大肠癌的自杀基因治疗
作者：钱伟峰 宋惠娟 黄宗海
单位：钱伟峰(广州第一军区大学珠江医院普外科 510282)；宋惠娟(广州第一军区大学珠江医院普外科 510282)；黄宗海(广州第一军区大学珠江医院普外科 510282)
关键词：
腹部外科000128
大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，常用的手术、化疗、放疗等传统的治疗方式均未能使其疗效得到明显的提高。随着分子生物学及基因工程的发展，基因治疗已成为研究重点，其中自杀基因治疗是一种较为有效的具有临床应用潜力的治疗策略。它是把某些能将非毒性药物代谢成细胞毒性 药物的非哺乳动物酶类合成的基因-自杀基因，经分子生物学途径导入肿瘤细胞，使之在肿瘤细胞内特异地表达，该基因产物能将无毒的药物前体代谢为毒性产物，从而影响肿瘤细胞的DNA合成，引起细胞的死亡。目前用于治疗大肠癌的自杀基因主要有HSV-tk基因和CD基因。本文就自杀基因治疗大肠癌进行综述。
, 百拇医药
一、 肿瘤的特异性靶向转导
大肠癌的自杀基因治疗包括：构建携带自杀基因的重组病毒载体； 目的基因的转导； 药物前体治疗肿瘤细胞。为了能使目的基因安全有效地整合到“靶细胞”中，目前构建病毒载体多包含有细胞专一性的基因表达调控元件，使自杀基因只能在靶细胞中表达，而对周边正常的组织细胞无传染，从而保证了特异性的靶向转导作用。蒋琼等[1]构建了以CEA基因启动控制的HSV-tk和EC-CD表达质粒pCEA-tk和pCEA-CD,然后分别与pSV2-neo共转染结肠癌细胞株LoVo和宫颈癌细胞株Hela，与野生型LoVo细胞相比，LoVo/CEA-tk和LoVo/CEA-CD对GCV和5-FC的敏感性分别提高2 000倍和700倍，而Hela/CEA-tk(或Hela/CEA-CD)仍对GCV(或5-FC)不敏感，结果显示了癌胚抗原(CEA)基因启动子驱动自杀基因表达治疗结肠癌的优越性。另外，目前采用in vivo法进行目的基因原位转导[2]，即在瘤体内直接注射病毒上清液或包装细胞直接接种入瘤体内。Hirschowitz等[3]在结肠癌动物模型的病灶中直接注射AdCMV/CD重组腺病毒上清液，经GCV处理后，发现病灶明显缩小，与对照组相比，在第6天和第15天肿瘤体积分别缩小46%和74%,这充分说明了瘤体内基因转导的有效性，in vivo法使自杀基因疗法更利于临床应用。
, 百拇医药
二、 旁观者效应
1993年，Freeman[4] 在转导了HSV-tk基因的结肠癌细胞系HCT-116中观察到GCV不仅对转导基因的肿瘤细胞有杀伤作用，对于未转导tk基因的肿瘤细胞也具有杀伤作用，这种现象称为“旁观者效应”(bystander effect,BE)。
(一) 缝隙连接与细胞接触：Bi等[5]认为前药的毒性代谢产物或自杀基因表达的酶通过细胞间缝隙连接传入邻近细胞，引起细胞毒作用。他们将tk-和tk+的HT1080细胞混合培养，并加3H标记的GCV，结果发现除了tk+的细胞可掺入3H标记的GCV外，与其相接触的tk-细胞也可掺入3H标记的GCV，而未接触的tk-细胞内则没有。Yang-L等[6]用大肠癌细胞体外进行实验，发现连接蛋白-43与连接蛋白-26在BE中起重要的作用。对于CD基因引起的BE，则不需细胞接触而发挥作用[4]，5-FU可不通过细胞接触而发挥细胞毒作用[7]。可以设想，自杀基因表达的产物通过缝隙连接或易化扩散传递到周围细胞后，降低了转基因细胞内基因表达的产物浓度，在应用药物前体后，对转基因细胞杀伤作用减弱，从而延长了其成活时间，也可延长其向外传递基因产物的时间，可进一步增强BE的作用。
, 百拇医药
