姜黄素与羟基脲对K562细胞的体外联合作用
作者：赵蓉 许建华 柯丹如 林溪 陈元仲
单位：赵蓉 许建华 柯丹如 林溪(福建医科大学临床药理研究所,福州 350004)；陈元仲(福建医科大学福建省血液病研究所,福州 350004)
关键词：姜黄素；羟基脲；药物协同作用；抗肿瘤活性；K562细胞株；白血病；幼红细胞；急性
福建医科大学学报000307
摘要: 目的 了解姜黄素与羟基脲合用对人白血病K562细胞的体外作用。 方法 采用MTT法测定药物的体外杀伤作用,应用AO/EB荧光染料染色观察药物诱导细胞凋亡,金氏公式进行联合用药分析。 结果 姜黄素5,10 μg/ml,羟基脲25,50 μg/ml同时给药,对K562细胞可产生单纯相加的协同杀伤效果。姜黄素与羟基脲同时给药诱导K562细胞凋亡率高于羟基脲单独用药,低于姜黄素单独用药。 结论 姜黄素与羟基脲同时联合用药可产生单纯相加的协同杀伤效用,姜黄素可部分逆转K562细胞对羟基脲诱导凋亡的抗药性。
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中图分类号: R282.71; R979.19; R329.24; R730.21 文献标识码: A
文章编号:1000-2235(2000)03-0228-03
Combinative Antitumor Effects of Curcumin and Hydroxyurea
on K562 Cell in Vitro
ZHAO Rong
(Department of Tumours)
XU Jian-Hua KE Dan-Ru
(Institute of Clinical Pharmacology,Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China)
, 百拇医药
ABSTRACT: Objective To investigate antitumor effects of curcumin(Cur) combining with hydroxyurea(HU) on K562 cell lines in vitro. Methods The antitumor effects of drugs on tumor cell lines in vitro were determined with MTT method. Apoptosis induced by drugs was observed with AO/EB fluorescent staining. The Jin's formula was used to analyse the effect of drug combination. Results In simultaneous adiministration Cur 5,10 μg/ml combining with HU 25,50 μg/ml produced a simple addition effect. The apoptotic rate of K562 cells in Cur combining with HU was higher than that in HU alone and lower than Cur alone. Conclusion Simultaneous adiministration of Cur and HU produced synergistic antitumor effect,but Cur only partly reversed resistance of HU inducing apoptosis in K562 cells.
, 百拇医药
KEY WORDS: curcumin; hydroxyurea; synergistic effect; antitumor activity; k562 cell line; leukemia,erythroblastic,acute
姜黄素(Curcumin,Cur)系从姜科植物姜黄中提取的酚性色素,因其抗突变、抗促癌作用而渐渐受到人们的重视。前文报道[1]Cur与5-氟脲嘧啶合用,对人慢性粒细胞白血病K562细胞不论在细胞杀伤还是诱导凋亡方面,均显协同作用。羟基脲在临床上用于治疗慢性粒细胞白血病,文献报道K562细胞对羟基脲诱导凋亡有显著的抗药性[2]。Cur可否逆转K562细胞对羟基脲诱导凋亡的抗药性,未见文献报道。本文探讨两药对K562细胞的体外联合作用,为姜黄素的深入研究及应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 Cur按文献[3]由本所从福建建阳地区所产姜黄(Curcuma Longa L.)中提取、分离,经硅胶薄层鉴定,与标准品的比移值相同。羟基脲(hydroxyurea,HU)Sigma产品,吖啶橙(AO)及溴乙锭(EB)为Fluka公司产品。RPMI 1640培养基为GIBCO产品。胎牛血清、小牛血清为上海轻工所产品。MTT为华美生物工程公司产品。酶标仪550为BIO-RAD产品。
, 百拇医药
1.2 细胞株及培养条件 人慢性粒细胞白血病K562细胞株为本室保种,用内含5%胎牛血清、8%小牛血清及100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基培养、传代,取对数生长期细胞用于实验。
