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编号:10289784
脂质体介导的融合基因pCEAcd/tk转染肺癌细胞株效率的差异性
http://www.100md.com 《中国现代医学杂志》 2000年第5期
     作者:郭语彬 伍新尧 罗超权 林达 李芳 许道松

    单位:罗超权 林达 李芳 许道松 郭语彬(中山医科大学生化教研室 广州 510089);伍新尧(中山医科大学法学系)

    关键词:阳离子脂质体;肺癌;转染;自杀基因

    中国现代医学杂志000512 目的:对脂质体介导的体外肺癌细胞DAN转效率的差异性进行研究。方法:提取质粒pCEAcd/tk,脂质体包裹后转染6种肺癌细胞株,G418筛选,计数细胞阳性克隆数。结果:6种肺癌细胞株中,导入了pCEAcdt/tk并获得稳定表达的细胞阳性克隆数差异较大;脂质体ESCORT-DNA混合 物与细胞孵育时间不同对转染效率也有一定的影响。结论:脂质体介导的方法把融合自杀基因表达体系导入到肺癌细胞的效率存在细胞差异性。

    分类号 Q5
, 百拇医药
    VARIATION IN TRANSFECTION EFFICIENCY OF

    CATIONIC LIPID-MEDIATED pCEAcd/tk TO DIF

    FERENTAL LUNG CANCER CELL STRAINS

    Guo Yubin, Wu Xinyao, Luo Chaoquan, et al

    Department of Biochemistry, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou Guangdong 510089

    [Abstract] Objective: To investigate the variation in transfection efficiency of cationic lipid-mediated pCEAcd/tk among different lung cancer cell strains in vitro. Methods: pCEAcd/tk was extracted and transferred to differental lung cancer cell strains by cationic lipid-mediated method. It was selected by G418 and the number of positive clones was calculated under microscope. Results: There are different positive clones among 6 lung cancer cell strains. The transfection efficiency was influenced by different incubate time between ESCORT-DNA mixture and lung cancer cells. Conclusions: There was a considerable variation in transfection efficiency of cationic lipid-mediated gene transfer among different cell strains.
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    Key words: Cationic lipid; Lung cancer; Transfection; Suicide gene

    脂质体作为基因转移的载体,有操作简便、安全等优点,已广泛应用于基础研究。但人们对于脂质体介导DNA进入靶细胞的机理了解得很少,有许多因素均可能影响脂质体的转染效率,如DNA的纯度、脂质体本身的结构以及细胞本身的生理状态。本研究运用我们前期构建的由癌胚抗原(CEA)启动子驱动的融合自杀基因(E coli cd/HSV1-tk)表达体系[1],导入到不同来源的肺癌细胞株,观察到了这种表达体系转染效率的差异性,现报道如下:

    1 材料与方法

    1.1 细胞株、载体及主要试剂

    人肺腺癌细胞株GLC-82,SPCA-1,人肺鳞癌细胞株L-78,SC,人小细胞肺癌A549及人肺巨细胞癌HLAMP分别来自本校动物中心及上海细胞生物研究所;融合自杀基因的表达体系pCEAcd/tk,由本室许道松博士构建;质粒提取试剂购于Qiagen公司;脂质体(ESCORT),购于Sigma公司;G418,购于GIBCO公司。
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    1.2 质粒的提取与转染

    用Qiagen的试剂制备质粒pCEAcd/tk,紫外分光光度计测量其A260/A280比值在1.80~2.0,用内切酶消化,电泳鉴定为融合自杀基因pCEAcd/tk的表达体系再转染肺癌细胞株。培养6种肺癌细胞株,收集1×107个细胞,用荧光微粒子发光检测CEA含量。转染的前一天分别接种5×105个细胞在35mm的培养板上,待细胞的密度为50%时进行转染,转染方法按ESCORT说明书进行:先用RPMI 1640培养基(不加血清)、质粒DNA(1μg/μl)与脂质体混合,室温放置15min后,加入2ml的完全培养基,混合后加到去除了培养液的细胞中,继续培养,让DNA-脂质体的混合物与细胞孵育一定时间(约6~18h),吸去ESCORT-DNA的混合物再孵育24h后,根据细胞对G418的敏感性不同加入含不同浓度的G418(0.21~1.0mg/ml)的选择培养基,筛选约10~14d,直到出现阳性克隆。
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    1.3 细胞阳性克隆的计数与鉴定

    转染细胞经选择培养基(G418)筛选后,出现的阳性克隆可在倒置显微镜(Olympus公司产品)下计数;培养后收集细胞,分别制备染色DNA,PCR法鉴定整合入细胞核内的融合基因cd/tk。

    1.4 细胞生长曲线的绘制及细胞群体倍增时间的计算

    以上6种细胞株按每孔1×104个细胞接种在24孔培养板上,每天取其中4孔细胞计数,取均值,共6d。根据细胞随时间增长的规律绘出生长曲线,然后按公式g=(ln2t)/[(lnN)-(lnN0)]计算细胞群体倍增时间,式中t为细胞数目由N0增加到N时的时间间隔,g为群体倍增时间。

    2 结果

    2.1 融合表达体系pCEAcd/k转染6种肺癌细胞效率的差异性 在脂质体ESCORT用量(15μl),质粒pCEAcd/tk的用量(1μg/μl,5μl),接种细胞的密度为5×105/35mm及pCEAcd/tk-ESCORT与细胞的孵育时间均为6h等相同的条件下,质粒pCEAcd/tk转染到细胞内并获稳定表达的细胞阳性克隆数差异较大(见表1)。
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    表1 脂质体ESCORT介导的pCEAcd/tk转染效率的细胞株间差异性 细胞体

    CEA含量

    (ng/nl)

    细胞阳性克隆数

    (每5×105个细胞)

