非综合征性耳聋患者连接蛋白26基因突变的研究
作者：肖自安 冯永 潘乾 谢鼎华 施小六 夏家辉
单位：肖自安 谢鼎华(410011 长沙 湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科听力研究室)；冯永(湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉科)；潘乾 夏家辉(湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；施小六(湖南医科大学附属第二医院消化内科)
关键词：连接蛋白类；基因；突变；聋；遗传性疾病
中华耳鼻咽喉科杂志000308 【摘要】 目的 探讨中国人非综合征性耳聋患者连接蛋白26(connexin 26, Cx26)基因突变频率和特性。方法 收集中国散发先天性聋哑儿童16例，常染色体隐性遗传性聋39例(39个家系)，10岁前开始听力下降的常染色体显性遗传性聋30例(30个家系)和健康对照组100例。聚合酶链反应-单链构象多态(single strand conformational polymorphism analysis of polymerase chain reaction, PCR-SSCP)分析初筛可疑突变者，SSCP分析发现异常构象带后再行DNA测序。结果 健康对照组中15例发现5种多态性改变，耳聋患者中10例发现6种多态性改变。散发先天性聋哑和常染色体隐性遗传非综合征性耳聋中未发现致病突变。1个常染色体显性遗传性聋家系发现所有患者(3例)Cx26基因的编码区299-300位碱基AT杂合性缺失，导致移码突变，翻译的蛋白质截短，该家系听力正常者无此突变。结论 蒙古人种中常染色体隐性遗传性非综合征性耳聋的Cx26基因突变率可能低于其他人种。Cx26基因编码区299-300位碱基AT杂合性缺失可致常染色体显性遗传性聋DFNA3型。
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Mutations in the connexin 26 gene in patients with nonsyndromic hearing impairment
XIAO Zian，FENG Yong，PAN Qian
(Department of Otolaryngology & Hearing Research Laboratory, Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011, China)
【Abstract】 Objective To determine the prevalence and characteristics of deafness-causing mutations in Connexin 26(Cx26,GJB2) gene in Chinese with nonsyndromic hearing impairment(NSHI). Methods Study subjects are all Chinese including 16 infants with sporadic congenital deaf-mutism, 39 patients with autosomal recessive hereditary hearing loss, 30 patients with autosomal dominant hereditary hearing loss and 100 normal adults. The subjects were screened for base variations by single-strand conformational polymorphism (SSCP) analysis of the amplified products of polymerase chain reaction (PCR). Those who were found have abnormal conformational band were sequenced. Results Five kinds of polymorphism were found in 15 cases of controls and six kinds of polymorphism in 10 patients. No mutation was found in Cx26 gene in Chinese with autosomal recessive NSHI. Heterozygous deletion AT at position 299-300 of Cx26 cDNA, which results in premature chain termination, was found in a pedigree with autosomal dominant hereditary nonsyndromic hearing loss. Conclusion The prevalence of deafness-causing mutations in Cx26 gene in Chinese with autosomal recessive NSHI maybe is lower than that of other ethnic groups. Heterozygous deletion AT at position 299-300 of Cx26 cDNA can lead to autosomal dominant hereditary hearing loss (DFNA3).