(二) 免疫反应：Caruso等[8]报道在逆转录病毒介导转染的结肠癌转移动物模型中，经GCV处理后发现肿瘤床有局部的免疫反应，主要是CD4+和CD8+ T细胞，推测免疫反应在自杀基因治疗中起一定的作用。Freeman[9]通过PTPCR技术和免疫组 化技术发现，在具有BE的肿瘤细胞内IL-1，IL-6的mRNA表达产物持续增多，使肿瘤细胞内发生强烈的免疫反应。Gagandeep-s等[10]在动物实验中用表达HSV-tk逆转录病毒包装细胞和结肠癌细胞接种M26小鼠，并且用GCV腹腔注射，结果发现有免疫力的小鼠的肿瘤明显消退，而在免疫抑制的无胸腺小鼠中却未发现BE，更证实了免疫反应在抗肿瘤中的作用。
三、 联合治疗
自杀基因疗法有很多优点，由于应用先转导后治疗的途径，使整个基因治疗变得相对容易控制。它还可以直接杀伤肿瘤细胞，具有可诱导免疫反应，可靶向作用等特点。但是，它也存在不足之处，如：自杀基因诱导机体的免疫反应不够强大，体内应用对肿瘤细胞的转导效率比较低等。这些均制约着自杀基因的应用，于是，有的学者把目光投向了自杀基因的联合治疗。
, http://www.100md.com
(一) 自杀基因与细胞因子基因的联合应用：细胞因子是一类由免疫细胞和相关细胞产生的调节细胞功能的高活性多功能的蛋白质多肽分子，将细胞因子基因转导入肿瘤细胞内，可以大大增强肿瘤细胞的免疫原性，有效诱导肿瘤细胞特异性抗肿瘤免疫功能。将自杀基因和细胞因子基因联合应用，可以取长补短，提高治疗效果。一方面，自杀基因的表达可以直接杀伤一部分肿瘤细胞，消除肿瘤负荷。另一方面，细胞因子基因的表达可以激发机体的抗肿瘤免疫功能，这种联合治疗也已经在大肠癌治疗方面进行了实验研究。
Chen等[11]对小鼠结肠癌肝转移的动物模型通过重组腺病毒载体分别转导ADV/RSV-MIL-2基因和ADV/RSV-tk基因，然后给予GCV治疗。实验表明分别用IL-2基因，tk基因和两者联合治疗的肿瘤面积分别为120mm2，25mm2和5mm2，并发现抗肿瘤效果的提高与IL-2介导的T细胞免疫增强有关。
, 百拇医药 在此基础上，Chen等[12]应用HSV-tk基因，IL-2基因和GM-CSF基因联合治疗结肠癌肝转移的荷瘤小鼠，结果显示联合自杀基因和两种细胞因子基因治疗优于tk基因与IL-2基因的联合治疗。证实了肿瘤细胞内GM-CSF的局部表达及IL-2基因的延长表达可以产生持续的抗肿瘤免疫，从而避免了肿瘤的复发，延长动物的成活时间，并探讨其机制如下：HSV-tk/GCV处理引起肿瘤原位死亡，分解为残余碎片，含有肽类物质。GM-CSF表达可激活APCs细胞。肽类物质经APCs细胞处理加工后，把多肽-MHC-Ⅱ类分子复合物提呈给Th细胞并且使其活化，从而产生多种细胞因子，进而激少在CD8+ T淋巴细胞除具有直接溶细胞作用外，尚能产生一些细胞因子，诱导其他细胞的抗肿瘤效应[13]。
(二) 自杀基因与放疗的联合应用：目前有的学者已证实了自杀基因治疗肿瘤可增加肿瘤细胞对放疗的敏感性[14，15]。Gabel-M等[16]在用自杀基因于放疗联合应用治疗接种结肠癌细胞的动物模型中也得到了证实。他将接种Widr细胞的裸鼠分为4组：第一组用放射治疗； 第二组用自杀基因(CD基因)治疗； 第三组用自杀基因和放疗联合应用； 第四组用5-FU化疗和放疗。结果表明，联合自杀基因(CD基因)和放射治疗的小鼠肿瘤消退最快，并且肿瘤细胞对放疗的敏感性增加，病灶内发现大量的肿瘤细胞死亡。因此，自杀基因系统不管是单独使用或者与放疗联合应用都是一个很有前途的治疗方案。
, 百拇医药
综上：动物实验研究证实了自杀基因疗法对大肠癌的治疗价值，但是实验研究要过渡到临床应用尚有不少问题和困难，相信随着自杀基因疗法研究的不断深入，大肠癌的自杀基因治疗将不断完善，并早日为临床广大患者造福。■
参考文献：
[1]蒋琼，戈凯，许德华，等.组织专一性表达自杀基因治疗人大肠癌的研究.生物化学与生物物理进展，1996，23：376-377.