1.3 不同浓度的Cur与HU对体外培养细胞杀伤作用的测定 在96孔培养板上,接种K562细胞,接种量(0.5～2)×104个/孔,同时加入等体积不同浓度组合的Cur、HU,37℃,5%CO2培养48 h,加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔,继续培养4 h后,加入裂解液(10%SDS、5%异丁醇,用HCl调至pH 4.5),37℃放置过夜,用酶标仪测各孔的A550值。
1.4 不同浓度的Cur与HU诱导细胞凋亡作用的测定 细胞加入不同浓度Cur、HU溶液培养48 h后,用AO/EB混合荧光染料染色,按文献[4]的方法,计数凋亡细胞的个数,在荧光显微镜下可见4种细胞。活细胞:核染色质被AO染成绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞:核染色质着绿色并呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞:膜受损,核染色质被EB染成桔红色并呈固缩状或圆珠状。分类计数100个细胞,计算凋亡率(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数/计数细胞总数×100%)。
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1.5 数据分析 按金正钧公式[q=Ea+b/Ea+Eb-Ea×Eb][5]评价两种药物合用是否有协同或拮抗作用。式中Ea+b为合用药物的有效率,Ea 、Eb分别为A药、B药单独用药的有效率。若q值在0.85～1.15范围内,为两药合用单纯相加,q值>1.15为增强,q值<0.85则表示两药合用有拮抗作用。
2 结 果
2.1 不同浓度Cur、HU对K562细胞体外杀伤作用(表1) 对K562细胞体外杀伤,Cur 5,10 μg/ml分别为20.6%,57.7%,HU 25,50 μg/ml分别为12.4%,16.3%,当两者合并用药时,其抑制率均高于Cur、HU单独用药,但其0.85
表1 Cur与HU对K562细胞杀伤的共同作用 Cur HU(μg/ml)
, http://www.100md.com
OD值
抑制率(%)
q
0
0
1.300±0.058
5
0
1.032±0.034
20.6±0.026
10
0
0.550±0.074
, 百拇医药
57.7±0.056
0
25
1.139±0.065
12.4±0.050
0
50
1.088±0.052
16.3±0.040
5
25
0.918±0.070
, http://www.100md.com 29.4±0.054
0.966
5
50
0.907±0.009
30.2±0.006
0.900
10
25
0.480±0.047
63.0±0.036
1.001
, http://www.100md.com 10
50
0.473±0.043
63.6±0.033
0.985
2.2 Cur、HU不同浓度诱导K562细胞凋亡(表2)
表2 Cur与HU诱导K562细胞凋亡 Cur HU(μg/ml)
凋亡率(%)
q值
0
0
0
, 百拇医药
5
0
27
10
0
70
0
25
4
0
50
3
5
25
, 百拇医药
8
0.268
5
50
7
0.241
10
25
23
0.323
10
50
57
, 百拇医药 0.804
Cur 5,10 μg/ml诱导K562细胞凋亡率分别为27%,70%,HU 25,50 μg/ml诱导K562细胞凋亡率仅为4%,3%,当两药合用时,其联合用药的凋亡率高于HU单独用药,而低于Cur单独用药,说明Cur对HU诱导K562细胞凋亡有一定的促进作用,可在一定程度上逆转K562细胞对HU诱导凋亡的抗药性,这种逆转的趋势随Cur浓度的升高而增强。反之HU对Cur诱导K562细胞凋亡呈现一定的拮抗作用。这种拮抗作用随Cur浓度的升高而下降。尽管q值随Cur浓度的升高而升高,但在本文的条件下q值仍<0.85,故Cur与HU同时合用,在诱导K562细胞凋亡效果方面还未达到相加的标准,仍属拮抗范畴。
3 讨 论
本文结果表明,Cur与HU对K562细胞的体外联合用药可产生相加的细胞毒效果,但在诱导K562细胞凋亡方面,Cur虽可部分逆转K562细胞对HU诱导凋亡的抗药性,且逆转趋势随Cur浓度的升高而增强。但在本文的条件下还未能达到相加的协同诱导凋亡效果。这一现象提示Cur除诱导细胞凋亡外,还可能通过其他机制与HU产生相加的联合作用,值得深入研究。
, 百拇医药
K562细胞由于含有bcr-abl融合基因,该基因编码分子量为210 kD的产物蛋白p210bcr-abl,具有很强的酪氨酸蛋白激酶活性[6],可抑制药物引起的细胞DNA损伤与诱导凋亡信号通路的偶联[7],所以K562细胞对包括HU在内的多数化疗药物诱导凋亡产生抗药性。已知Cur为受体酪氨酸蛋白激酶的抑制剂[8],本文结果表明,Cur可部分逆转HU对K562细胞诱导凋亡的抗药性,提示Cur可能对p210bcr-abl的酪氨酸蛋白激酶活性也有一定的抑制作用,有待进一步证实。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C992001)
作者简介:赵 蓉(1957～),女,实验师.