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【Key words】 Connexins； Genes； Mutation； Deafness； Hereditary
遗传性聋分为综合征性耳聋(syndromic hearing impairment, SHI)和非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment, NSHI)，有常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁和线粒体突变母系遗传4种遗传方式。在新生儿中的发病率约为1/2 000，语前遗传性聋绝大部分属于NSHI，其中75%～80%为常染色体隐性遗传，20%～25%为常染色体显性遗传，1%～1.5%为X-连锁遗传；语后遗传性聋基本上属于常染色体显性遗传NSHI[1]。Cx26(GJB2) 基因1993年被克隆，定位于13q11-12，互补DNA (complementary DNA，cDNA)全长2311 bp，编码区678 bp。1997年发现Cx26突变与常染色体显性遗传性聋DFNA3(OMIM 601544)和常染色体隐性遗传性聋DFNB1(OMIM 220290)有关[2]。遗传性疾病基因诊断时需辨别DNA分子碱基改变是多态性(polymorphism)还是致病突变(mutation)。多态性是指人群中个体的DNA分子某些位点碱基发生了改变，但不改变基因的表达性状和功能，在单基因遗传病家系中，这种碱基改变在后代中不与遗传性状共伴随。当DNA分子中碱基的改变使基因的表达性状和功能发生变化，在单基因遗传病家系中，这种碱基改变在后代中与遗传性状共同出现(称为共分离，co-segregate),则称为突变或致病突变(disease-causing mutation)。为评价中国非综合征性耳聋患者的Cx26基因突变频率和特性，我们对16例散发先天性聋哑儿童、39例常染色体隐性遗传性聋、30例常染色体显性遗传性聋患者进行了Cx26基因突变检测，现将结果报告如下。
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对象与方法
一、对象
1.病例选择：全部对象为中国人。耳聋分级：语言频率平均听阈10～30 dB nHL，为轻度聋；30～60 dB nHL，为中度聋；60～ 90 dB nHL，为重度聋；90～120 dB nHL,为深度聋；大于120 dB nHL为全聋。选择以下3类耳聋患者：①散发先天性聋哑儿童16例，年龄1～10岁，其中男10例，女6例；听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)测试示130 dB peSPL刺激13例无诱发反应，3例可诱发出Ⅲ波和Ⅴ波；②常染色体隐性遗传感音神经性聋(家系中至少2例同类耳聋患者)39个家系中的先症者39例(男22例，女17例)，年龄1.5～30岁；重度聋19例，深度聋17例，全聋3例；③常染色体显性遗传性聋均按DFNA3的临床表型[3]选择10岁前开始听力下降的感音神经性聋患者，30个家系中的先症者30例(男17例，女13例)，年龄6～34岁；中度聋14例，重度聋11例，深度聋4例，全聋1例。所有研究对象行纯音测听或ABR检查听力水平，耳科学检查排除其它致聋因素，如中耳炎、耳外伤、药物中毒性聋和梅尼埃病，并检查全身情况排除综合征性耳聋。抽外周静脉血10 ml，肝素抗凝无菌保存，72 h内抽提基因组DNA。在耳聋家系中，首先选择先症者筛查Cx26基因的碱基改变。
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2.对照组：从医学遗传学国家重点实验室DNA库中随机挑选健康中国成人100例的人基因组DNA (gDNA)为对照组,年龄18～60岁,男70例,女30例,均接受听力、甲状腺、心、肺、肝、肾和神经系统检查。
二、方法
1.DNA制备：用酚-氯仿法抽提基因组DNA。DNA溶于三氨基甲烷-乙二胺四乙酸中，取适量用紫外分光光度计进行定量和纯度检测，其余于-70℃保存备用。
2.引物设计与合成：Cx26有2个外显子，编码区在第二外显子内，用Design PCR 软件设计包括编码区的3对引物，Cx26-1U/1L：5 ′tcttttccagagcaaaccgcc 3′/5 ′agatggggaagtagtgatcgta3 ′，退火温度 62 ℃，扩增片段长度246 bp；Cx26-2U/2L：5′ggctgcaagaacgtgtgctac3 ′/ 5 ′tacatgacatagaagacgtac3 ′，退火温度58 ℃ ，扩增片段长度299 bp；Cx26-3U / 3L: 5 ′caagcagcatcttcttccgggt3 ′/ 5 ′gggcaatgcgttaaactggc3 ′，退火温度58 ℃，扩增片段长度282 bp；在Beckman Oligo1000 DNA合成器中合成。这3对引物的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增产物覆盖了Cx26基因的全部编码区，可用于分析编码区内所有的碱基改变。