    细胞群体

    倍增时间(h)

    HLAMP

    0

    121

    18

    A549
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    1130.4

    118

    22

    GLC-82

    19.2

    34

    27

    SC

    17.2

    33

    26

    L-78

    0
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    13

    29

    SPCA-1

    48.8

    2

    35

    从表1可见,细胞阳性克隆数与群体倍增时间成负相关,说明脂质介导的pCEAcd/tk的转染效率与细胞本身的生理状态密切相关。细胞群体倍增时间可反映细胞本身的生理状态,倍增时间越短,说明这种细胞分裂越快,脂质体-DNA的复合物越易进入细胞;细胞阳性克隆数与细胞中CEA含量无关。pCEAcd/tk的表达体系是一种组织专一性的表达体系,它只在CEA阳性的肿瘤细胞中表达[1],从上表看来它也能转染到CEA阴性的肺癌细胞如HLAMP及L-78,由此可见,转染效率的高低与pCEAcd/tk表达体系中组织专一性的CEA启动子无关,因为在pCEAcd/tk体系中还含有SV40启动子,它可驱动下游的新霉素基因表达,使细胞在G418筛选时存活。
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    2.2 ESCORT-pCEAcd/tk混合物与细胞的不同孵育时间对转染效率的影响

    不同的细胞株对脂质体的敏感性不一样,本实验以A549,GLC-82及L-78细胞株为实验对象,分别将ESCORT-pCEAcd/tk与细胞孵育6,10,14和18h,其它条件不变,观察到了其转染效率也存在差异,见表2。 表2 ESCORT-pCEAcd/tk混合物与细胞的不同孵育时间对转染效率的影响 孵育时间

    (h)

    细胞阳性克隆数(每5×105个细胞)

    A549

    GLC-82

    HLAMP
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    6

    118

    34

    121

    10

    96

    134

    157

    14

    135

    146

    153

    18

, 百拇医药     127

    122

    176

    2.3 二甲基亚砜(DMSO)转染因子促进剂对转染效率的影响

    DMSO可促进脂质体介导的质粒进入细胞,不过其浓度不宜过高,DMSO休克细胞的时间也不宜过长,一般以30~60s为宜,要不然细胞会在休克时就死亡。本实验显示:10%DMSO使GLC-82细胞休克约40s,细胞阳性克隆数由34个增多到73个,其转染效率提高了110%。

    3 讨论

    目前,基因治疗恶性肿瘤主要采用病毒载体与非病毒载体二种,相对于病载体而言,阳离子脂质体越来越受重视,因为它有操作简单、安全等优点,故它被认为最具有应用前景的一种载体。它最主要的缺点是转染效率低,本实验结果表明,它在体外的转染效率还不到1%,如应用于体内,机体内条件更为复杂,有许多因素都会影响它的转染效率。DMSO等转染因子促进剂可以提高基因的转染效率,目前还主要运用于体外转染。所以如何提高脂质体的转染效率是当今基因治疗的一大难题。
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    阳离子脂质体已应用于体内实验,人们发现,阳离子脂质体包裹DNA后通过雾化吸入或静脉给药到体内,外源基因获在肺部得到了高表达,如Eastman[2]用阳离子脂质体和DNA组成的复合物通过雾化吸入到BALB/c小鼠体内,在肺部获得了相对较高水平的表达,但外源基因的表达很短暂,14d后下降到高峰期的10%。而Tsan[3]报道了肺泡表面活性物质可抑制脂质介导的体内基因转移,但对体外基因转移的效率却无明显影响。

    阳离子脂质体介导的基因转染的机制目前还不清楚,这些步骤包括脂质体与DNA复合物的形成,然后通过细胞内吞噬将脂质体/DNA复合物吞噬到细胞内,DNA再从复合物内释放出来,部分可以在胞质内表达,整合到细胞核内并表达。目前,国内外的研究从如何提高脂质体的转染效率出发,侧重于研究阳离子脂质体本身的结构变化等对转染效率的影响,如Song[4]报道了C14的脂质高于C18的脂质体的转染效率;Kichler[5]报道了溶解脂质体的缓冲溶液的成分对转染效率的影响,如阳离子脂质体溶解在NaHCO3/Na2HPO4,而DNA溶解在150mM的NaCl溶液中,其转染效率较高;Zabner[6]的实验认为脂质体与DNA的比例为5∶1(w/w)时,对转染较为合适。但很不少有报道细胞本身的状况对转染率的影响,本研究对此作了初步探索,细胞本身的的生理状态也是影响脂质体转染效率的一大因素,其机制不清楚,有待于进一步研究。
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    参 考 文 献

    1 许道松,伍新尧,钟女奇,等.CEA启动子驱动cd/tk表达体系对CEA阳性肿瘤的杀伤作用.癌症,1998;17(5):349~351

    2 SJ Eastman,MJ Lukason,JD Tousignant,et al.A concentrted and stable aerosol formulation of cationic lipid:DNA complexes giving high-level gene expression in mouse lung.Human Gene Therapy,1997;8:765~773

    3 MF Tsan,GL Tasn,JE White.Surfactant inhibits cationic liposomemediated gene transfer.Human Gene Therapy,1997;8:817~825
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    4 YK Song,F-Liu,S-Chu,et al.Characterization of cationic liposome-mediated gene transfer in vivo by intravenous administration.Human Gene Therapy,1997;8(13):1585~1594

    5 A Kichler,W Zanner,M Ogris,et al.Influence of the DNA complexation medium on the transfetion efficiency of lipopermine/DNA particles.Gene Therapy,1998;5:855~860

    6 J Zabner Al J.Fasbender,T Moninger,et al.Celluar and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid.The Journal of Biological Chemistry,1995;270(32):18997~19007, http://www.100md.com