参考文献:
[1] 赵 蓉,柯丹如,许建华,等. 姜黄素与5-氟脲嘧啶对人白血病K562细胞体外抗癌的协同作用[J]. 中药药理与临床, 1993,15(5):15.
, http://www.100md.com
[2] Gui CY,Jiang C,Xie HY,et al. The apoptosis of HEL cells induced by hydroxyurea[J]. Cell Res, 1997,7(1):91.
[3] 许建华,赵 蓉,柯丹如,等. 姜黄素对人白血病K562细胞凋亡的影响[J]. 中药药理与临床, 1998,14(6):19.
[4] 陈丽娟,盛瑞兰,汪承亚,等. AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡[J]. 中华血液学杂志, 1998,19(1):41.
[5] 金正均. 合并用药的相加[J]. 中国药理学报, 1980,1(2):70.
[6] Richardson JM,Morla AO,Wang JY. Reduction in protein tyrosine phosphorylation during differentiation of human leukemia cell line K562[J]. Cancer Res, 1987,47(15):4066.
, http://www.100md.com
[7] Chapman RS,Whetton AD,Chresta CM,et al. Characterization of drug resistance mediated via the suppression of apoptosis by abelson protein tyrosin kinase[J]. Mol Pharmacol, 1995,48(2):334.
[8] Korutal,Cheung JY,Mendelsohn J,et al.Inhibition of ligand-induced activation of epidermal growth factor receptor tyrosine phosphorylation by curcumin[J]. Carcinogenesis, 1995,16:1741.
收稿日期:2000-04-24, 百拇医药
单位：赵蓉 许建华 柯丹如 林溪(福建医科大学临床药理研究所,福州 350004)；陈元仲(福建医科大学福建省血液病研究所,福州 350004)
关键词：姜黄素；羟基脲；药物协同作用；抗肿瘤活性；K562细胞株；白血病；幼红细胞；急性
福建医科大学学报000307
摘要: 目的 了解姜黄素与羟基脲合用对人白血病K562细胞的体外作用。 方法 采用MTT法测定药物的体外杀伤作用,应用AO/EB荧光染料染色观察药物诱导细胞凋亡,金氏公式进行联合用药分析。 结果 姜黄素5,10 μg/ml,羟基脲25,50 μg/ml同时给药,对K562细胞可产生单纯相加的协同杀伤效果。姜黄素与羟基脲同时给药诱导K562细胞凋亡率高于羟基脲单独用药,低于姜黄素单独用药。 结论 姜黄素与羟基脲同时联合用药可产生单纯相加的协同杀伤效用,姜黄素可部分逆转K562细胞对羟基脲诱导凋亡的抗药性。
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中图分类号: R282.71; R979.19; R329.24; R730.21 文献标识码: A
文章编号:1000-2235(2000)03-0228-03
Combinative Antitumor Effects of Curcumin and Hydroxyurea
on K562 Cell in Vitro
ZHAO Rong
(Department of Tumours)
XU Jian-Hua KE Dan-Ru
(Institute of Clinical Pharmacology,Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China)
, 百拇医药
ABSTRACT: Objective To investigate antitumor effects of curcumin(Cur) combining with hydroxyurea(HU) on K562 cell lines in vitro. Methods The antitumor effects of drugs on tumor cell lines in vitro were determined with MTT method. Apoptosis induced by drugs was observed with AO/EB fluorescent staining. The Jin's formula was used to analyse the effect of drug combination. Results In simultaneous adiministration Cur 5,10 μg/ml combining with HU 25,50 μg/ml produced a simple addition effect. The apoptotic rate of K562 cells in Cur combining with HU was higher than that in HU alone and lower than Cur alone. Conclusion Simultaneous adiministration of Cur and HU produced synergistic antitumor effect,but Cur only partly reversed resistance of HU inducing apoptosis in K562 cells.