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3.PCR扩增：通过PCR反应扩增待分析DNA靶序列的量。反应体系为20 μL，含1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2 ，160 μmol dNTPs (MBI公司，美国)，正反向引物各60 ng，Tag酶2 U(ABI公司，美国)，gDNA 100 ng。PCR反应在PE9600热循环仪上完成，反应条件为：96 ℃预变性2 min，95℃变性10 s，复性20 s，72 ℃延伸45 s，32个循环，反应终止后再72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。耳聋组每次设健康人gDNA为阳性对照和空白对照。取5 μL PCR产物行6%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳检测产物的量和特异性，二者均满意者进行单链构象多态性(single strand conformational polymorphism analysis，SSCP)分析。
4.SSCP分析： PCR产物加等体积2×甲酰胺变性载样缓冲液，98 ℃变性10 min立即置冰上聚冷，上样于8%的SSCP胶(含5%的甘油，49∶1聚丙烯酰胺)，恒电压300 V的4 ℃水循环恒温电泳约20 h。 剥胶银染，在GS700光密度扫描仪(Bio-Rad 公司，美国)上记录并打印扫描结果。PCR产物变性后单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单个碱基置换、或数个碱基插入或缺失等改变时迁移率变化，可区分变异DNA和非变异DNA，变异DNA电泳带称为异常构象带。发现异常构象带者再行DNA测序。
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5.DNA测序：为证实SSCP分析所发现的异常构象带序列的碱基改变，对发现异常构象带者进一步行Cx26基因的DNA测序。引物1U和3L的扩增产物包含Cx26基因cDNA编码区全长，Cx26-1U和Cx26-3L分别作为正向和反向引物，用于扩增测序模板。捣碎浸泡法回收模板DNA，纯化，用ABI prism bigdye terminator cycle sequencing kit在 ABI 377 自动测序仪上以扩增模板的引物正反向测序。测序结果通过GCG(genetic computer group)软件进行分析。
结果
1. PCR-SSCP分析：分别发现对照组15例(15/100)、散发先天性聋哑患儿2例(2/16)、常染色体隐性遗传家系的先症者6例(6/39)、常染色体显性遗传家系的先症者3例(3/30)有异常构象带。在先症者发现异常构象带的家系中，进一步对全家系行PCR-SSCP分析，在1例常染色体显性遗传性聋家系中，先症者患耳聋的弟弟和儿子有与先证者相同的异常构象带，听力正常的父亲和配偶未见异常构象带，即该家系中Cx26基因异常构象带与耳聋共分离(图1)；其他家系未发现这种共分离现象。
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M:分子标准, A:II1，B:II3，C:III1，D:I1，E:II2，F和G:正常对照
图1 Cx26突变的常染色体显性遗传性聋患者家系图(a)和SSCP胶图(b)
2.DNA测序：对照组15例异常构象带者测序证实均为多态性改变，耳聋组中散发先天性聋哑2例、常染色体隐性遗传家系6例和常染色体显性遗传家系2例为多态性改变(表1)。只有异常构象带与耳聋共分离的这一常染色体显性遗传家系中，所有耳聋患者测序证实Cx26基因编码区299-300位碱基杂合性缺失AT(图2，野生型与突变型Cx26基因测序图)，导致移码突变，从100号密码子开始产生13个新的氨基酸，113号密码子处出现终止密码子。
表1 对照组和耳聋组中Cx26基因多态性
改变和突变的例数 碱基改变
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氨基酸改变
对照组
耳聋组
G79A
Val 27 Ile
7
3
G109A
Val 37 Ile
1
2
G341A
Glu 114 Gly
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1
2
G79A，G109A
Val 27 Ile，Val 37 Ile
4
G79A，G341A
Val 27 Ile，Glu 114 Gly
2
G442A
Val 148 Ile
1
G506A
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Cys 167 Tyr
