钆标记抗人肝癌单克隆抗体瘤内注射对荷瘤裸鼠的磁共振增强试验
作者：许乙凯 刘杏元 张嘉宁 俞志坚
单位：许乙凯 刘杏元(510515 广州第一军医大学南方医院影像中心);张嘉宁(第一军医大学动物所)；俞志坚(第一军医大学珠江医院放射科MRI室)
关键词：肝癌；单克隆抗体；磁共振成象
放射学实践990217 【摘要】 目的：探讨小剂量瘤内注射钆标记抗人肝癌单克隆抗体的磁共振增强效应。方法：应用DTPA环酐双向偶合剂制出Gd-DTPA-McAds;实验组4只荷肝癌裸鼠直接瘤内注入30μg单克隆抗体量的Gd-DTPA-McAds;对照组向瘤内注入30μg单克隆抗体的生理盐水(n=2)，12h后行T1加权像扫描。结果：实验组瘤内出现斑片状或不均匀强化，而对照组瘤体为均匀中等信号。结论：瘤内注射法能有效提高瘤靶内标记抗体的浓度，对改进MR免疫成像的敏感性有帮助。
, 百拇医药 Experimental study on the contrast enhancement of MRI after intratumoral injection of gadolinium labelled antibodies against human hepatocellular carcinoma in the nude mouce model
Xu Yikai,Liu Xingyuan,Zhang Jianing,et al.
(Medical Imaging Center,Nanfang Hospital of the First Military Medical University,Guangzhong 510515)
【Abstract】 Purpose:To evaluate the possibility of MR targeting enhancement with local injection of a small dose of Gd labelled antihuman hepatocellular carcinoma McAbs(Hab 18).Methods:Gd-DTPA was prepared by using CA-DTPA to conjugate both Hab 18 antibodies and Gd3+.Of 6 nude mice bearing hepatocellular Carcinoma,4 cases were injected intratumorally with Gd-DTPA-McAbs at a dose of 30μg labelled antibody per mouse,while 2 were injected intratumorally with 30μg Hab 18 antibodies in normal saline as the control group. MR scans were performed 12 hours after the injection in all animals.Results:On T1 weighted images,there were patchy or unhomogeneous enhancements in nodular lesions of experimental group,while no enhancement were noticed in the control group.Conclusion: Intratumoral injection could effectively raise the tissue concentration of the labelled McAbs in the nodular target.Therefore,it is a valuable and simple way for improving the sensitivity of MR immunoimaging.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatocellular carcinoma Monoclonal antibodies MRI
磁共振免疫成像(MR immunoimaging,简称MRII)是以单克隆抗体为载体，通过抗体与抗原(肿瘤组织)的特异性结合，将顺磁性元素导向肿瘤内，实现肿瘤的定向强化。这种方法有可能对肿瘤的早期定性和定量诊断有帮助。我们早期研究[1]及国外有关报道[2]均证实了MRII的可行性，但由于MRII的敏感性仍较差，制约其广泛应用。通常MRII使用的单克隆抗体量高达1～2mg/只，相当于核素肿瘤放射免疫成像 (Radioimmuno-Imaging,RII) 单克隆抗体使用量的100～400倍。按此标准，一个50kg体重的成年人要进行MRII，至少需要的单克隆抗体量为2500mg以上，而市场上1mg高纯度单克隆抗体的价格近千元，且大剂量使用鼠源性单克隆抗体可能会导致免疫源性问题。可见，如何有效的提高MRII的检测敏感性，尽量减少标记抗体的使用，是MRII能否进入临床应用的关键。
, 百拇医药
