敏感性和伏安信号。本 文结果均用均数±标准误(
±
)表示，所用统计学方法为方差分析。
2 结果
不同脑区DA的释放量均随刺激参数的改变而改变。当固定DA最大释放量的刺激强度和脉 冲(2.0 mA,200 P,0.2 ms)不变时，电刺激MFB引起CPu区DA的释放量取决于刺激频率(n=7,F =9.78;P<0.01)。在10～500 Hz频率范围内，两端刺激频率引起的DA释放量最少， 分别为(0.08±0.03)和(1.04±0.44)μmol/L；当频率为125 Hz时，DA的释放达最 大，为(21.56±5.77)μmol/L，曲线呈“钟型”(图3)。电刺激MFB监测Acb区DA释放的频 率依赖曲线与CPu相似。
, 百拇医药
Fig.3 Effects of stimulation frequency on dopamine release in CPu
在固定刺激 VTA引起CAN区DA释放量达最大的刺激强度和脉冲(1.0 mA，200 P，0.35 m s)不变的前提下，给予10～500 Hz的电刺激，当刺激频率为60 Hz时，DA的释放量最大，为( 2.60±0.98)μmol/L(P<0.01，n=7)，两端的频率(10 Hz和500 Hz)引起的DA的 释放量最小，分别为(0.22±0.08)和(0.42±0.06)μmol/L。CAN的DA释放曲线亦呈“ 钟型”(图4)。
Fig.4 Effects of stimulation frequency on dopamine release in CAN
, http://www.100md.com 在我们的其他实验研究中,同样发现当固定刺激的强度和脉冲时，所得最大的 DA释放量 的频率与此结果相同，具有频率依赖性，而且在同一实验中，以此刺激频率为自身对照时， 给予影响 DA释放的药物或其它条件后，引起最大 DA释放的刺激频率有良好的可重复性 [2]。
3 讨论
虽然FCV不能在体检测内源性单胺类递质的基础水平，但可广泛用于检测刺激诱发的 CPu和 边缘前脑的单胺类递质(尤其是 DA)的释放。由于FCV具有极高的时间和空间分辨力，可被植 入其它伏安法或微透析法无法达到的核团或亚群，具有微透析和 HPLC技术无法达到的创伤 性小、适于在体连续动态观察及结果更精确可靠等优点，被广泛用于在体研究及离体脑片的 研究。FCV还可用于在体动态监测帕金森病动物模型脑内DA的释放[3]，这对于帕金 森病各项实验性治疗措施的疗效及预后的观察和评判具有重要的意义。
, 百拇医药 本研究在 CPu、Acb和CAN三个不同的脑区分别记录了由不同的刺激参数诱发的DA释放，以求 为今后的相关研究提供有参考价值的刺激参数。实验中观察到 CAN的 DA释放波形明显不同 于 CPu或Acb，表现为：DA释放和摄取波形的升支和降支的斜率均较低，曲线较为平稳。这 表明CAN区DA释放和摄取的速度均慢于CPu。Garris等[4]报道，刺激MFB诱发的基底 外侧杏仁核(BAN) DA的释放和摄取速度至少比CPu慢10倍。这种低比率的DA释放与摄取提示C AN区的DA可能与CPu区的不同，前者可能起一种类似于调质的作用，而后者是一种神经递质 。另一方面，本研究诱发CAN区DA释放的刺激部位是DA能细胞体集中存在的区域之一VTA区。 由VTA接受刺激产生冲动再兴奋支配CAN的传出纤维末梢，从而释放DA固然需要一定的时间， 但CAN的DA释放波形较平稳的原因不排除VTA中其它神经元(如r-氨基丁酸能和胆囊收缩素能 神经元)因同时接受刺激而产生的对 DA能神经元的影响作用。
由于MFB内 DA能神经纤维属于细小的无髓鞘纤维，而VTA区主要是DA能神经元，后者的 兴奋阈值比无髓鞘的神经纤维低，因此，较小的刺激就能使核团内的神经元兴奋，而兴奋纤 维束(尤其是无髓鞘的细小纤维束)则需要较强的刺激。综上所述，尽管刺激强度、脉冲和频 率均构成影响 DA释放的相关因素，但在不同刺激条件下(如刺激部位)所依赖的刺激参数不 同。这提示我们在不同刺激部位的实验研究中，应重视适宜刺激参数的运用，以获得更好的 实验结果。
, 百拇医药
基金项目:国家“九五”科技攻关计划(969060508)和卫生部优秀青年科技 人才专项科研基金资助课题(96Q-085)
作者简介：谢俊霞，(1956-)，女，河南人，教授，硕士,从事中枢神经系 统退行性疾病的基础和治疗研究。
4 参考文献
[1] Paxinos G,Watson C (eds).The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates [M].Academic Press.London,1986,1-104.