[2]Hwang HC,Smythe Wr,Elishami AA,et al.Gene therapy using adenovirucarrying the herpes simplex-thymidide kinase to treat in vivo model of human Malignant mesothelioma and lung cancer.Am J Resp Cell Mol Bio,1995,13:7-16.
, 百拇医药
[3]Hirschowitz FA,Ohwada A,Pascal WR,et al.In vivo adenovirus-mediated gene transfer of the Escheerichia coli Cytosine Deaminase gene to human colon carcinoma-derived tumors induces chemosensitivity to 5-fluorocytosine.Hum Gene Ther,1995,6:1055-1058.
[4]Freeman SM,Abboud CN,Wharteriby KA,et al.The bystander effect tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified.Can Res,1993,53:5274-5283.
[5]Bi WL,Parysek LM,Warnick R,et al.In vitro evidence that metabolic cooperation is responsible for the bystand effect observed with HSV-tk retroviral gene therapy.Hum Gene Ther,1993,4:725-731.
, 百拇医药
[6]Yang-L,Chiang Y,Lenz HJ,et al.Intercelluar communication mediates the bystander effect during herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir-based gene therapy of human gastrointestinal tumor cells.Hum Gene Ther,1998,9:719-728.
[7]Lan KH,Kanai-f,Shiratori X,et al.Tumor-specific gene expression adenovirus vectors.Gastroenterology,1996,111:1241-1251.
[8]Caruso M,Panis Y,Gagandeeps,et al.Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene.Proc Natal Acad Sci USA,1993,90:7023-7028.
, 百拇医药
[9]Freeman SM,Ramesh R,Shastri M,et al.The role of cytokines in mediating the bystand effect using HSV-tk xenogenic cells.Cancer-lett,1995,92:67-74.
[10]Gagandeep-s,Brew R,Green B,et al.Prodrug-activated gene therapy: involvement of an immunolgical component in the “bystander effect”.Cancer Gene Ther,1996,3:83-88.
[11]Chen SH,Chen XH,Wang YB,et al.Combination gene therapy for live metastasis of colon carcinoma.Prol Natl Acad Sci USA,1995,92:2277-2280.
, 百拇医药
[12]Chen SH,Kosai KI,Xu B,et al.Combination suicide and cytokine genetherapy for nepatic metastases of colon carcinoma: Subtained antitumor immunity prolongs animal survival.Cancer Res,1996,56:3758-3762.
[13]Yang Y,nunes TA,Berencsi K,et al.Cellularimmunity to viral antigens limits El-deleted adenoviruses for gene therapy.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:4407-4411.
[14]Kim sH,Kim JH,Kolozsvaray A,et al.Preferential radiosensitization of 9L glioma cells transduced with HSV-tk gene by acyvlovir.J Neurooncol,1997,33:189-194.
, http://www.100md.com
[15]Nishihara E,Nagayama Y,Mawatari F,et al.Retrovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transduction renders human thyoid carciomoma cell lines sensitive to gancilovir and radiation in vivo and in vitro.Endocrinology,1997,138:4577-4583.
[16]Gbel M,Kim JH,Kolozsvary A,et al.Selective in vivo radiosentization by 5-fluorocytosine of human colrectal cells transduced with the E.coli cytosine deaminase (Cd gene).Int J Radiat Oncol Biol Phy,1998,41:883-887.
