IgE高亲和力受体β链基因的多态性与中国人哮喘易感性的研究
作者：陈虹 陈育智 胡良平 伏瑾 张惠琴 马煜
单位：陈虹(100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室)；伏瑾(100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室)；张惠琴(100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室)；陈育智(哮喘防治中心)马煜(哮喘防治中心)；胡良平(军事医学科学院情报所统计学教研室)
关键词：基因；变异(遗传学)；疾病易感性；哮喘
中华医学杂志000909 【摘要】 目的 探讨IgE高亲和力受体β链基因(FcεRI-β)的多态性与中国人哮喘易感性的连锁关系。方法 用PCR/RFLP检测FcεRI-β基因编码区E237G变异位点及非编码区的2个多态性位点，对32个哮喘家系共192份样品以及122例哮喘患儿进行分析。结果 (1)中国人在这3个位点的等位基因频率与白种人及日本人明显不同。(2)哮喘家系样本显示，第2内含子区多态位点的A等位片段与哮喘有显著相关性(P<0.05,OR=2.039, 95%CI=1.150-3.616, P=0.015)；基因型影响血清总IgE水平的变化(F=3.58, P=0.029)；A等位片段与高血清总IgE的相关性有显著性意义(P<0.05, RR=1.361, 95%CI=1.028-1.803, P=0.038)。(3)编码区E237G位点及另一个非编码区位点未获得有显著意义的结果。结论 本研究的两组样本中，未能获得足够证据证实FcεRI-β基因是哮喘易感性以及特应性进而导致血清总IgE水平增高的决定性基因。
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Study on the FcεRI-β polymorphism and susceptibility of asthma in a Chinese population
CHEN Hong
(Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical sciences, Beijing 100005, China)
CHEN Yuzhi
(Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical sciences, Beijing 100005, China)
, 百拇医药
HU Liangping, et al.
(Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical sciences, Beijing 100005, China)
【Abstract】 Objective To investigate the linkage between the polymorphisms of FcεRI-β gene and susceptibility of asthma in a Chinese population. Methods Thirty-two families with 192 samples and 122 cases of childhood asthma were studied. A coding variant of E237G was detected by PCR/XmnI restriction endonuclease digestion. Two RsaI polymorphic sites within non-coding region were tested by PCR/RsaI restriction endonuclease digestion. Results The allele frequencies for all three polymorphisms of FcεRI-β gene in the Chinese population were markedly different from those published results of Caucasians and Japanese. Comparing asthma family samples with normal control, we found that genotypes containing A allele within intron 2 polymorphic site were associated with asthma (P<0.05, OR=2.039). The level of total serum IgE showed significant difference among three genotypes of intron 2 polymorphic site (P<0.05). The association between A allele and elevated total serum IgE was also significant (P<0.05, RR=1.361). We could not find any significant results from the other two polymorphisms, even in the coding variant E237G. Conclusion We were unable to confirm that the FcεRI-β gene was crucial to the susceptibility of asthma and atopy and did not contribute substantially to variation in IgE levels from both sample groups.