提高MRII敏感性的基本途径，是寻找新的标记方法，使每分子单克隆抗体携带更多的Gd3+，同时又保持高度的免疫活性，目前这方面研究进展不多。本文尝试瘤内直接注射小剂量钆标记抗人肝癌单克隆抗体(Gd-DTPA-McAbs),并观察其强化作用。
材料和方法
1. 单克隆抗体及标记
单克隆抗体 单克隆抗体Hab18系鼠源抗人肝癌单克隆抗体，为IgG1亚型，浓度10mg/ml，-20℃保存。
Gd-DTPA-McAbs制备 DTPA环酐为Sigma产品。用二步法进行标记：1mgHAb18(McAbs)溶于100μl0.1MNaHCO3(PH＝8.0)溶液，再加入25μl46.6mmol/l的DTPA环酐DEMO溶液，用0.25mol/l NaOH将pH调至8.5，室温下反应1h，移入透析袋内4℃下用生理盐水透析8h，换液2次。将上述液体移入试管内，加入50μl33mmol/lGdcl3液混匀，室温下反应2h，再移至生理盐水中透析24h，换液3次。
, 百拇医药
Gd-DTPA-McAbs抗体浓度测定 将上述液体稀释4倍，国产756mc紫外线分光光度计测波长280nm吸光度，按E1%280=14计算Gd-DTPA-McAbs中IgG量，结果为300μg/ml。
2. 标记物免疫活性试验
肝癌QGY-7703细胞和结肠癌LST-174T细胞分别悬浮于1%DSA-PBS液中，每管细胞数为2×106个细胞/ml，分别加入1ml上述Gd-DTPA-McAbs，37℃孵育20min，0.01M PBS离心洗4遍，除去末与癌细胞结合的Gd-DTPA-McAbs,最后加入2ml 0.01M PBS，制成悬液，置1.5TGE公司Signa MR仪行FSE扫描，TR200ms,TE15ms比较二管信号强度差别。
3. 裸鼠模型建立及增强试验
, 百拇医药
6只6周龄裸鼠，将QGY-7703肝癌细胞按2×107/只注入裸鼠皮下，肿瘤生长至0.5～1.0cm备用，第一组4只，向瘤内直接注入含抗体量为30μg的Gd-DTPA-McAbs;第二组有2只，向瘤内注射溶有30μgHAb18的生理盐水0.1ml作阴性对照。分别于给药前、给药后12h行T1加权扫描(FSE，TR200ms,TE15ms,层厚5mm)。
结 果
1. Gd-DTPA-McAbs的免疫活性
肝癌细胞管与加入Gd-DTPA-McAbs结合，信号强度升高(强度值980)：而结肠癌管由于没有Gd-DTPA-McAbs结合，信号强度较低，强度值为430。表示Gd-DTPA-McAbs仍具有良好的免疫活性。
2. 实验组
, http://www.100md.com
4只裸鼠瘤结的信号强度均有升高，表现为斑片状或不均匀强度(图1、2)，而对照组瘤体仍为中等信号。
图1 平扫T1加权像上瘤结呈中等信号。
图2 局部注射Gd-DTPA-McAbs后12h，相似切面上显示瘤体呈斑片状强化(箭头)。
讨 论
MRII借鉴于RII的技术思想，且具有分辨率高和无电离辐射的潜在优势。因为只需少量核素就可被SPECT检测到，而尽管顺磁性元素与单克隆抗体(生物大分子)结合后弛豫增强效应提高26倍[3]，但仍需要在较高浓度下，才会产生肉眼可辩的MR信号变化。为了克服MRII的敏感性低这一问题，往往需要使用大剂量的标记单克隆抗体。本文尝试改变给药途径，即由静脉注射方式改为直接瘤内注射的方式，单克隆抗体使用量(小鼠：30μg/只)可降至接近RII水平(小鼠：5～20μg/只)，并成功地观察到瘤体产生于MR信号改变。其原因主要为：从静脉方式注入的Gd-DTPA-McAbs 在体内经历了一个复杂的生物动态过程，易受到抗原-抗体交叉反应及遇吞噬细胞吞噬等多种因素干扰，因此，从血循环最终到达瘤靶的单克隆抗体数量十分有限，而局部瘤内注射方式逃避了上述复杂因素的干扰，并且使标记抗体在最佳活性条件下(进入血循环的单克隆抗体活性会有一定的下降)直接与瘤组织接触并充分结合，因而大大减少了单克隆抗体的使用剂量，提高了MRII的敏感性。当然，局部瘤内注射法不如静脉给药方式应用更加方便和广泛，但在现代医学实践中，借助影像定位技术，已能对绝大多数实体瘤进行穿刺注射，因此，小剂量Gd-DTPA-McAbs瘤内注射进行MR免疫成像，仍在一定的临床实用价值，对肝癌的早期诊断将发挥积极作用。
, 百拇医药
参考文献
1 王劲武，黄其鎏，许乙凯，等.Gd标记抗人大肠癌单克隆抗体CL-3对裸鼠肿瘤模型MRI诊断的实验研究.中华放射学杂志，1998，32(6)∶419.
2 Matsumura A,Shibata Y,Nakagawa K，et al. MRI Contrast enhancement by Gd-DTPA-Monoclonal antibody in 9 L.glioma rats.Acta Neurochir,1994,60(supp)∶356.
3 Paajanen H,Peisto T,Hemmila I，et al. Proton Relaxation Enhancement of Albumin,Immunoglobulin G and Fibrinogen labelled With Gd-DTPA.Magnetic Resonance In Medicine,1990,13∶38.