(收稿日期：1999-08-30)
, http://www.100md.com
单位：钱伟峰(广州第一军区大学珠江医院普外科 510282)；宋惠娟(广州第一军区大学珠江医院普外科 510282)；黄宗海(广州第一军区大学珠江医院普外科 510282)
关键词：
腹部外科000128
大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，常用的手术、化疗、放疗等传统的治疗方式均未能使其疗效得到明显的提高。随着分子生物学及基因工程的发展，基因治疗已成为研究重点，其中自杀基因治疗是一种较为有效的具有临床应用潜力的治疗策略。它是把某些能将非毒性药物代谢成细胞毒性 药物的非哺乳动物酶类合成的基因-自杀基因，经分子生物学途径导入肿瘤细胞，使之在肿瘤细胞内特异地表达，该基因产物能将无毒的药物前体代谢为毒性产物，从而影响肿瘤细胞的DNA合成，引起细胞的死亡。目前用于治疗大肠癌的自杀基因主要有HSV-tk基因和CD基因。本文就自杀基因治疗大肠癌进行综述。
, 百拇医药
一、 肿瘤的特异性靶向转导
大肠癌的自杀基因治疗包括：构建携带自杀基因的重组病毒载体； 目的基因的转导； 药物前体治疗肿瘤细胞。为了能使目的基因安全有效地整合到“靶细胞”中，目前构建病毒载体多包含有细胞专一性的基因表达调控元件，使自杀基因只能在靶细胞中表达，而对周边正常的组织细胞无传染，从而保证了特异性的靶向转导作用。蒋琼等[1]构建了以CEA基因启动控制的HSV-tk和EC-CD表达质粒pCEA-tk和pCEA-CD,然后分别与pSV2-neo共转染结肠癌细胞株LoVo和宫颈癌细胞株Hela，与野生型LoVo细胞相比，LoVo/CEA-tk和LoVo/CEA-CD对GCV和5-FC的敏感性分别提高2 000倍和700倍，而Hela/CEA-tk(或Hela/CEA-CD)仍对GCV(或5-FC)不敏感，结果显示了癌胚抗原(CEA)基因启动子驱动自杀基因表达治疗结肠癌的优越性。另外，目前采用in vivo法进行目的基因原位转导[2]，即在瘤体内直接注射病毒上清液或包装细胞直接接种入瘤体内。Hirschowitz等[3]在结肠癌动物模型的病灶中直接注射AdCMV/CD重组腺病毒上清液，经GCV处理后，发现病灶明显缩小，与对照组相比，在第6天和第15天肿瘤体积分别缩小46%和74%,这充分说明了瘤体内基因转导的有效性，in vivo法使自杀基因疗法更利于临床应用。
, 百拇医药
二、 旁观者效应
1993年，Freeman[4] 在转导了HSV-tk基因的结肠癌细胞系HCT-116中观察到GCV不仅对转导基因的肿瘤细胞有杀伤作用，对于未转导tk基因的肿瘤细胞也具有杀伤作用，这种现象称为“旁观者效应”(bystander effect,BE)。
(一) 缝隙连接与细胞接触：Bi等[5]认为前药的毒性代谢产物或自杀基因表达的酶通过细胞间缝隙连接传入邻近细胞，引起细胞毒作用。他们将tk-和tk+的HT1080细胞混合培养，并加3H标记的GCV，结果发现除了tk+的细胞可掺入3H标记的GCV外，与其相接触的tk-细胞也可掺入3H标记的GCV，而未接触的tk-细胞内则没有。Yang-L等[6]用大肠癌细胞体外进行实验，发现连接蛋白-43与连接蛋白-26在BE中起重要的作用。对于CD基因引起的BE，则不需细胞接触而发挥作用[4]，5-FU可不通过细胞接触而发挥细胞毒作用[7]。可以设想，自杀基因表达的产物通过缝隙连接或易化扩散传递到周围细胞后，降低了转基因细胞内基因表达的产物浓度，在应用药物前体后，对转基因细胞杀伤作用减弱，从而延长了其成活时间，也可延长其向外传递基因产物的时间，可进一步增强BE的作用。
, 百拇医药