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【Key words】 Genes； Variation (genetics)； Disease susceptibility； Asthma
IgE高亲和力受体由α、β和γ2 4个亚单位组成，通过α链将IgE结合在肥大细胞表面，产生由IgE介导的肥大细胞脱颗粒，释放白细胞介素-4和其他细胞因子，进而增加IgE的合成。β亚单位则认为是α链与细胞浆之间的一种传递信号。由于IgE高亲和力受体在介导Ⅰ型变态反应中的重要作用，因此定位于染色体11q13区的IgE高亲和力受体β链基因(high-affinity IgE receptor β chain gene, FcεRI-β)被认为是特应性和哮喘易感性的主要候选基因之一[1，2]。我们对FcεRI-β基因编码区E237G(237位氨基酸由甘氨酸替代谷氨酰胺)位点及两个非编码区位点进行分析，旨在获得中国人群样本在相关位点的资料，研究中国人的哮喘易感性与FcεRI-β基因的连锁关系。
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对象和方法
一、对象
1.哮喘家系样本：在福建省诏安县(哮喘发病率居全国最高，为5.6%[3])以哮喘患儿为先证者进行采样。所有受检个体在征得同意后，对病史及下列临床指征进行了评定：(1)根据国际间统一问卷诊断标准，了解病情及危险因素。(2)血清总IgE测定，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。(3)变应原皮肤点刺实验，共21种吸入性变应原。(4)肺功能测定，采用一秒用力呼气流量(FEV1)及峰流速测定。哮喘家系共32个，血样192份，年龄8个月～80岁。男性97人，患者59例，患病率为61%；女性95人，患者42例，占44%；男高于女，χ2=5.358, P<0.05。所有血样置4℃保存，于72 h内空运回北京，立即进行全血基因组DNA的提取。
2.哮喘患儿(独立个体)样本：在首都儿科研究所附属儿童医院哮喘专业门诊收集122例患儿血样，年龄5个月～16岁，其中男84例，女38例，病史及临床指征观察与家系标本相同。
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3.正常对照组：在诏安地区采集19份血样，选自诏安县医院实习学生和医生。北京地区48份血样，取自我所实验室工作人员、保健科健康体检儿童及外科整形手术儿。所有对照均无哮喘史及典型过敏史，其中男42人，女25人，年龄1～55岁。
二、方法
1.FcεRI-β基因(基因组数据库编号：M89796)编码区E237G位点的检测： PCR-RFLP的引物序列为：B7F 5′-GAGGTAAGTCTCTTGAGCG；B7X 5′-CTTATA-AATCAATGGGAGGAAACA，B7X引物3′端倒数第4个碱基将原序列的G变为A，既可通过PCR在扩增产物上引入限制性内切酶XmnI的酶切位点。XmnI的识别序列为：GAANN↓NNTTC，当T变异为C时，XmnI的切点亦消失。按常规方法进行PCR，退火温度为55℃。取3～5 μPCR产物，加入4 U XmnI酶，37℃消化2 h，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，硝酸银染色判读结果，既将2个等位片段均能被XmnI酶切开(237位为谷氨酰胺)定为EE型，均不能切开(237位为甘氨酸)定为GG型，杂合状态为EG型。采用直接DNA序列分析法对部分样本的PCR产物进行测序。
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2.非编码区两个多态性位点的检测: 扩增第7外显子(Exon)3′端非编码区C9869T变异区的引物序列为：Exon 7-F: 5′-TCACTGTGTATCATGCTAAGC-3′, Exon 7-R: 5′-TGATACAATACTGCATCGTGG-3′; 第2内含子区A1798G变异区的引物序列为：Intron 2-F: 5′-TCTGTCTGTCGAGAATGTTGC-3′, Intron 2-R: 5′CTGGTTAGATCTGAGAAAGAG-3′。PCR反应采用热启动，退火温度为58℃。PCR产物经质量分数为0.01的琼脂糖凝胶电泳检测后，取5 μl，加入5 U Rsal, 37℃消化2 h，质量分数为0.02的琼脂糖凝胶电泳分析结果，既将两个等位片段均不能被切开(Rsal位点缺失)定为AA型，均被消化(存在Rsal位点)定为BB型，杂合状态为AB型。
3.统计学处理: FcεRI-β基因多态性位点基因型频率及等位基因频率比较用χ2检验；采用单因素方差分析和协方差分析研究年龄、性别、诊断及基因型对血清总IgE的影响；以相对危险度(relative risk, RR)和比数比(odds ratio, OR)表示基因型及等位基因对发病风险的影响；用传递/不平衡检验(transmission/disequilibrium test, TDT)研究E237G位点等位片段的连锁不平衡[4]。以上处理采用SAS(军事医学科学院医学统计学教研室)软件进行。
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结果
