成纤维细胞生长因子对关节软骨细胞转化生长因子β1作用的免疫组织化学观察
作者：徐卫东 张春才 吴岳嵩 侯铁胜 胡惠民 毛积芳 颜永碧
单位：徐卫东 张春才 吴岳嵩 侯铁胜 200433 上海,第二军医大学附属长海医院骨科；胡惠民 毛积芳 第二军医大学生物化学教研室；颜永碧 电镜中心实验室
关键词：软骨细胞,关节；转化生长因子β1；成纤维细胞生长因子
中华创伤杂志980608 【摘要】 目的 观察成纤维细胞生长因子对培养兔关节软骨细胞转化生长因子β1的表达。方法 培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,在每次换液时加入成纤维细胞生长因子100ng/ml,铺满后收集细胞,作关节软骨细胞转化生长因子β1常规及电镜免疫组织化学观察。结果 光镜下实验组细胞明显呈棕色,电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒黏附。结论 成纤维细胞生长因子能促进关节软骨细胞转化生长因子β1的表达。
Immunohistological Study of Effects of Fibroblast Growth Factor on Articular Chondrocytes of Transforming Growth Factor-β1 XU Wei-dong, ZHANG Chun-cai, WU Yue-song, et al. Dept. of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433
, 百拇医药
【Abstract】 Aim To observe the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) of the cartilage cells affected by fibroblast growth factor (FGF). Methods The articular chondrocytes of a one-month old rabbit were cultured, while FGF(100ng/ml) was put in the cell culture liquid. After growing in consistently, the chondrocytes were collected. Then the immunohistology of TGF-β1 on the cartilage cells was performed to study the interrelation and interaction of the growth factors. Results The chondrocytes treated with FGF (100ng/ml) were obviously brown, and the membrane was adhesioned by much more grains of colloid-gold under electron microscope. Conclusion It indicates that FGF can prompt the expression of TGF-β1 of the cartilage cells.
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【Key words】 Chondrocytes, articular Transforming growth factor-β1 Fibroblast growth factor
关节软骨的损伤与修复是目前骨科临床基础研究的一个重要课题。已知,关节软骨损伤后的修复是极其有限的[1]。研究表明,许多多肽生长因子在关节软骨损伤与修复中起着重要的调节作用,如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)对中胚层来源的细胞包括软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用[2]。笔者在本研究中培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,作关节软骨细胞转化生长因崐子β1(TGFβ1)免疫组织化学研究,以了解生长因子对软骨细胞作用的相互关系和调节。
材料与方法
1.材料:专用微波炉、TGFβ1抗体(美国NIH Roche教授惠赠,3.5μl抗体中和4ngTGF-β)、WAK-STP试剂盒,H-8000电镜、戊二醛、SPA-胶金、Epon812包埋剂。FGF由第二军医大学基础部生化教研室姜关祥、胡惠民教授等按照Gospodarowicz方法[3]从牛脑中提取、纯化,为混合性。
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2.免疫组化ABC法:关节软骨细胞经原代培养铺满后,吸除培养液,用0.25%胰蛋白酶与0.01%EDTA1∶2消化1分钟,离心1 000r/min,5分钟后收集细胞,用PBS洗涤2次,再以微量PBS重悬细胞后,作细胞涂片,用4%多聚甲醛固定20分钟,PBS洗3×3分钟,吹干后加血清,10分钟。加一抗微波处理50秒,放置10分钟,再用PBS洗3×3分钟;二抗微波处理50秒,放置5分钟,PBS洗3×3分钟,HRP标记卵白素微波处理50秒,放置5分钟。DAB30ml+0.3%双氧水50μl显色10分钟,蒸馏水稍洗后,用苏木素衬染1分钟,脱水,透明,封片,镜检。
3.SPA-胶金标记免疫电镜研究[4]:同上收集关节软骨细胞,PBS漂洗后用1.25%戊二醛微波固定5～20秒,漂洗后用TGFβ1抗体振荡孵育60分钟,35℃,PBS漂洗后用SPA-胶金振荡孵育60分钟,35℃,PBS洗后再用2%戊二醛固定30～60分钟,即可用血浆将标本凝成块状。上述标本在凝成块状之前均离心,凝成块后按常规电镜标本制备方法,Epon812包埋,超薄切片用醋酸铀、枸橼酸铅染色后即可在电镜下观察。