[2] Xie Junxia,Tang Ming,Zhang Chunyi. The role of cholecyctokinin-8 microinj ection into ventral tegmental area on dopamine release in nucleus accumbens of rats: In vivo voltammetric study[J].Society for neuroscience abstrats, 1998,24(1):109.
, 百拇医药
[3] Earl C D,Sautter J,Xie Junxia , et al.Pharmacological characterization of dopamine overflow in the striatum of the normal and MPTP-treated common mar moset ,studied in vivo using fast cyclic voltammetry,nomifensine and sulpiride[ J].Neuroscience Methods,1998,85:201-209.
[4] Garris P A,Wightman R M.In vivo voltammetric measurement of evoked extrac ellular dopamine in the rat basolateral amygdaloid nucleus[J]. J Physiology ,1994,478,239-249.
收稿日期:1999-09-02
修回日期:2000-04-03, 百拇医药
单位：谢俊霞 姜宏(青岛大学医学院生理教研室，青岛 266021)；周宇(中科院上海生理研 究所，上海 200031)
关键词：快速周期伏安法；电刺激；多巴胺；内侧前脑束；尾壳核
中国应用生理学杂志000422
摘要 目的和方法：采用快速周期伏安法(FCV)在体研究电刺激内侧前脑束(MFB)或腹侧 背盖区(VTA)诱发的纹状体(CPu)、伏核(Acb)或中央杏仁核(CAN)多巴胺(DA)释放的特点，探 索电刺激诱发不同核团DA释放的适宜刺激参数。结果：CPu、Acb与 CAN的 DA释 放量及释放动力学特征均有不同。结论：在应用 FCV技术研究脑内不同部位DA释 放时，应重视适宜刺激参数的选择及运用，以获取更好的实验结果。
, http://www.100md.com 中图分类号: R338.8文献标识码:B
文章编号:1000-6834(2000) 04-0365-03
MONITORING DOPAMINE RELEASE BY FAST CYCLIC
VOLTAMMETRY:AN IN VIVO STUDY
XIE Jun-Xia
(Department of Physiology. Medical College of Qingdao Universit y, Qingdao.266021)
ZHOU Yu
(Shanghai Institute of Physiology,Chinese Academy of Sc iences,Shanghai 200031)
, 百拇医药
JIANG Hong
(Department of Physiology. Medical College of Qingdao Universit y, Qingdao.266021)
ABSTRACT Aim and Methods: Using fast cyclic voltammetry (FCV) and carbon fibre mi croelectrode (CFMe), we monitored dopamine(DA) release from caudate putamen(CPu) ,nucleus accumbens(Acb) and central amygdaloid nucleus(CAN) of normal rats in v ivo, in order to find out the suitable parameters to evoke DA release of certa in area. DA release was evoked by electrical stimulation of medial forebrain bundl e(MFB) or ventral tegmental area(VTA). Results: DA release from CPu, Acb or CAN were different in contents and the characteristics of dynamics. Conclusion: Different parameters should be used according to the differe nt sites of stimulation in order to get the maximal DA release during the experi ment.