PCR/XmnI检测E237G位点，EE型为150及23 bp 2个片段，GG型为173 bp的单一片段，EG型为173，150和23 bp 3个片段(图1a)。分别挑选3种基因型共10例样本，进行PCR产物直接序列分析，所获结果与PCR/ XmnI长度多态性分析结果一致。PCR/Rsal检测非编码区第7外显子位点，AA型显示为481 bp的单一片段，BB型为295和187 bp 2个片段，AB型为481、295和187 bp 3个片段(图1b)。内含子2位点扩增片段内距3＇端147 bp处尚有一个非多态性的Rsal酶切位点，因此AA型显示776和147 bp两个片段，BB型除了恒定的147 bp片段外，有490和286 bp两个片段，AB型则同时具有从776～147 bp的4个不同大小的片段(图1c)。
对正常无关个体分析结果显示，FcεRI-β基因的这3个多态性位点的等位基因频率与白种人及日本人的频率明显不同(表1)[5-8]。哮喘家系样本与正常对照比较，第2内含子区Rsal多态性位点的A等位片段与哮喘有显著相关性，P<0.05, OR=2.039, OR的95%置信区间为1.150-3.616, P=0.015(表2)。方差分析显示，年龄、性别以及诊断对血清总IgE水平的影响无显著性，而血清总IgE水平的变化仅在该位点3种不同基因型之间的差别有显著性意义，F=3.58, P=0.029；其中A等位片段与血清总IgE水平的升高之间的相关性有显著性意义，P<0.05, RR=1.361, RR的95%置信区间为1.028～1.803, P=0.038。对哮喘家系样本FcεRI-β基因编码区E237G及第7外显子RsaI多态性位点的实验数据经χ2检验及方差分析，均未获得有显著性意义的结果(表2)。采用TDT分析哮喘家系样本E237G位点的资料显示，有34个父(母)亲为EG杂合型，共传递了58条等位基因给他们的哮喘子女(E=28，G=30)。在具有两个等位基因的位点，其等位基因的期望传递频率应各为50%。假设E和G等位片段传递平衡，χ2td=(28-30)2/58=0.069，P>0.05，差异无显著意义[4]。以同样的方法对高血清总IgE水平与E237G位点的连锁关系进行TDT分析(血清总IgE水平经性别、年龄调整的几何均值为177.3 KU/L，大于此值作为高血清总IgE)，亦未获得有显著性意义的结果。
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图1 a E237G位点PCR/XmnI聚丙烯酰胺凝胶电泳图，1.PCR产物；2.EE型；3-4.EG杂合型；5.GG型；(注：23 bp片段已出胶)。b.Rsal-Xon 7位点琼脂糖凝胶电泳图，1.AA型，2.AB型，3.BB型。c.Rsal-intron 2位点琼脂糖凝胶电泳图，1.AB型，2.AA型，3.BB型
表1 我国哮喘患者FcεRI-β基因多态性位点的
等位基因频率及与白种人和日本人的比较 位点及等位基因
例数*
等位基因频率(%)
中国人
白种人
日本人
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RsaI intron 2
60
A
15.8
12.0
94.0
B
84.2
88.0
6.0
RsaI exon 7 URT
59
A
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94.9
59.0
B
5.1
41.0
E237G exon 7
47
E
80.9
97.4
97.0
G
19.1
, 百拇医药
2.6
3.0
注：*中国人正常无关个体
我院哮喘门诊122例哮喘患儿E237G位点的基因型以及等位基因频率与正常对照相比，差异无显著意义；以大于北京地区正常儿童血清总IgE分布的95%百分位数(320 KU/L)为标准，将哮喘患儿及正常对照儿各分为血清总IgE升高及正常两组，分别进行E237G基因型的比较，各组间差异无显著意义。用方差分析分别研究年龄、性别及E237G基因型对血清总IgE变化的影响，P值均无统计学意义。
讨论
FcεRI基因的β亚单位含有一个类似于酪氨酸激酶活化的免疫受体的氨基酸特征序列，提示其具有抗原介导的细胞活化作用[2]。对于其编码区E237G变异的重要性的认识，是由于这一变异改变了FcεRI-β基因的功能，还是以连锁不平衡的方式与其它多态性位点共同产生作用，目前尚不十分清楚。如果这一多态性与血清总IgE水平升高和诱发哮喘有显著相关性，则可以提示其具有重要的生物学及临床意义。对澳大利亚及日本人群的研究可见，该位点与哮喘明显相关，在澳大利亚人还与气道高反应性相关[5，6]。我们对FcεRI-β基因的3个多态性位点进行了检测，其中编码区E237G位点同时进行了哮喘家系及独立哮喘患儿2组样本的研究，综合运用了几项统计学分析手段。除第2内含子区多态性位点的A等位片段与哮喘及血清总IgE升高有显著相关性外(P值改变位于0.01～0.05之间)，另外两个位点未发现肯定的与哮喘及高血清总IgE相关的结果。对E237G位点的分析显示，正常中国人为甘氨酸变异型的频率明显高与白种人和日本人(达19.1%)，且有纯合变异个体存在。这一特点可能影响了该编码区位点变异的功能重要性。在我们研究的2组样本中，未能证实E237G变异是中国人哮喘及高血清总IgE的危险因素。
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表2 哮喘家系样本中FcεRI-β基因多态性位点与哮喘的关系 组别
例数
Rsal intron 2
Rsal exon7 UTR
E237G
基因型
等位基因
基因型
等位基因
基因型
等位基因
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AA
AB
BB
A
B
AA
AB
BB
A
B
EE
EG
GG
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E
G
哮喘成员
101
9
38
54
56(27.2)△