1
T608C
Lle 203 Thr
1
299-300delAT
移码突变
3*
*为同一个常染色体显形遗传家系中的耳聋患者讨论
Cx26属于间隙连接蛋白基因，该基因家族编码的间隙连接蛋白属于膜蛋白，与相邻细胞的间隙连接蛋白组成一个完整的间隙连接通道。这些通道是细胞间电解质、第二信使和代谢物质的重要通路，在信息传递和物质交换中起重要作用。每一种间隙连接蛋白和相应的间隙连接通道都具有组织特异性和不同的生理功能。已证实间隙连接基因家族中Cx26、Cx30和 Cx31突变可引起NSHI[2，4，5]。Cx26蛋白4次跨膜，共分5个区：N端区、跨膜区(M1，M2，M3，M4)、细胞外区(E1，E2)、胞浆内连接区(CL)和C端区。N端区和跨膜区M1的细胞内侧端构成充当电压感受器的电荷复合体，细胞外区E1和E2决定间隙连接通道与其他Cx蛋白的相容性，胞内连接区和C端区与间隙连接通道pH值的门控有关[6]。免疫组化证实，内耳非感觉上皮细胞和组织连接细胞表达Cx26蛋白。在声音传导过程中，Cx26蛋白对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调控作用，Cx26基因突变后，K+进入内淋巴液的循环受影响，导致感音神经性聋[7]。
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在欧美等地区高加索人中，Cx26 基因突变占儿童语前聋的20%，占常染色体隐性遗传性聋的40%[8, 9]。在DFNB1中，已发现Cx26 基因25 种突变型(The connexin-deafness homepage: http://www.iro.es/cx26deaf. html)，其中错义突变15种、小缺失突变6种(缺失1～14个碱基)、小插入突变3种(插入1个碱基)和大缺失突变1种(缺失38个碱基)。在高加索人群，特别是在地中海地区DFNB1的突变患者中，编码区30～35(GGGGGG)缺失一个G(命名为30delG或35delG)者约占60%～85 %[8]。在本组39例常染色体隐性遗传性聋家系的先症者中有6例、16例散发先天性聋哑儿童中有2例，检测出Cx26基因6种多态性改变，未发现致病突变。Kudo等[10]在日本人中发现Cx26基因突变率也明显低于其他种族。中国人的绝大多数和日本人都属蒙古人种，因此，我们估计，蒙古人种常染色体隐性遗传NSHI的Cx26突变率可能低于其他人种。对此，我们将收集病例继续进行研究。
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在DFNA3中，已报道Cx26基因4种突变：34 T→C( Met 12 Thr), 71 G→A(Trp 24 Term)，132 G→C (Trp 44 Cys)，223 C→T (Arg 75 Trp)。我们在30个常染色体显性遗传性聋家系中，发现2个家系的先症者Cx26基因呈多态性改变，另1个家系所有患者有Cx26基因cDNA编码区299-300位点AT杂合性缺失，在此家系中，这一突变与耳聋共分离，可以确定属于致病突变。此型突变导致Cx26基因从100号密码子后编码13个新的氨基酸，终止密码子提前至113号，翻译的多肽只有112个氨基酸，比野生型蛋白的226个氨基酸截短了114个，且只有前99个氨基酸与野生型相同。这种突变型Cx26多肽的CL区大部分缺失，M3、E2和M4区完全缺失。推测此突变型蛋白可能丧失对间隙连接通道pH值的调控，降低间隙连接对异型蛋白的辨别能力。在国际互联网上查询，我们发现Usami在1999年2月美国耳鼻咽喉科研究年会(Association for Research in Otolaryngology，ARO)上公布了这一相同的突变，但未说明是在何种遗传类型的耳聋中检测出了此种突变。我们发现Cx26基因突变的这一家系中，先证者从小为非进行性双耳听力障碍，纯音测听示中度感音神经性聋；先证者弟弟为先天性聋哑，ABR证实为双耳深度感音神经性聋；先证者儿子症状与先证者相同，ABR证实为中度感音神经性聋。这一家系的症状与DFNA3的表型相符。因此，我们认为Cx26基因的299-300位点碱基AT杂合性缺失可导致常染色体显性遗传性聋DFNA3，但这一突变点是否为中国DFNA3人群的突变热点，尚有待进一步证实。
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同时，我们在正常对照组和耳聋组都发现了较高的Cx26多态性改变，其中341A→G(Glu 114 Gly)多态性改变在遗传性聋网站Cx26主页上未见公布，442G→A(Val148Ile)、506G→A(Cys167Tyr)、608T→C(Lle205Thr)3种多态性改变虽在我们的对照组中未发现，但国外学者已有这些相同多态性改变的报道在因特网上公布。多态性改变属于正常现象，绝大部分基因的多态性改变在1%左右，Cx26基因的多态性明显高于绝大部分基因。要区分DNA分子碱基改变是正常的多态性还是致病突变，除需在正常人群中大规模筛查和对碱基改变后的基因功能进行分析外，还可根据单基因遗传病家系进行分析，如果碱基改变在家系中与遗传性疾病共同出现(共分离)，则为致病突变；反之，属于多态性改变。由于Cx26基因存在非常高的多态性现象，因此，对耳聋作Cx26基因诊断时，应特别注意辨别是多态性改变还是致病突变。临床开展Cx26基因诊断时，可以在因特网上的“The connexin-deafness homepage”查询，该主页上列有已发现的各种致病突变和多态性改变。