, 百拇医药
KEY WORDS: fast cyclic voltammetry; electrical stimul ation; dopamine; medial forebrain bundle; caudate putamen
伏安法(voltammetry)是一种在高效液相色谱法基础上发展起来的定量电化学检测技术( electrochemical detection，ECD)，快速周期伏安法(fast cyclic voltammetry，FCV)是 伏安检测技术中最常用的一种。本文旨在应用国内首家引进的FCV检测技术，研究电刺激诱 发的尾壳核(CPu)、伏核(Acb)及中央杏仁核(CAN)多巴胺(dopamine，DA)释放的特点，为应 用该方法研究不同脑区DA的释放提供可靠的刺激参数。
1 材料与方法
1.1 动物制备
, 百拇医药
选用体重为270～300 g的SD大鼠，雌雄不拘。水合氯醛腹腔注射麻醉。参照鼠脑立体定 位图谱[1]，在相当于CPu(Acb或CAN)和MFB(VTA)的同一侧颅骨表面上钻孔，分别置 放碳纤维工作电极和刺激电极。在两钻孔之间的合适位置钻第三个孔，放置Ag/AgCl参考电 极。
1.2 仪器
英国剑桥电子设计公司产Millar FCV分析仪，CED 1401 plus配件及相应软件，日本光 电公司产 SEN-7203电子刺激器，SS-2014 J刺激隔离器，VC-11双道记忆示波器，四川仪 表四厂产X-Y记录仪，西北光学仪器厂产WDF-V型大鼠专用立体定位仪，686微机，自制的 碳纤维微电极，同心圆刺激电极，Ag/AgCl参考电极。
1.3 实验方法
实验分3组，分别监测电刺激MFB诱发的CPu区和Acb区DA的释放及电刺激VTA诱发的CAN区 DA的释放。
, http://www.100md.com
1.3.1 电刺激 按照坐标：AP：-4.3 mm；ML:1.5 mm；V：-6.5 mm(AP ：-5.8 mm；ML:0.5 mm；V:-6.5 mm)，将标准双极同心圆刺激电极置于MFB(VTA)区域上 部。实验开始后，每隔5 min将刺激电极下移0.5 mm，并给予一定强度的脉冲方波电刺激， 直到在相应脑区记录出 DA释放。通常情况下当刺激电极尖端在脑表面下7.5～8.0mm时， 即可记录到 DA的释放。刺激电极与恒流隔离器相连，脉冲的时间选择和参数序列由脉冲发 生器控制。
1.3.2 碳纤维工作电极与FCV测定 脑内DA的释放通过嵌入在特制毛细玻 璃管内的单根碳纤维(直径7 μm)进行测定。按照座标：AP:+1.1 mm；ML:2.8 mm；V：-5 .5～6.0 mm将碳纤维微电极置于CPu区：参照AP:+1.5～2.5 mm；ML:1.0～2.0 mm；V ：5.5～6.5 mm座标将碳纤维微电极置于Acb区；以AP：-2.5 mm;ML:3.6 mm；V：-7.8 mm为座标将碳纤维微电极置于CAN区。
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图1为用FCV监测各脑区DA释放的实验仪器及设备连接示意图。图2为FCV各波形的产生过 程。电刺激 MFB或VTA诱发释放的DA产生的氧化还原波形通过CED 1401 plus的特定计算机接 口输入微机，通过特定的CED Average软件可对波形进行即时的观察、贮存及联机或脱机分 析。DA的氧化电位设定为+600 mV，在整个实验过程中保持恒定。DA的释放波形可同时由“ 采样-接收”回路输出至X-Y记录仪上进行动态跟踪及连续描记。当电刺激MFB(VTA)诱发CPu 或Acb(CAN)区 DA的释放量达最大时，即固定该刺激电极位置并观察刺激强度、刺激脉冲及 刺激频率的输入/输出量效关系曲线，以确定出较理想的刺激参数。
Fig.1 Schematic diagram of experimental dev ices
a.working electrode;b.reference electrode and c.stimulation electrode
, 百拇医药
Fig.2 Trace of applied voltage wavefo rm to the carbonfibre microelectrode (A)
and the current waveform flowing in the microelectrode
when submerged in phosphate buffer (B).
(C)Subtractogram showing the oxidation (o) and reduction (r)
peaks. of evoked dopamine; and (D) a trace o f sample and
holding response to trains of 40 pulse at 60 Hz within
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the CPu or A cb (left two traces) and the CAN(right two traces)
1.3.3 电极标定及数据处理 每次实验结束后，均在标准DA溶液内(0. 01～5.00 μmol/L)进行碳纤维微电极的离体校准，常规评价电极的敏感性和伏安信号。本 文结果均用均数±标准误(
±)表示，所用统计学方法为方差分析。2 结果
不同脑区DA的释放量均随刺激参数的改变而改变。当固定DA最大释放量的刺激强度和脉 冲(2.0 mA,200 P,0.2 ms)不变时，电刺激MFB引起CPu区DA的释放量取决于刺激频率(n=7,F =9.78;P<0.01)。在10～500 Hz频率范围内，两端刺激频率引起的DA释放量最少， 分别为(0.08±0.03)和(1.04±0.44)μmol/L；当频率为125 Hz时，DA的释放达最 大，为(21.56±5.77)μmol/L，曲线呈“钟型”(图3)。电刺激MFB监测Acb区DA释放的频 率依赖曲线与CPu相似。