146(72.3)
93
8
0
194(96.0)
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8(4.0)
59
39
3
157(77.7)
45(22.3)
非哮喘成员
91
6
34
51
46(25.3)
136(74.7)
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87
4
0
178(97.8)
4(2.2)
56
33
2
145(79.7)
37(20.3)
正常对照
60*
1
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17
42
19(15.8)
101(84.2)
53
6
0
112(94.9)
6(5.1)
30
16
1
76(80.9)
, 百拇医药
18(19.1)
注：*正常对照在Rsal exon 7 UTR位点为59例，在E237G位点为47例；△与正常对照相比，χ2=5.956，P=0.015，Fish确切P=0.020，OR=2.039，95%置信区间为1.150～3.616，P<0.05；括号内为百分率(%) 我们在对哮喘家系样本E237G位点的研究中，采用了TDT的分析方法。TDT法是以每个发病子女与其杂合基因型的父(母)亲为一个分析单元，通过分析等位基因传递频率，进行疾病与遗传位点的关联/连锁分析。目前在进行复杂的多基因病的遗传连锁分析中，TDT法和受累同胞对法(affected sib pairs，ASP)是较常用的统计学方法。当一个位点对疾病的影响较弱(外显率低)时，ASP法需要较大的样本才能检出连锁。若该位点的致病基因与一个标记等位基因存在较强的连锁不平衡时，用TDT法检测出连锁的能力则较强。TDT法的另一个优点是可以利用只有一个发病子女的核心家庭资料，所以适用于该法分析的资料较易获取，尤其是在我国。尽管本研究尝试TDT法分析未能获得阳性结果，我们仍建议在今后的研究中使用此方法。
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志谢 福建省诏安县医院领导及林丽渊等医务人员在家系采集过程中的合作与支持；我所李硕，李志英，王海俊，赵莉，丁秀原，宋方，王虹等人给予本工作以帮助；本工作得到英国牛津大学医学系哮喘遗传研究室WOCM Cookson教授及MF Moffatte博士的指导
基金项目：北京市自然科学基金资助项目
参考文献
1，Sandford AJ, Shirakawa T, Moffatt MF, et al. Localization of atopy and β subunit of high-affinity IgE receptor (FcεRI) on chromosome 11q. Lancet, 1993,341(8841)：332-334.
2，Cookson WOCM. The genetics of asthma and allergy. AAAAI55th Annual Meeting, Northern Hemisphere C, Ballroom Level, Dolphin March 2, 1999.
, 百拇医药
3，全国儿科哮喘协作组.全国90万0～14岁儿童中支气管哮喘患病情况调查.中华结核和呼吸杂志，1993，16(哮喘增刊)：64-68.
4，Spielman RS, McGinnis RE, Evens WJ. Transmission test for linkage disequilibrium: The insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am J Hum Genet, 1993,52：506-516.
5，Hill MR, Cookson WOCM. A new variant of the β subunit of high-affinity receptor for immunoglobulin E (FcεRI-β E237G): associations with measures of atopy and bronchial hyper-responsiveness. Human Molecular Genetics, 1996,5：959-962.
, 百拇医药
6，Shirakawa T, Mao XQ, Sasaki S, et al. Association between atopic asthma and a coding variant of FcεRIβ in a Japanese population. Human Molecular Genetics, 1996,5：1129-1130.
7，Shirakawa T, Mao XQ, Sasaki S, et al. Association between atopy and FcεRIβ variants in the Japanese population. In: Sasaki S, Miyamoto T, Hopkin J, et al, eds. Recent advances in prediction and prevention of childhood allergy. 1995,29-31.
8，Palmer LJ, Pare PD, Faux JA, et al. FcεRI-β polymorphism and total serum IgE lavels in endemically parasitized Australian aborigines. Am J Hum Genet, 1997,61：182-188.