(1998-08-26 收稿), 百拇医药
单位：许乙凯 刘杏元(510515 广州第一军医大学南方医院影像中心);张嘉宁(第一军医大学动物所)；俞志坚(第一军医大学珠江医院放射科MRI室)
关键词：肝癌；单克隆抗体；磁共振成象
放射学实践990217 【摘要】 目的：探讨小剂量瘤内注射钆标记抗人肝癌单克隆抗体的磁共振增强效应。方法：应用DTPA环酐双向偶合剂制出Gd-DTPA-McAds;实验组4只荷肝癌裸鼠直接瘤内注入30μg单克隆抗体量的Gd-DTPA-McAds;对照组向瘤内注入30μg单克隆抗体的生理盐水(n=2)，12h后行T1加权像扫描。结果：实验组瘤内出现斑片状或不均匀强化，而对照组瘤体为均匀中等信号。结论：瘤内注射法能有效提高瘤靶内标记抗体的浓度，对改进MR免疫成像的敏感性有帮助。
, 百拇医药 Experimental study on the contrast enhancement of MRI after intratumoral injection of gadolinium labelled antibodies against human hepatocellular carcinoma in the nude mouce model
Xu Yikai,Liu Xingyuan,Zhang Jianing,et al.
(Medical Imaging Center,Nanfang Hospital of the First Military Medical University,Guangzhong 510515)
【Abstract】 Purpose:To evaluate the possibility of MR targeting enhancement with local injection of a small dose of Gd labelled antihuman hepatocellular carcinoma McAbs(Hab 18).Methods:Gd-DTPA was prepared by using CA-DTPA to conjugate both Hab 18 antibodies and Gd3+.Of 6 nude mice bearing hepatocellular Carcinoma,4 cases were injected intratumorally with Gd-DTPA-McAbs at a dose of 30μg labelled antibody per mouse,while 2 were injected intratumorally with 30μg Hab 18 antibodies in normal saline as the control group. MR scans were performed 12 hours after the injection in all animals.Results:On T1 weighted images,there were patchy or unhomogeneous enhancements in nodular lesions of experimental group,while no enhancement were noticed in the control group.Conclusion: Intratumoral injection could effectively raise the tissue concentration of the labelled McAbs in the nodular target.Therefore,it is a valuable and simple way for improving the sensitivity of MR immunoimaging.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatocellular carcinoma Monoclonal antibodies MRI
磁共振免疫成像(MR immunoimaging,简称MRII)是以单克隆抗体为载体，通过抗体与抗原(肿瘤组织)的特异性结合，将顺磁性元素导向肿瘤内，实现肿瘤的定向强化。这种方法有可能对肿瘤的早期定性和定量诊断有帮助。我们早期研究[1]及国外有关报道[2]均证实了MRII的可行性，但由于MRII的敏感性仍较差，制约其广泛应用。通常MRII使用的单克隆抗体量高达1～2mg/只，相当于核素肿瘤放射免疫成像 (Radioimmuno-Imaging,RII) 单克隆抗体使用量的100～400倍。按此标准，一个50kg体重的成年人要进行MRII，至少需要的单克隆抗体量为2500mg以上，而市场上1mg高纯度单克隆抗体的价格近千元，且大剂量使用鼠源性单克隆抗体可能会导致免疫源性问题。可见，如何有效的提高MRII的检测敏感性，尽量减少标记抗体的使用，是MRII能否进入临床应用的关键。
, 百拇医药