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图1 常染色体显性遗传性聋家系和健康人Cx26基因反向引物测序图(Cx26-3L )。A 常染色体显性遗传性聋家系测
序图，箭头所指为杂合性缺失突变起始位点；B 健康人 Cx26 基因测序图
志谢 本研究全部实验在湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室完成
基金项目：国家863和国家973项目经费及国家自然科学基金(编号：39980040)
通信作者：夏家辉(Email：nlmglcy@public.cs.hn.cn)
参考文献
1，Van Camp G, Willems PJ, Smith RJ. Nonsyndromic hereing impairment: unparalleled heterogeneity. Am J Hum Genet, 1997, 60：758-764.
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2，Kelsell DP,Dunlop J,Stevens HP, et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature, 1997, 387：80-83.
3，Denoyelle F, Lina-Granade G, Plauchu H, et al. Connexin 26 gene linked to a dominant deafness. Nature， 1998, 393: 319-320.
4，Grifa A, Wagner CA, D′Ambrosio L, et al. Mutations in GJB6 cause nonsyndromic autosomal dominant deafness at DFNA3 locus. Nat Genet,1999,23:16-18.
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5，Xia JH, Liu CY, Tang BS, et al. Mutations in the gene encoding gap junction protein β-3 associated with autosomal dominant hearing impairment. Nat Genet, 1998, 20：370-373.
6，Bruzzone R, White TW, Paul DL. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur J Biochem, 1996, 238：1-27.
7，Forge A, Becker D, Casalotti S, et al. Gap junctions and connexin expression in the inner ear. Novartis Found Symp, 1999, 219： 134-150.
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8，Zelante L, Gasparini P, Estivill X, et al. Connexin 26 mutations associated with the most common form of nonsyndromic nuerosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans. Hum Mol Genet, 1997, 6: 1605-1609.
9，Green GE, Scott DA, McDonald JM, et al. Carrier rates in the midwestern United States for GJB2 mutations causing inherited deafness. JAMA, 1999, 281:2211-2216.
10，Kudo T, Kure S, Matsubara Y, et al. Identification of a novel common mutation in the connexin 26 gene (GJB2) among Japanese patients with childhood deafness. Am J Hum Genet, 1999，Suppl：A840.