(收稿日期：2000-02-02), 百拇医药
单位：陈虹(100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室)；伏瑾(100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室)；张惠琴(100020 北京，首都儿科研究所生化免疫室)；陈育智(哮喘防治中心)马煜(哮喘防治中心)；胡良平(军事医学科学院情报所统计学教研室)
关键词：基因；变异(遗传学)；疾病易感性；哮喘
中华医学杂志000909 【摘要】 目的 探讨IgE高亲和力受体β链基因(FcεRI-β)的多态性与中国人哮喘易感性的连锁关系。方法 用PCR/RFLP检测FcεRI-β基因编码区E237G变异位点及非编码区的2个多态性位点，对32个哮喘家系共192份样品以及122例哮喘患儿进行分析。结果 (1)中国人在这3个位点的等位基因频率与白种人及日本人明显不同。(2)哮喘家系样本显示，第2内含子区多态位点的A等位片段与哮喘有显著相关性(P<0.05,OR=2.039, 95%CI=1.150-3.616, P=0.015)；基因型影响血清总IgE水平的变化(F=3.58, P=0.029)；A等位片段与高血清总IgE的相关性有显著性意义(P<0.05, RR=1.361, 95%CI=1.028-1.803, P=0.038)。(3)编码区E237G位点及另一个非编码区位点未获得有显著意义的结果。结论 本研究的两组样本中，未能获得足够证据证实FcεRI-β基因是哮喘易感性以及特应性进而导致血清总IgE水平增高的决定性基因。
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Study on the FcεRI-β polymorphism and susceptibility of asthma in a Chinese population
CHEN Hong
(Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical sciences, Beijing 100005, China)
CHEN Yuzhi
(Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical sciences, Beijing 100005, China)
, 百拇医药
HU Liangping, et al.
(Department of Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical sciences, Beijing 100005, China)
【Abstract】 Objective To investigate the linkage between the polymorphisms of FcεRI-β gene and susceptibility of asthma in a Chinese population. Methods Thirty-two families with 192 samples and 122 cases of childhood asthma were studied. A coding variant of E237G was detected by PCR/XmnI restriction endonuclease digestion. Two RsaI polymorphic sites within non-coding region were tested by PCR/RsaI restriction endonuclease digestion. Results The allele frequencies for all three polymorphisms of FcεRI-β gene in the Chinese population were markedly different from those published results of Caucasians and Japanese. Comparing asthma family samples with normal control, we found that genotypes containing A allele within intron 2 polymorphic site were associated with asthma (P<0.05, OR=2.039). The level of total serum IgE showed significant difference among three genotypes of intron 2 polymorphic site (P<0.05). The association between A allele and elevated total serum IgE was also significant (P<0.05, RR=1.361). We could not find any significant results from the other two polymorphisms, even in the coding variant E237G. Conclusion We were unable to confirm that the FcεRI-β gene was crucial to the susceptibility of asthma and atopy and did not contribute substantially to variation in IgE levels from both sample groups.