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结 果
1.将FGF100ng/ml换液时加入细胞培养液,每培养48小时换液一次。免疫组化研究显示细胞明显呈棕色,而对照组则棕色不明显或呈阴性(图1,2)。
图1 用FGF10ng/ml作用于培养细胞,免疫组织化学显示
实验组细胞呈明显棕色 ×3.3×100×2.5
图2 对照组细胞无明显棕色显示 ×3.3×100×2.5
2.将FGF100ng/ml换液时加入细胞培养液,免疫电镜显示细胞膜外表面有明显胶金颗粒黏附,而对照组则较少(图3,4,其中A及B分别为高倍和低倍电镜所示)。
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图3 用FGF100ng/ml作用于培养细胞,免疫组织化学电镜显示实验组细胞膜
表面有明显的胶金颗粒黏附(A为高倍×60 000×2.5,B为低倍×10 000×2.5
图4 对照组细胞膜表面胶金颗粒很少(A为高倍×60 000×2.5,B为低倍×10 000×2.5)
讨 论
1.笔者将FGF作用于培养兔关节软骨细胞,作链酶素-亲和素放大系统ABC免疫组化研究。结果显示实验组细胞呈明显棕色,而对照组棕色不明显或为阴性。同时,笔者作了免疫胶体金标记组化方法,进一步明确软骨细胞TGFβ的定位。免疫胶金标记技术较免疫荧光、免疫胶酶标等技术有更大的优越性,它能在超微结构水平上精确、细致地定位,特异性强,因此在一些研究工作和某些疾病的鉴别诊断中越来越受到重视。在免疫染色时,还结合微波固定,使固定液在极短的时间内穿透到标本内部,使微细结构保存良好。同时,由于固定时间短,固定液对抗原的破坏作用从而减少,故标记物阳性率高。本研究结果显示,FGF作用于培养兔关节软骨细胞后,细胞膜表面的绒毛上有明显的胶金标记,而对照组则很少。从上述免疫组化研究可见,FGF能促进兔关节软骨细胞TGFβ的合成。
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2.研究认为,FGF是关节软骨细胞最明显的有丝分裂刺激原和形态原之一[5],它对中胚层来源的细胞包括软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用。在骨的基质中大量存在FGF。对培养的软骨细胞,当局部不加FGF时,关节软骨细胞迅速表现为透明、肥大、钙化,或分化成为成纤维细胞,失去软骨表现型,合成硫酸软肌素、Ⅱ型胶原的能力大大降低。而加入FGF后,能保持软骨表现型,并且在细胞生长融合时,软骨细胞被基质包围,如同体内软骨组织一样。Kato等认为,当软骨细胞生长、分裂活跃时,只有存在FGF才能保存和维持软骨细胞表现型,甚至将一些已成熟或转化为成纤维细胞的细胞反分化为软骨细胞。
3.一般认为,TGFβ对于未分化的细胞,是一种促分化生长因子,诱导间质细胞转化为软骨细胞[6],能促进软骨细胞的复制,但对于比较成熟的软骨细胞,则抑制其分化和增殖。从骨组织中分离出的TGF-β1、β2都可以诱导间充质细胞表达软骨表现型。TGFβ抑制培养中兔关节软骨细胞的终末分化及钙化[7]。
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4.本研究中,实验组细胞明显呈棕色,细胞表面有明显的胶金颗粒黏附,提示成纤维细胞生长因子能促进关节软骨细胞转化生长因子β1的表达,诱导间质细胞分化成为软骨细胞,促进细胞增殖、基质合成,同时抑制细胞成熟。
5.在关节软骨中存在多种生长因子,它们对关节软骨的生长代谢的调节并不是单一的,而是存在相互促进、相互抑制的内在平衡机制。只有对其进一步研究,才能揭示生长因子对关节软骨损伤修复的调节机制。
参考文献
[1]William Hunter. Of the structure and disease of articulating cartilages. Clin Orthop, 1995, 11∶3-6.
[2]Pierre AG, Arthur S, Martin L. Growth factor responsiveness of human articular chondrocytes: Distinct profiles in primary chondrocytes, subcultured chondrocytes and fibroblasts. J Cell Physical, 1994, 158∶476-484.
, 百拇医药
[3]Villiger PM, Lotz M. Differential expression of TGF beta isoforms by human articular chondrocytes in response to growth factors. J Cell Physical, 1992, 15∶318-325.
[4]颜永碧.游离细胞表面抗原的免疫金标记技术(结合微波固定).解剖学杂志, 1992, 15∶471-472.
[5]Villiger PM, Lotz M. Expression of prepro-enkephalin in human articular chondrocytes is linked to cell proliferation. EMBO J, 1992, 11∶135-143.
[6]Conell CN, Lane J. Newest factors in fracture healing. Clin Orthop Res, 1992, 277∶297-311.
[7]ukio Kato, Masahiro Iwamoto. Fibroblast growth factor is an inhibitor of chondrocyte terminal differentiation. J Biological Chemistry, 1990, 265∶5903-5909.