(二) 免疫反应：Caruso等[8]报道在逆转录病毒介导转染的结肠癌转移动物模型中，经GCV处理后发现肿瘤床有局部的免疫反应，主要是CD4+和CD8+ T细胞，推测免疫反应在自杀基因治疗中起一定的作用。Freeman[9]通过PTPCR技术和免疫组 化技术发现，在具有BE的肿瘤细胞内IL-1，IL-6的mRNA表达产物持续增多，使肿瘤细胞内发生强烈的免疫反应。Gagandeep-s等[10]在动物实验中用表达HSV-tk逆转录病毒包装细胞和结肠癌细胞接种M26小鼠，并且用GCV腹腔注射，结果发现有免疫力的小鼠的肿瘤明显消退，而在免疫抑制的无胸腺小鼠中却未发现BE，更证实了免疫反应在抗肿瘤中的作用。
三、 联合治疗
自杀基因疗法有很多优点，由于应用先转导后治疗的途径，使整个基因治疗变得相对容易控制。它还可以直接杀伤肿瘤细胞，具有可诱导免疫反应，可靶向作用等特点。但是，它也存在不足之处，如：自杀基因诱导机体的免疫反应不够强大，体内应用对肿瘤细胞的转导效率比较低等。这些均制约着自杀基因的应用，于是，有的学者把目光投向了自杀基因的联合治疗。
, http://www.100md.com
(一) 自杀基因与细胞因子基因的联合应用：细胞因子是一类由免疫细胞和相关细胞产生的调节细胞功能的高活性多功能的蛋白质多肽分子，将细胞因子基因转导入肿瘤细胞内，可以大大增强肿瘤细胞的免疫原性，有效诱导肿瘤细胞特异性抗肿瘤免疫功能。将自杀基因和细胞因子基因联合应用，可以取长补短，提高治疗效果。一方面，自杀基因的表达可以直接杀伤一部分肿瘤细胞，消除肿瘤负荷。另一方面，细胞因子基因的表达可以激发机体的抗肿瘤免疫功能，这种联合治疗也已经在大肠癌治疗方面进行了实验研究。
Chen等[11]对小鼠结肠癌肝转移的动物模型通过重组腺病毒载体分别转导ADV/RSV-MIL-2基因和ADV/RSV-tk基因，然后给予GCV治疗。实验表明分别用IL-2基因，tk基因和两者联合治疗的肿瘤面积分别为120mm2，25mm2和5mm2，并发现抗肿瘤效果的提高与IL-2介导的T细胞免疫增强有关。
, 百拇医药 在此基础上，Chen等[12]应用HSV-tk基因，IL-2基因和GM-CSF基因联合治疗结肠癌肝转移的荷瘤小鼠，结果显示联合自杀基因和两种细胞因子基因治疗优于tk基因与IL-2基因的联合治疗。证实了肿瘤细胞内GM-CSF的局部表达及IL-2基因的延长表达可以产生持续的抗肿瘤免疫，从而避免了肿瘤的复发，延长动物的成活时间，并探讨其机制如下：HSV-tk/GCV处理引起肿瘤原位死亡，分解为残余碎片，含有肽类物质。GM-CSF表达可激活APCs细胞。肽类物质经APCs细胞处理加工后，把多肽-MHC-Ⅱ类分子复合物提呈给Th细胞并且使其活化，从而产生多种细胞因子，进而激少在CD8+ T淋巴细胞除具有直接溶细胞作用外，尚能产生一些细胞因子，诱导其他细胞的抗肿瘤效应[13]。
(二) 自杀基因与放疗的联合应用：目前有的学者已证实了自杀基因治疗肿瘤可增加肿瘤细胞对放疗的敏感性[14，15]。Gabel-M等[16]在用自杀基因于放疗联合应用治疗接种结肠癌细胞的动物模型中也得到了证实。他将接种Widr细胞的裸鼠分为4组：第一组用放射治疗； 第二组用自杀基因(CD基因)治疗； 第三组用自杀基因和放疗联合应用； 第四组用5-FU化疗和放疗。结果表明，联合自杀基因(CD基因)和放射治疗的小鼠肿瘤消退最快，并且肿瘤细胞对放疗的敏感性增加，病灶内发现大量的肿瘤细胞死亡。因此，自杀基因系统不管是单独使用或者与放疗联合应用都是一个很有前途的治疗方案。
, 百拇医药
综上：动物实验研究证实了自杀基因疗法对大肠癌的治疗价值，但是实验研究要过渡到临床应用尚有不少问题和困难，相信随着自杀基因疗法研究的不断深入，大肠癌的自杀基因治疗将不断完善，并早日为临床广大患者造福。■
参考文献：
[1]蒋琼，戈凯，许德华，等.组织专一性表达自杀基因治疗人大肠癌的研究.生物化学与生物物理进展，1996，23：376-377.