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【Key words】 Genes； Variation (genetics)； Disease susceptibility； Asthma
IgE高亲和力受体由α、β和γ2 4个亚单位组成，通过α链将IgE结合在肥大细胞表面，产生由IgE介导的肥大细胞脱颗粒，释放白细胞介素-4和其他细胞因子，进而增加IgE的合成。β亚单位则认为是α链与细胞浆之间的一种传递信号。由于IgE高亲和力受体在介导Ⅰ型变态反应中的重要作用，因此定位于染色体11q13区的IgE高亲和力受体β链基因(high-affinity IgE receptor β chain gene, FcεRI-β)被认为是特应性和哮喘易感性的主要候选基因之一[1，2]。我们对FcεRI-β基因编码区E237G(237位氨基酸由甘氨酸替代谷氨酰胺)位点及两个非编码区位点进行分析，旨在获得中国人群样本在相关位点的资料，研究中国人的哮喘易感性与FcεRI-β基因的连锁关系。
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对象和方法
一、对象
1.哮喘家系样本：在福建省诏安县(哮喘发病率居全国最高，为5.6%[3])以哮喘患儿为先证者进行采样。所有受检个体在征得同意后，对病史及下列临床指征进行了评定：(1)根据国际间统一问卷诊断标准，了解病情及危险因素。(2)血清总IgE测定，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。(3)变应原皮肤点刺实验，共21种吸入性变应原。(4)肺功能测定，采用一秒用力呼气流量(FEV1)及峰流速测定。哮喘家系共32个，血样192份，年龄8个月～80岁。男性97人，患者59例，患病率为61%；女性95人，患者42例，占44%；男高于女，χ2=5.358, P<0.05。所有血样置4℃保存，于72 h内空运回北京，立即进行全血基因组DNA的提取。
2.哮喘患儿(独立个体)样本：在首都儿科研究所附属儿童医院哮喘专业门诊收集122例患儿血样，年龄5个月～16岁，其中男84例，女38例，病史及临床指征观察与家系标本相同。
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3.正常对照组：在诏安地区采集19份血样，选自诏安县医院实习学生和医生。北京地区48份血样，取自我所实验室工作人员、保健科健康体检儿童及外科整形手术儿。所有对照均无哮喘史及典型过敏史，其中男42人，女25人，年龄1～55岁。
二、方法
1.FcεRI-β基因(基因组数据库编号：M89796)编码区E237G位点的检测： PCR-RFLP的引物序列为：B7F 5′-GAGGTAAGTCTCTTGAGCG；B7X 5′-CTTATA-AATCAATGGGAGGAAACA，B7X引物3′端倒数第4个碱基将原序列的G变为A，既可通过PCR在扩增产物上引入限制性内切酶XmnI的酶切位点。XmnI的识别序列为：GAANN↓NNTTC，当T变异为C时，XmnI的切点亦消失。按常规方法进行PCR，退火温度为55℃。取3～5 μPCR产物，加入4 U XmnI酶，37℃消化2 h，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，硝酸银染色判读结果，既将2个等位片段均能被XmnI酶切开(237位为谷氨酰胺)定为EE型，均不能切开(237位为甘氨酸)定为GG型，杂合状态为EG型。采用直接DNA序列分析法对部分样本的PCR产物进行测序。
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2.非编码区两个多态性位点的检测: 扩增第7外显子(Exon)3′端非编码区C9869T变异区的引物序列为：Exon 7-F: 5′-TCACTGTGTATCATGCTAAGC-3′, Exon 7-R: 5′-TGATACAATACTGCATCGTGG-3′; 第2内含子区A1798G变异区的引物序列为：Intron 2-F: 5′-TCTGTCTGTCGAGAATGTTGC-3′, Intron 2-R: 5′CTGGTTAGATCTGAGAAAGAG-3′。PCR反应采用热启动，退火温度为58℃。PCR产物经质量分数为0.01的琼脂糖凝胶电泳检测后，取5 μl，加入5 U Rsal, 37℃消化2 h，质量分数为0.02的琼脂糖凝胶电泳分析结果，既将两个等位片段均不能被切开(Rsal位点缺失)定为AA型，均被消化(存在Rsal位点)定为BB型，杂合状态为AB型。
3.统计学处理: FcεRI-β基因多态性位点基因型频率及等位基因频率比较用χ2检验；采用单因素方差分析和协方差分析研究年龄、性别、诊断及基因型对血清总IgE的影响；以相对危险度(relative risk, RR)和比数比(odds ratio, OR)表示基因型及等位基因对发病风险的影响；用传递/不平衡检验(transmission/disequilibrium test, TDT)研究E237G位点等位片段的连锁不平衡[4]。以上处理采用SAS(军事医学科学院医学统计学教研室)软件进行。
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结果
PCR/XmnI检测E237G位点，EE型为150及23 bp 2个片段，GG型为173 bp的单一片段，EG型为173，150和23 bp 3个片段(图1a)。分别挑选3种基因型共10例样本，进行PCR产物直接序列分析，所获结果与PCR/ XmnI长度多态性分析结果一致。PCR/Rsal检测非编码区第7外显子位点，AA型显示为481 bp的单一片段，BB型为295和187 bp 2个片段，AB型为481、295和187 bp 3个片段(图1b)。内含子2位点扩增片段内距3＇端147 bp处尚有一个非多态性的Rsal酶切位点，因此AA型显示776和147 bp两个片段，BB型除了恒定的147 bp片段外，有490和286 bp两个片段，AB型则同时具有从776～147 bp的4个不同大小的片段(图1c)。