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KEY WORDS: curcumin; hydroxyurea; synergistic effect; antitumor activity; k562 cell line; leukemia,erythroblastic,acute
姜黄素(Curcumin,Cur)系从姜科植物姜黄中提取的酚性色素,因其抗突变、抗促癌作用而渐渐受到人们的重视。前文报道[1]Cur与5-氟脲嘧啶合用,对人慢性粒细胞白血病K562细胞不论在细胞杀伤还是诱导凋亡方面,均显协同作用。羟基脲在临床上用于治疗慢性粒细胞白血病,文献报道K562细胞对羟基脲诱导凋亡有显著的抗药性[2]。Cur可否逆转K562细胞对羟基脲诱导凋亡的抗药性,未见文献报道。本文探讨两药对K562细胞的体外联合作用,为姜黄素的深入研究及应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 Cur按文献[3]由本所从福建建阳地区所产姜黄(Curcuma Longa L.)中提取、分离,经硅胶薄层鉴定,与标准品的比移值相同。羟基脲(hydroxyurea,HU)Sigma产品,吖啶橙(AO)及溴乙锭(EB)为Fluka公司产品。RPMI 1640培养基为GIBCO产品。胎牛血清、小牛血清为上海轻工所产品。MTT为华美生物工程公司产品。酶标仪550为BIO-RAD产品。
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1.2 细胞株及培养条件 人慢性粒细胞白血病K562细胞株为本室保种,用内含5%胎牛血清、8%小牛血清及100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基培养、传代,取对数生长期细胞用于实验。
1.3 不同浓度的Cur与HU对体外培养细胞杀伤作用的测定 在96孔培养板上,接种K562细胞,接种量(0.5～2)×104个/孔,同时加入等体积不同浓度组合的Cur、HU,37℃,5%CO2培养48 h,加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔,继续培养4 h后,加入裂解液(10%SDS、5%异丁醇,用HCl调至pH 4.5),37℃放置过夜,用酶标仪测各孔的A550值。
1.4 不同浓度的Cur与HU诱导细胞凋亡作用的测定 细胞加入不同浓度Cur、HU溶液培养48 h后,用AO/EB混合荧光染料染色,按文献[4]的方法,计数凋亡细胞的个数,在荧光显微镜下可见4种细胞。活细胞:核染色质被AO染成绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞:核染色质着绿色并呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞:膜受损,核染色质被EB染成桔红色并呈固缩状或圆珠状。分类计数100个细胞,计算凋亡率(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数/计数细胞总数×100%)。
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1.5 数据分析 按金正钧公式[q=Ea+b/Ea+Eb-Ea×Eb][5]评价两种药物合用是否有协同或拮抗作用。式中Ea+b为合用药物的有效率,Ea 、Eb分别为A药、B药单独用药的有效率。若q值在0.85～1.15范围内,为两药合用单纯相加,q值>1.15为增强,q值<0.85则表示两药合用有拮抗作用。
2 结 果
2.1 不同浓度Cur、HU对K562细胞体外杀伤作用(表1) 对K562细胞体外杀伤,Cur 5,10 μg/ml分别为20.6%,57.7%,HU 25,50 μg/ml分别为12.4%,16.3%,当两者合并用药时,其抑制率均高于Cur、HU单独用药,但其0.85
表1 Cur与HU对K562细胞杀伤的共同作用 Cur HU(μg/ml)
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OD值
抑制率(%)
q
0
0
1.300±0.058
5
0
1.032±0.034
20.6±0.026
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0.550±0.074
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57.7±0.056
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25
1.139±0.065
12.4±0.050
0
50
1.088±0.052
16.3±0.040
5
25
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0.966
5
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0.907±0.009
30.2±0.006
0.900
10
25
0.480±0.047