(收稿日期：1999-12-02), 百拇医药
单位：肖自安 谢鼎华(410011 长沙 湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科听力研究室)；冯永(湖南医科大学湘雅医院耳鼻咽喉科)；潘乾 夏家辉(湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室)；施小六(湖南医科大学附属第二医院消化内科)
关键词：连接蛋白类；基因；突变；聋；遗传性疾病
中华耳鼻咽喉科杂志000308 【摘要】 目的 探讨中国人非综合征性耳聋患者连接蛋白26(connexin 26, Cx26)基因突变频率和特性。方法 收集中国散发先天性聋哑儿童16例，常染色体隐性遗传性聋39例(39个家系)，10岁前开始听力下降的常染色体显性遗传性聋30例(30个家系)和健康对照组100例。聚合酶链反应-单链构象多态(single strand conformational polymorphism analysis of polymerase chain reaction, PCR-SSCP)分析初筛可疑突变者，SSCP分析发现异常构象带后再行DNA测序。结果 健康对照组中15例发现5种多态性改变，耳聋患者中10例发现6种多态性改变。散发先天性聋哑和常染色体隐性遗传非综合征性耳聋中未发现致病突变。1个常染色体显性遗传性聋家系发现所有患者(3例)Cx26基因的编码区299-300位碱基AT杂合性缺失，导致移码突变，翻译的蛋白质截短，该家系听力正常者无此突变。结论 蒙古人种中常染色体隐性遗传性非综合征性耳聋的Cx26基因突变率可能低于其他人种。Cx26基因编码区299-300位碱基AT杂合性缺失可致常染色体显性遗传性聋DFNA3型。
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Mutations in the connexin 26 gene in patients with nonsyndromic hearing impairment
XIAO Zian，FENG Yong，PAN Qian
(Department of Otolaryngology & Hearing Research Laboratory, Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011, China)
【Abstract】 Objective To determine the prevalence and characteristics of deafness-causing mutations in Connexin 26(Cx26,GJB2) gene in Chinese with nonsyndromic hearing impairment(NSHI). Methods Study subjects are all Chinese including 16 infants with sporadic congenital deaf-mutism, 39 patients with autosomal recessive hereditary hearing loss, 30 patients with autosomal dominant hereditary hearing loss and 100 normal adults. The subjects were screened for base variations by single-strand conformational polymorphism (SSCP) analysis of the amplified products of polymerase chain reaction (PCR). Those who were found have abnormal conformational band were sequenced. Results Five kinds of polymorphism were found in 15 cases of controls and six kinds of polymorphism in 10 patients. No mutation was found in Cx26 gene in Chinese with autosomal recessive NSHI. Heterozygous deletion AT at position 299-300 of Cx26 cDNA, which results in premature chain termination, was found in a pedigree with autosomal dominant hereditary nonsyndromic hearing loss. Conclusion The prevalence of deafness-causing mutations in Cx26 gene in Chinese with autosomal recessive NSHI maybe is lower than that of other ethnic groups. Heterozygous deletion AT at position 299-300 of Cx26 cDNA can lead to autosomal dominant hereditary hearing loss (DFNA3).