, 百拇医药
Fig.3 Effects of stimulation frequency on dopamine release in CPu
在固定刺激 VTA引起CAN区DA释放量达最大的刺激强度和脉冲(1.0 mA，200 P，0.35 m s)不变的前提下，给予10～500 Hz的电刺激，当刺激频率为60 Hz时，DA的释放量最大，为( 2.60±0.98)μmol/L(P<0.01，n=7)，两端的频率(10 Hz和500 Hz)引起的DA的 释放量最小，分别为(0.22±0.08)和(0.42±0.06)μmol/L。CAN的DA释放曲线亦呈“ 钟型”(图4)。
Fig.4 Effects of stimulation frequency on dopamine release in CAN
, http://www.100md.com 在我们的其他实验研究中,同样发现当固定刺激的强度和脉冲时，所得最大的 DA释放量 的频率与此结果相同，具有频率依赖性，而且在同一实验中，以此刺激频率为自身对照时， 给予影响 DA释放的药物或其它条件后，引起最大 DA释放的刺激频率有良好的可重复性 [2]。
3 讨论
虽然FCV不能在体检测内源性单胺类递质的基础水平，但可广泛用于检测刺激诱发的 CPu和 边缘前脑的单胺类递质(尤其是 DA)的释放。由于FCV具有极高的时间和空间分辨力，可被植 入其它伏安法或微透析法无法达到的核团或亚群，具有微透析和 HPLC技术无法达到的创伤 性小、适于在体连续动态观察及结果更精确可靠等优点，被广泛用于在体研究及离体脑片的 研究。FCV还可用于在体动态监测帕金森病动物模型脑内DA的释放[3]，这对于帕金 森病各项实验性治疗措施的疗效及预后的观察和评判具有重要的意义。
, 百拇医药 本研究在 CPu、Acb和CAN三个不同的脑区分别记录了由不同的刺激参数诱发的DA释放，以求 为今后的相关研究提供有参考价值的刺激参数。实验中观察到 CAN的 DA释放波形明显不同 于 CPu或Acb，表现为：DA释放和摄取波形的升支和降支的斜率均较低，曲线较为平稳。这 表明CAN区DA释放和摄取的速度均慢于CPu。Garris等[4]报道，刺激MFB诱发的基底 外侧杏仁核(BAN) DA的释放和摄取速度至少比CPu慢10倍。这种低比率的DA释放与摄取提示C AN区的DA可能与CPu区的不同，前者可能起一种类似于调质的作用，而后者是一种神经递质 。另一方面，本研究诱发CAN区DA释放的刺激部位是DA能细胞体集中存在的区域之一VTA区。 由VTA接受刺激产生冲动再兴奋支配CAN的传出纤维末梢，从而释放DA固然需要一定的时间， 但CAN的DA释放波形较平稳的原因不排除VTA中其它神经元(如r-氨基丁酸能和胆囊收缩素能 神经元)因同时接受刺激而产生的对 DA能神经元的影响作用。
由于MFB内 DA能神经纤维属于细小的无髓鞘纤维，而VTA区主要是DA能神经元，后者的 兴奋阈值比无髓鞘的神经纤维低，因此，较小的刺激就能使核团内的神经元兴奋，而兴奋纤 维束(尤其是无髓鞘的细小纤维束)则需要较强的刺激。综上所述，尽管刺激强度、脉冲和频 率均构成影响 DA释放的相关因素，但在不同刺激条件下(如刺激部位)所依赖的刺激参数不 同。这提示我们在不同刺激部位的实验研究中，应重视适宜刺激参数的运用，以获得更好的 实验结果。
, 百拇医药
基金项目:国家“九五”科技攻关计划(969060508)和卫生部优秀青年科技 人才专项科研基金资助课题(96Q-085)
作者简介：谢俊霞，(1956-)，女，河南人，教授，硕士,从事中枢神经系 统退行性疾病的基础和治疗研究。
4 参考文献
[1] Paxinos G,Watson C (eds).The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates [M].Academic Press.London,1986,1-104.
[2] Xie Junxia,Tang Ming,Zhang Chunyi. The role of cholecyctokinin-8 microinj ection into ventral tegmental area on dopamine release in nucleus accumbens of rats: In vivo voltammetric study[J].Society for neuroscience abstrats, 1998,24(1):109.
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[3] Earl C D,Sautter J,Xie Junxia , et al.Pharmacological characterization of dopamine overflow in the striatum of the normal and MPTP-treated common mar moset ,studied in vivo using fast cyclic voltammetry,nomifensine and sulpiride[ J].Neuroscience Methods,1998,85:201-209.
[4] Garris P A,Wightman R M.In vivo voltammetric measurement of evoked extrac ellular dopamine in the rat basolateral amygdaloid nucleus[J]. J Physiology ,1994,478,239-249.
收稿日期:1999-09-02
修回日期:2000-04-03, 百拇医药