(收稿:1998-02-18 修回:1998-07-26), 百拇医药
单位：徐卫东 张春才 吴岳嵩 侯铁胜 200433 上海,第二军医大学附属长海医院骨科；胡惠民 毛积芳 第二军医大学生物化学教研室；颜永碧 电镜中心实验室
关键词：软骨细胞,关节；转化生长因子β1；成纤维细胞生长因子
中华创伤杂志980608 【摘要】 目的 观察成纤维细胞生长因子对培养兔关节软骨细胞转化生长因子β1的表达。方法 培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,在每次换液时加入成纤维细胞生长因子100ng/ml,铺满后收集细胞,作关节软骨细胞转化生长因子β1常规及电镜免疫组织化学观察。结果 光镜下实验组细胞明显呈棕色,电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒黏附。结论 成纤维细胞生长因子能促进关节软骨细胞转化生长因子β1的表达。
Immunohistological Study of Effects of Fibroblast Growth Factor on Articular Chondrocytes of Transforming Growth Factor-β1 XU Wei-dong, ZHANG Chun-cai, WU Yue-song, et al. Dept. of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433
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【Abstract】 Aim To observe the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) of the cartilage cells affected by fibroblast growth factor (FGF). Methods The articular chondrocytes of a one-month old rabbit were cultured, while FGF(100ng/ml) was put in the cell culture liquid. After growing in consistently, the chondrocytes were collected. Then the immunohistology of TGF-β1 on the cartilage cells was performed to study the interrelation and interaction of the growth factors. Results The chondrocytes treated with FGF (100ng/ml) were obviously brown, and the membrane was adhesioned by much more grains of colloid-gold under electron microscope. Conclusion It indicates that FGF can prompt the expression of TGF-β1 of the cartilage cells.
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【Key words】 Chondrocytes, articular Transforming growth factor-β1 Fibroblast growth factor
关节软骨的损伤与修复是目前骨科临床基础研究的一个重要课题。已知,关节软骨损伤后的修复是极其有限的[1]。研究表明,许多多肽生长因子在关节软骨损伤与修复中起着重要的调节作用,如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)对中胚层来源的细胞包括软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用[2]。笔者在本研究中培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,作关节软骨细胞转化生长因崐子β1(TGFβ1)免疫组织化学研究,以了解生长因子对软骨细胞作用的相互关系和调节。
材料与方法
1.材料:专用微波炉、TGFβ1抗体(美国NIH Roche教授惠赠,3.5μl抗体中和4ngTGF-β)、WAK-STP试剂盒,H-8000电镜、戊二醛、SPA-胶金、Epon812包埋剂。FGF由第二军医大学基础部生化教研室姜关祥、胡惠民教授等按照Gospodarowicz方法[3]从牛脑中提取、纯化,为混合性。
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2.免疫组化ABC法:关节软骨细胞经原代培养铺满后,吸除培养液,用0.25%胰蛋白酶与0.01%EDTA1∶2消化1分钟,离心1 000r/min,5分钟后收集细胞,用PBS洗涤2次,再以微量PBS重悬细胞后,作细胞涂片,用4%多聚甲醛固定20分钟,PBS洗3×3分钟,吹干后加血清,10分钟。加一抗微波处理50秒,放置10分钟,再用PBS洗3×3分钟;二抗微波处理50秒,放置5分钟,PBS洗3×3分钟,HRP标记卵白素微波处理50秒,放置5分钟。DAB30ml+0.3%双氧水50μl显色10分钟,蒸馏水稍洗后,用苏木素衬染1分钟,脱水,透明,封片,镜检。
3.SPA-胶金标记免疫电镜研究[4]:同上收集关节软骨细胞,PBS漂洗后用1.25%戊二醛微波固定5～20秒,漂洗后用TGFβ1抗体振荡孵育60分钟,35℃,PBS漂洗后用SPA-胶金振荡孵育60分钟,35℃,PBS洗后再用2%戊二醛固定30～60分钟,即可用血浆将标本凝成块状。上述标本在凝成块状之前均离心,凝成块后按常规电镜标本制备方法,Epon812包埋,超薄切片用醋酸铀、枸橼酸铅染色后即可在电镜下观察。