对正常无关个体分析结果显示，FcεRI-β基因的这3个多态性位点的等位基因频率与白种人及日本人的频率明显不同(表1)[5-8]。哮喘家系样本与正常对照比较，第2内含子区Rsal多态性位点的A等位片段与哮喘有显著相关性，P<0.05, OR=2.039, OR的95%置信区间为1.150-3.616, P=0.015(表2)。方差分析显示，年龄、性别以及诊断对血清总IgE水平的影响无显著性，而血清总IgE水平的变化仅在该位点3种不同基因型之间的差别有显著性意义，F=3.58, P=0.029；其中A等位片段与血清总IgE水平的升高之间的相关性有显著性意义，P<0.05, RR=1.361, RR的95%置信区间为1.028～1.803, P=0.038。对哮喘家系样本FcεRI-β基因编码区E237G及第7外显子RsaI多态性位点的实验数据经χ2检验及方差分析，均未获得有显著性意义的结果(表2)。采用TDT分析哮喘家系样本E237G位点的资料显示，有34个父(母)亲为EG杂合型，共传递了58条等位基因给他们的哮喘子女(E=28，G=30)。在具有两个等位基因的位点，其等位基因的期望传递频率应各为50%。假设E和G等位片段传递平衡，χ2td=(28-30)2/58=0.069，P>0.05，差异无显著意义[4]。以同样的方法对高血清总IgE水平与E237G位点的连锁关系进行TDT分析(血清总IgE水平经性别、年龄调整的几何均值为177.3 KU/L，大于此值作为高血清总IgE)，亦未获得有显著性意义的结果。
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图1 a E237G位点PCR/XmnI聚丙烯酰胺凝胶电泳图，1.PCR产物；2.EE型；3-4.EG杂合型；5.GG型；(注：23 bp片段已出胶)。b.Rsal-Xon 7位点琼脂糖凝胶电泳图，1.AA型，2.AB型，3.BB型。c.Rsal-intron 2位点琼脂糖凝胶电泳图，1.AB型，2.AA型，3.BB型
表1 我国哮喘患者FcεRI-β基因多态性位点的
等位基因频率及与白种人和日本人的比较 位点及等位基因
例数*
等位基因频率(%)
中国人
白种人
日本人
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RsaI intron 2
60
A
15.8
12.0
94.0
B
84.2
88.0
6.0
RsaI exon 7 URT
59
A
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94.9
59.0
B
5.1
41.0
E237G exon 7
47
E
80.9
97.4
97.0
G
19.1
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2.6
3.0
注：*中国人正常无关个体
我院哮喘门诊122例哮喘患儿E237G位点的基因型以及等位基因频率与正常对照相比，差异无显著意义；以大于北京地区正常儿童血清总IgE分布的95%百分位数(320 KU/L)为标准，将哮喘患儿及正常对照儿各分为血清总IgE升高及正常两组，分别进行E237G基因型的比较，各组间差异无显著意义。用方差分析分别研究年龄、性别及E237G基因型对血清总IgE变化的影响，P值均无统计学意义。
讨论
FcεRI基因的β亚单位含有一个类似于酪氨酸激酶活化的免疫受体的氨基酸特征序列，提示其具有抗原介导的细胞活化作用[2]。对于其编码区E237G变异的重要性的认识，是由于这一变异改变了FcεRI-β基因的功能，还是以连锁不平衡的方式与其它多态性位点共同产生作用，目前尚不十分清楚。如果这一多态性与血清总IgE水平升高和诱发哮喘有显著相关性，则可以提示其具有重要的生物学及临床意义。对澳大利亚及日本人群的研究可见，该位点与哮喘明显相关，在澳大利亚人还与气道高反应性相关[5，6]。我们对FcεRI-β基因的3个多态性位点进行了检测，其中编码区E237G位点同时进行了哮喘家系及独立哮喘患儿2组样本的研究，综合运用了几项统计学分析手段。除第2内含子区多态性位点的A等位片段与哮喘及血清总IgE升高有显著相关性外(P值改变位于0.01～0.05之间)，另外两个位点未发现肯定的与哮喘及高血清总IgE相关的结果。对E237G位点的分析显示，正常中国人为甘氨酸变异型的频率明显高与白种人和日本人(达19.1%)，且有纯合变异个体存在。这一特点可能影响了该编码区位点变异的功能重要性。在我们研究的2组样本中，未能证实E237G变异是中国人哮喘及高血清总IgE的危险因素。
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表2 哮喘家系样本中FcεRI-β基因多态性位点与哮喘的关系 组别
例数
Rsal intron 2
Rsal exon7 UTR
E237G
基因型
等位基因
基因型
等位基因
基因型
等位基因
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AA
AB
BB
A
B
AA
AB
BB
A
B
EE
EG
GG
, http://www.100md.com
E
G
哮喘成员
101
9
38
54
56(27.2)△
146(72.3)
93
8
0
194(96.0)
, http://www.100md.com
8(4.0)
59
39
3
157(77.7)