提高MRII敏感性的基本途径，是寻找新的标记方法，使每分子单克隆抗体携带更多的Gd3+，同时又保持高度的免疫活性，目前这方面研究进展不多。本文尝试瘤内直接注射小剂量钆标记抗人肝癌单克隆抗体(Gd-DTPA-McAbs),并观察其强化作用。
材料和方法
1. 单克隆抗体及标记
单克隆抗体 单克隆抗体Hab18系鼠源抗人肝癌单克隆抗体，为IgG1亚型，浓度10mg/ml，-20℃保存。
Gd-DTPA-McAbs制备 DTPA环酐为Sigma产品。用二步法进行标记：1mgHAb18(McAbs)溶于100μl0.1MNaHCO3(PH＝8.0)溶液，再加入25μl46.6mmol/l的DTPA环酐DEMO溶液，用0.25mol/l NaOH将pH调至8.5，室温下反应1h，移入透析袋内4℃下用生理盐水透析8h，换液2次。将上述液体移入试管内，加入50μl33mmol/lGdcl3液混匀，室温下反应2h，再移至生理盐水中透析24h，换液3次。
, 百拇医药
Gd-DTPA-McAbs抗体浓度测定 将上述液体稀释4倍，国产756mc紫外线分光光度计测波长280nm吸光度，按E1%280=14计算Gd-DTPA-McAbs中IgG量，结果为300μg/ml。
2. 标记物免疫活性试验
肝癌QGY-7703细胞和结肠癌LST-174T细胞分别悬浮于1%DSA-PBS液中，每管细胞数为2×106个细胞/ml，分别加入1ml上述Gd-DTPA-McAbs，37℃孵育20min，0.01M PBS离心洗4遍，除去末与癌细胞结合的Gd-DTPA-McAbs,最后加入2ml 0.01M PBS，制成悬液，置1.5TGE公司Signa MR仪行FSE扫描，TR200ms,TE15ms比较二管信号强度差别。
3. 裸鼠模型建立及增强试验
, 百拇医药
6只6周龄裸鼠，将QGY-7703肝癌细胞按2×107/只注入裸鼠皮下，肿瘤生长至0.5～1.0cm备用，第一组4只，向瘤内直接注入含抗体量为30μg的Gd-DTPA-McAbs;第二组有2只，向瘤内注射溶有30μgHAb18的生理盐水0.1ml作阴性对照。分别于给药前、给药后12h行T1加权扫描(FSE，TR200ms,TE15ms,层厚5mm)。
结 果
1. Gd-DTPA-McAbs的免疫活性
肝癌细胞管与加入Gd-DTPA-McAbs结合，信号强度升高(强度值980)：而结肠癌管由于没有Gd-DTPA-McAbs结合，信号强度较低，强度值为430。表示Gd-DTPA-McAbs仍具有良好的免疫活性。
2. 实验组
, http://www.100md.com
4只裸鼠瘤结的信号强度均有升高，表现为斑片状或不均匀强度(图1、2)，而对照组瘤体仍为中等信号。
图1 平扫T1加权像上瘤结呈中等信号。
图2 局部注射Gd-DTPA-McAbs后12h，相似切面上显示瘤体呈斑片状强化(箭头)。
讨 论
MRII借鉴于RII的技术思想，且具有分辨率高和无电离辐射的潜在优势。因为只需少量核素就可被SPECT检测到，而尽管顺磁性元素与单克隆抗体(生物大分子)结合后弛豫增强效应提高26倍[3]，但仍需要在较高浓度下，才会产生肉眼可辩的MR信号变化。为了克服MRII的敏感性低这一问题，往往需要使用大剂量的标记单克隆抗体。本文尝试改变给药途径，即由静脉注射方式改为直接瘤内注射的方式，单克隆抗体使用量(小鼠：30μg/只)可降至接近RII水平(小鼠：5～20μg/只)，并成功地观察到瘤体产生于MR信号改变。其原因主要为：从静脉方式注入的Gd-DTPA-McAbs 在体内经历了一个复杂的生物动态过程，易受到抗原-抗体交叉反应及遇吞噬细胞吞噬等多种因素干扰，因此，从血循环最终到达瘤靶的单克隆抗体数量十分有限，而局部瘤内注射方式逃避了上述复杂因素的干扰，并且使标记抗体在最佳活性条件下(进入血循环的单克隆抗体活性会有一定的下降)直接与瘤组织接触并充分结合，因而大大减少了单克隆抗体的使用剂量，提高了MRII的敏感性。当然，局部瘤内注射法不如静脉给药方式应用更加方便和广泛，但在现代医学实践中，借助影像定位技术，已能对绝大多数实体瘤进行穿刺注射，因此，小剂量Gd-DTPA-McAbs瘤内注射进行MR免疫成像，仍在一定的临床实用价值，对肝癌的早期诊断将发挥积极作用。
, 百拇医药
参考文献
1 王劲武，黄其鎏，许乙凯，等.Gd标记抗人大肠癌单克隆抗体CL-3对裸鼠肿瘤模型MRI诊断的实验研究.中华放射学杂志，1998，32(6)∶419.
2 Matsumura A,Shibata Y,Nakagawa K，et al. MRI Contrast enhancement by Gd-DTPA-Monoclonal antibody in 9 L.glioma rats.Acta Neurochir,1994,60(supp)∶356.
3 Paajanen H,Peisto T,Hemmila I，et al. Proton Relaxation Enhancement of Albumin,Immunoglobulin G and Fibrinogen labelled With Gd-DTPA.Magnetic Resonance In Medicine,1990,13∶38.
(1998-08-26 收稿), 百拇医药