[2]Hwang HC,Smythe Wr,Elishami AA,et al.Gene therapy using adenovirucarrying the herpes simplex-thymidide kinase to treat in vivo model of human Malignant mesothelioma and lung cancer.Am J Resp Cell Mol Bio,1995,13:7-16.
, 百拇医药
[3]Hirschowitz FA,Ohwada A,Pascal WR,et al.In vivo adenovirus-mediated gene transfer of the Escheerichia coli Cytosine Deaminase gene to human colon carcinoma-derived tumors induces chemosensitivity to 5-fluorocytosine.Hum Gene Ther,1995,6:1055-1058.
[4]Freeman SM,Abboud CN,Wharteriby KA,et al.The bystander effect tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified.Can Res,1993,53:5274-5283.
[5]Bi WL,Parysek LM,Warnick R,et al.In vitro evidence that metabolic cooperation is responsible for the bystand effect observed with HSV-tk retroviral gene therapy.Hum Gene Ther,1993,4:725-731.
, 百拇医药
[6]Yang-L,Chiang Y,Lenz HJ,et al.Intercelluar communication mediates the bystander effect during herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir-based gene therapy of human gastrointestinal tumor cells.Hum Gene Ther,1998,9:719-728.
[7]Lan KH,Kanai-f,Shiratori X,et al.Tumor-specific gene expression adenovirus vectors.Gastroenterology,1996,111:1241-1251.
[8]Caruso M,Panis Y,Gagandeeps,et al.Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene.Proc Natal Acad Sci USA,1993,90:7023-7028.
, 百拇医药
[9]Freeman SM,Ramesh R,Shastri M,et al.The role of cytokines in mediating the bystand effect using HSV-tk xenogenic cells.Cancer-lett,1995,92:67-74.
[10]Gagandeep-s,Brew R,Green B,et al.Prodrug-activated gene therapy: involvement of an immunolgical component in the “bystander effect”.Cancer Gene Ther,1996,3:83-88.
[11]Chen SH,Chen XH,Wang YB,et al.Combination gene therapy for live metastasis of colon carcinoma.Prol Natl Acad Sci USA,1995,92:2277-2280.
, 百拇医药
[12]Chen SH,Kosai KI,Xu B,et al.Combination suicide and cytokine genetherapy for nepatic metastases of colon carcinoma: Subtained antitumor immunity prolongs animal survival.Cancer Res,1996,56:3758-3762.
[13]Yang Y,nunes TA,Berencsi K,et al.Cellularimmunity to viral antigens limits El-deleted adenoviruses for gene therapy.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:4407-4411.
[14]Kim sH,Kim JH,Kolozsvaray A,et al.Preferential radiosensitization of 9L glioma cells transduced with HSV-tk gene by acyvlovir.J Neurooncol,1997,33:189-194.
, http://www.100md.com
[15]Nishihara E,Nagayama Y,Mawatari F,et al.Retrovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transduction renders human thyoid carciomoma cell lines sensitive to gancilovir and radiation in vivo and in vitro.Endocrinology,1997,138:4577-4583.
[16]Gbel M,Kim JH,Kolozsvary A,et al.Selective in vivo radiosentization by 5-fluorocytosine of human colrectal cells transduced with the E.coli cytosine deaminase (Cd gene).Int J Radiat Oncol Biol Phy,1998,41:883-887.
(收稿日期：1999-08-30)
, http://www.100md.com