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结 果
1.将FGF100ng/ml换液时加入细胞培养液,每培养48小时换液一次。免疫组化研究显示细胞明显呈棕色,而对照组则棕色不明显或呈阴性(图1,2)。
图1 用FGF10ng/ml作用于培养细胞,免疫组织化学显示
实验组细胞呈明显棕色 ×3.3×100×2.5
图2 对照组细胞无明显棕色显示 ×3.3×100×2.5
2.将FGF100ng/ml换液时加入细胞培养液,免疫电镜显示细胞膜外表面有明显胶金颗粒黏附,而对照组则较少(图3,4,其中A及B分别为高倍和低倍电镜所示)。
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图3 用FGF100ng/ml作用于培养细胞,免疫组织化学电镜显示实验组细胞膜
表面有明显的胶金颗粒黏附(A为高倍×60 000×2.5,B为低倍×10 000×2.5
图4 对照组细胞膜表面胶金颗粒很少(A为高倍×60 000×2.5,B为低倍×10 000×2.5)
讨 论
1.笔者将FGF作用于培养兔关节软骨细胞,作链酶素-亲和素放大系统ABC免疫组化研究。结果显示实验组细胞呈明显棕色,而对照组棕色不明显或为阴性。同时,笔者作了免疫胶体金标记组化方法,进一步明确软骨细胞TGFβ的定位。免疫胶金标记技术较免疫荧光、免疫胶酶标等技术有更大的优越性,它能在超微结构水平上精确、细致地定位,特异性强,因此在一些研究工作和某些疾病的鉴别诊断中越来越受到重视。在免疫染色时,还结合微波固定,使固定液在极短的时间内穿透到标本内部,使微细结构保存良好。同时,由于固定时间短,固定液对抗原的破坏作用从而减少,故标记物阳性率高。本研究结果显示,FGF作用于培养兔关节软骨细胞后,细胞膜表面的绒毛上有明显的胶金标记,而对照组则很少。从上述免疫组化研究可见,FGF能促进兔关节软骨细胞TGFβ的合成。
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2.研究认为,FGF是关节软骨细胞最明显的有丝分裂刺激原和形态原之一[5],它对中胚层来源的细胞包括软骨细胞具有明显的促有丝分裂作用。在骨的基质中大量存在FGF。对培养的软骨细胞,当局部不加FGF时,关节软骨细胞迅速表现为透明、肥大、钙化,或分化成为成纤维细胞,失去软骨表现型,合成硫酸软肌素、Ⅱ型胶原的能力大大降低。而加入FGF后,能保持软骨表现型,并且在细胞生长融合时,软骨细胞被基质包围,如同体内软骨组织一样。Kato等认为,当软骨细胞生长、分裂活跃时,只有存在FGF才能保存和维持软骨细胞表现型,甚至将一些已成熟或转化为成纤维细胞的细胞反分化为软骨细胞。
3.一般认为,TGFβ对于未分化的细胞,是一种促分化生长因子,诱导间质细胞转化为软骨细胞[6],能促进软骨细胞的复制,但对于比较成熟的软骨细胞,则抑制其分化和增殖。从骨组织中分离出的TGF-β1、β2都可以诱导间充质细胞表达软骨表现型。TGFβ抑制培养中兔关节软骨细胞的终末分化及钙化[7]。
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4.本研究中,实验组细胞明显呈棕色,细胞表面有明显的胶金颗粒黏附,提示成纤维细胞生长因子能促进关节软骨细胞转化生长因子β1的表达,诱导间质细胞分化成为软骨细胞,促进细胞增殖、基质合成,同时抑制细胞成熟。
5.在关节软骨中存在多种生长因子,它们对关节软骨的生长代谢的调节并不是单一的,而是存在相互促进、相互抑制的内在平衡机制。只有对其进一步研究,才能揭示生长因子对关节软骨损伤修复的调节机制。
参考文献
[1]William Hunter. Of the structure and disease of articulating cartilages. Clin Orthop, 1995, 11∶3-6.
[2]Pierre AG, Arthur S, Martin L. Growth factor responsiveness of human articular chondrocytes: Distinct profiles in primary chondrocytes, subcultured chondrocytes and fibroblasts. J Cell Physical, 1994, 158∶476-484.
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[3]Villiger PM, Lotz M. Differential expression of TGF beta isoforms by human articular chondrocytes in response to growth factors. J Cell Physical, 1992, 15∶318-325.
[4]颜永碧.游离细胞表面抗原的免疫金标记技术(结合微波固定).解剖学杂志, 1992, 15∶471-472.
[5]Villiger PM, Lotz M. Expression of prepro-enkephalin in human articular chondrocytes is linked to cell proliferation. EMBO J, 1992, 11∶135-143.
[6]Conell CN, Lane J. Newest factors in fracture healing. Clin Orthop Res, 1992, 277∶297-311.
[7]ukio Kato, Masahiro Iwamoto. Fibroblast growth factor is an inhibitor of chondrocyte terminal differentiation. J Biological Chemistry, 1990, 265∶5903-5909.
(收稿:1998-02-18 修回:1998-07-26), 百拇医药