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【Key words】 Connexins； Genes； Mutation； Deafness； Hereditary
遗传性聋分为综合征性耳聋(syndromic hearing impairment, SHI)和非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment, NSHI)，有常染色体显性、常染色体隐性、X-连锁和线粒体突变母系遗传4种遗传方式。在新生儿中的发病率约为1/2 000，语前遗传性聋绝大部分属于NSHI，其中75%～80%为常染色体隐性遗传，20%～25%为常染色体显性遗传，1%～1.5%为X-连锁遗传；语后遗传性聋基本上属于常染色体显性遗传NSHI[1]。Cx26(GJB2) 基因1993年被克隆，定位于13q11-12，互补DNA (complementary DNA，cDNA)全长2311 bp，编码区678 bp。1997年发现Cx26突变与常染色体显性遗传性聋DFNA3(OMIM 601544)和常染色体隐性遗传性聋DFNB1(OMIM 220290)有关[2]。遗传性疾病基因诊断时需辨别DNA分子碱基改变是多态性(polymorphism)还是致病突变(mutation)。多态性是指人群中个体的DNA分子某些位点碱基发生了改变，但不改变基因的表达性状和功能，在单基因遗传病家系中，这种碱基改变在后代中不与遗传性状共伴随。当DNA分子中碱基的改变使基因的表达性状和功能发生变化，在单基因遗传病家系中，这种碱基改变在后代中与遗传性状共同出现(称为共分离，co-segregate),则称为突变或致病突变(disease-causing mutation)。为评价中国非综合征性耳聋患者的Cx26基因突变频率和特性，我们对16例散发先天性聋哑儿童、39例常染色体隐性遗传性聋、30例常染色体显性遗传性聋患者进行了Cx26基因突变检测，现将结果报告如下。
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对象与方法
一、对象
1.病例选择：全部对象为中国人。耳聋分级：语言频率平均听阈10～30 dB nHL，为轻度聋；30～60 dB nHL，为中度聋；60～ 90 dB nHL，为重度聋；90～120 dB nHL,为深度聋；大于120 dB nHL为全聋。选择以下3类耳聋患者：①散发先天性聋哑儿童16例，年龄1～10岁，其中男10例，女6例；听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)测试示130 dB peSPL刺激13例无诱发反应，3例可诱发出Ⅲ波和Ⅴ波；②常染色体隐性遗传感音神经性聋(家系中至少2例同类耳聋患者)39个家系中的先症者39例(男22例，女17例)，年龄1.5～30岁；重度聋19例，深度聋17例，全聋3例；③常染色体显性遗传性聋均按DFNA3的临床表型[3]选择10岁前开始听力下降的感音神经性聋患者，30个家系中的先症者30例(男17例，女13例)，年龄6～34岁；中度聋14例，重度聋11例，深度聋4例，全聋1例。所有研究对象行纯音测听或ABR检查听力水平，耳科学检查排除其它致聋因素，如中耳炎、耳外伤、药物中毒性聋和梅尼埃病，并检查全身情况排除综合征性耳聋。抽外周静脉血10 ml，肝素抗凝无菌保存，72 h内抽提基因组DNA。在耳聋家系中，首先选择先症者筛查Cx26基因的碱基改变。
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2.对照组：从医学遗传学国家重点实验室DNA库中随机挑选健康中国成人100例的人基因组DNA (gDNA)为对照组,年龄18～60岁,男70例,女30例,均接受听力、甲状腺、心、肺、肝、肾和神经系统检查。
二、方法
1.DNA制备：用酚-氯仿法抽提基因组DNA。DNA溶于三氨基甲烷-乙二胺四乙酸中，取适量用紫外分光光度计进行定量和纯度检测，其余于-70℃保存备用。
2.引物设计与合成：Cx26有2个外显子，编码区在第二外显子内，用Design PCR 软件设计包括编码区的3对引物，Cx26-1U/1L：5 ′tcttttccagagcaaaccgcc 3′/5 ′agatggggaagtagtgatcgta3 ′，退火温度 62 ℃，扩增片段长度246 bp；Cx26-2U/2L：5′ggctgcaagaacgtgtgctac3 ′/ 5 ′tacatgacatagaagacgtac3 ′，退火温度58 ℃ ，扩增片段长度299 bp；Cx26-3U / 3L: 5 ′caagcagcatcttcttccgggt3 ′/ 5 ′gggcaatgcgttaaactggc3 ′，退火温度58 ℃，扩增片段长度282 bp；在Beckman Oligo1000 DNA合成器中合成。这3对引物的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增产物覆盖了Cx26基因的全部编码区，可用于分析编码区内所有的碱基改变。