63.0±0.036
1.001
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0.473±0.043
63.6±0.033
0.985
2.2 Cur、HU不同浓度诱导K562细胞凋亡(表2)
表2 Cur与HU诱导K562细胞凋亡 Cur HU(μg/ml)
凋亡率(%)
q值
0
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0.268
5
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10
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Cur 5,10 μg/ml诱导K562细胞凋亡率分别为27%,70%,HU 25,50 μg/ml诱导K562细胞凋亡率仅为4%,3%,当两药合用时,其联合用药的凋亡率高于HU单独用药,而低于Cur单独用药,说明Cur对HU诱导K562细胞凋亡有一定的促进作用,可在一定程度上逆转K562细胞对HU诱导凋亡的抗药性,这种逆转的趋势随Cur浓度的升高而增强。反之HU对Cur诱导K562细胞凋亡呈现一定的拮抗作用。这种拮抗作用随Cur浓度的升高而下降。尽管q值随Cur浓度的升高而升高,但在本文的条件下q值仍<0.85,故Cur与HU同时合用,在诱导K562细胞凋亡效果方面还未达到相加的标准,仍属拮抗范畴。
3 讨 论
本文结果表明,Cur与HU对K562细胞的体外联合用药可产生相加的细胞毒效果,但在诱导K562细胞凋亡方面,Cur虽可部分逆转K562细胞对HU诱导凋亡的抗药性,且逆转趋势随Cur浓度的升高而增强。但在本文的条件下还未能达到相加的协同诱导凋亡效果。这一现象提示Cur除诱导细胞凋亡外,还可能通过其他机制与HU产生相加的联合作用,值得深入研究。
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K562细胞由于含有bcr-abl融合基因,该基因编码分子量为210 kD的产物蛋白p210bcr-abl,具有很强的酪氨酸蛋白激酶活性[6],可抑制药物引起的细胞DNA损伤与诱导凋亡信号通路的偶联[7],所以K562细胞对包括HU在内的多数化疗药物诱导凋亡产生抗药性。已知Cur为受体酪氨酸蛋白激酶的抑制剂[8],本文结果表明,Cur可部分逆转HU对K562细胞诱导凋亡的抗药性,提示Cur可能对p210bcr-abl的酪氨酸蛋白激酶活性也有一定的抑制作用,有待进一步证实。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C992001)
作者简介:赵 蓉(1957～),女,实验师.
参考文献:
[1] 赵 蓉,柯丹如,许建华,等. 姜黄素与5-氟脲嘧啶对人白血病K562细胞体外抗癌的协同作用[J]. 中药药理与临床, 1993,15(5):15.
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[2] Gui CY,Jiang C,Xie HY,et al. The apoptosis of HEL cells induced by hydroxyurea[J]. Cell Res, 1997,7(1):91.
[3] 许建华,赵 蓉,柯丹如,等. 姜黄素对人白血病K562细胞凋亡的影响[J]. 中药药理与临床, 1998,14(6):19.
[4] 陈丽娟,盛瑞兰,汪承亚,等. AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡[J]. 中华血液学杂志, 1998,19(1):41.
[5] 金正均. 合并用药的相加[J]. 中国药理学报, 1980,1(2):70.
[6] Richardson JM,Morla AO,Wang JY. Reduction in protein tyrosine phosphorylation during differentiation of human leukemia cell line K562[J]. Cancer Res, 1987,47(15):4066.
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[7] Chapman RS,Whetton AD,Chresta CM,et al. Characterization of drug resistance mediated via the suppression of apoptosis by abelson protein tyrosin kinase[J]. Mol Pharmacol, 1995,48(2):334.
[8] Korutal,Cheung JY,Mendelsohn J,et al.Inhibition of ligand-induced activation of epidermal growth factor receptor tyrosine phosphorylation by curcumin[J]. Carcinogenesis, 1995,16:1741.
收稿日期:2000-04-24, 百拇医药