45(22.3)
非哮喘成员
91
6
34
51
46(25.3)
136(74.7)
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87
4
0
178(97.8)
4(2.2)
56
33
2
145(79.7)
37(20.3)
正常对照
60*
1
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17
42
19(15.8)
101(84.2)
53
6
0
112(94.9)
6(5.1)
30
16
1
76(80.9)
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18(19.1)
注：*正常对照在Rsal exon 7 UTR位点为59例，在E237G位点为47例；△与正常对照相比，χ2=5.956，P=0.015，Fish确切P=0.020，OR=2.039，95%置信区间为1.150～3.616，P<0.05；括号内为百分率(%) 我们在对哮喘家系样本E237G位点的研究中，采用了TDT的分析方法。TDT法是以每个发病子女与其杂合基因型的父(母)亲为一个分析单元，通过分析等位基因传递频率，进行疾病与遗传位点的关联/连锁分析。目前在进行复杂的多基因病的遗传连锁分析中，TDT法和受累同胞对法(affected sib pairs，ASP)是较常用的统计学方法。当一个位点对疾病的影响较弱(外显率低)时，ASP法需要较大的样本才能检出连锁。若该位点的致病基因与一个标记等位基因存在较强的连锁不平衡时，用TDT法检测出连锁的能力则较强。TDT法的另一个优点是可以利用只有一个发病子女的核心家庭资料，所以适用于该法分析的资料较易获取，尤其是在我国。尽管本研究尝试TDT法分析未能获得阳性结果，我们仍建议在今后的研究中使用此方法。
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志谢 福建省诏安县医院领导及林丽渊等医务人员在家系采集过程中的合作与支持；我所李硕，李志英，王海俊，赵莉，丁秀原，宋方，王虹等人给予本工作以帮助；本工作得到英国牛津大学医学系哮喘遗传研究室WOCM Cookson教授及MF Moffatte博士的指导
基金项目：北京市自然科学基金资助项目
参考文献
1，Sandford AJ, Shirakawa T, Moffatt MF, et al. Localization of atopy and β subunit of high-affinity IgE receptor (FcεRI) on chromosome 11q. Lancet, 1993,341(8841)：332-334.
2，Cookson WOCM. The genetics of asthma and allergy. AAAAI55th Annual Meeting, Northern Hemisphere C, Ballroom Level, Dolphin March 2, 1999.
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3，全国儿科哮喘协作组.全国90万0～14岁儿童中支气管哮喘患病情况调查.中华结核和呼吸杂志，1993，16(哮喘增刊)：64-68.
4，Spielman RS, McGinnis RE, Evens WJ. Transmission test for linkage disequilibrium: The insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am J Hum Genet, 1993,52：506-516.
5，Hill MR, Cookson WOCM. A new variant of the β subunit of high-affinity receptor for immunoglobulin E (FcεRI-β E237G): associations with measures of atopy and bronchial hyper-responsiveness. Human Molecular Genetics, 1996,5：959-962.
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6，Shirakawa T, Mao XQ, Sasaki S, et al. Association between atopic asthma and a coding variant of FcεRIβ in a Japanese population. Human Molecular Genetics, 1996,5：1129-1130.
7，Shirakawa T, Mao XQ, Sasaki S, et al. Association between atopy and FcεRIβ variants in the Japanese population. In: Sasaki S, Miyamoto T, Hopkin J, et al, eds. Recent advances in prediction and prevention of childhood allergy. 1995,29-31.
8，Palmer LJ, Pare PD, Faux JA, et al. FcεRI-β polymorphism and total serum IgE lavels in endemically parasitized Australian aborigines. Am J Hum Genet, 1997,61：182-188.
(收稿日期：2000-02-02), 百拇医药