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3.PCR扩增：通过PCR反应扩增待分析DNA靶序列的量。反应体系为20 μL，含1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl2 ，160 μmol dNTPs (MBI公司，美国)，正反向引物各60 ng，Tag酶2 U(ABI公司，美国)，gDNA 100 ng。PCR反应在PE9600热循环仪上完成，反应条件为：96 ℃预变性2 min，95℃变性10 s，复性20 s，72 ℃延伸45 s，32个循环，反应终止后再72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。耳聋组每次设健康人gDNA为阳性对照和空白对照。取5 μL PCR产物行6%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳检测产物的量和特异性，二者均满意者进行单链构象多态性(single strand conformational polymorphism analysis，SSCP)分析。
4.SSCP分析： PCR产物加等体积2×甲酰胺变性载样缓冲液，98 ℃变性10 min立即置冰上聚冷，上样于8%的SSCP胶(含5%的甘油，49∶1聚丙烯酰胺)，恒电压300 V的4 ℃水循环恒温电泳约20 h。 剥胶银染，在GS700光密度扫描仪(Bio-Rad 公司，美国)上记录并打印扫描结果。PCR产物变性后单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单个碱基置换、或数个碱基插入或缺失等改变时迁移率变化，可区分变异DNA和非变异DNA，变异DNA电泳带称为异常构象带。发现异常构象带者再行DNA测序。
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5.DNA测序：为证实SSCP分析所发现的异常构象带序列的碱基改变，对发现异常构象带者进一步行Cx26基因的DNA测序。引物1U和3L的扩增产物包含Cx26基因cDNA编码区全长，Cx26-1U和Cx26-3L分别作为正向和反向引物，用于扩增测序模板。捣碎浸泡法回收模板DNA，纯化，用ABI prism bigdye terminator cycle sequencing kit在 ABI 377 自动测序仪上以扩增模板的引物正反向测序。测序结果通过GCG(genetic computer group)软件进行分析。
结果
1. PCR-SSCP分析：分别发现对照组15例(15/100)、散发先天性聋哑患儿2例(2/16)、常染色体隐性遗传家系的先症者6例(6/39)、常染色体显性遗传家系的先症者3例(3/30)有异常构象带。在先症者发现异常构象带的家系中，进一步对全家系行PCR-SSCP分析，在1例常染色体显性遗传性聋家系中，先症者患耳聋的弟弟和儿子有与先证者相同的异常构象带，听力正常的父亲和配偶未见异常构象带，即该家系中Cx26基因异常构象带与耳聋共分离(图1)；其他家系未发现这种共分离现象。
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M:分子标准, A:II1，B:II3，C:III1，D:I1，E:II2，F和G:正常对照
图1 Cx26突变的常染色体显性遗传性聋患者家系图(a)和SSCP胶图(b)
2.DNA测序：对照组15例异常构象带者测序证实均为多态性改变，耳聋组中散发先天性聋哑2例、常染色体隐性遗传家系6例和常染色体显性遗传家系2例为多态性改变(表1)。只有异常构象带与耳聋共分离的这一常染色体显性遗传家系中，所有耳聋患者测序证实Cx26基因编码区299-300位碱基杂合性缺失AT(图2，野生型与突变型Cx26基因测序图)，导致移码突变，从100号密码子开始产生13个新的氨基酸，113号密码子处出现终止密码子。
表1 对照组和耳聋组中Cx26基因多态性
改变和突变的例数 碱基改变
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氨基酸改变
对照组
耳聋组
G79A
Val 27 Ile
7
3
G109A
Val 37 Ile
1
2
G341A
Glu 114 Gly
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1
2
G79A，G109A
Val 27 Ile，Val 37 Ile
4
G79A，G341A
Val 27 Ile，Glu 114 Gly
2
G442A
Val 148 Ile
1
G506A
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Cys 167 Tyr
1
T608C
Lle 203 Thr
1
299-300delAT
移码突变
3*
*为同一个常染色体显形遗传家系中的耳聋患者讨论
Cx26属于间隙连接蛋白基因，该基因家族编码的间隙连接蛋白属于膜蛋白，与相邻细胞的间隙连接蛋白组成一个完整的间隙连接通道。这些通道是细胞间电解质、第二信使和代谢物质的重要通路，在信息传递和物质交换中起重要作用。每一种间隙连接蛋白和相应的间隙连接通道都具有组织特异性和不同的生理功能。已证实间隙连接基因家族中Cx26、Cx30和 Cx31突变可引起NSHI[2，4，5]。Cx26蛋白4次跨膜，共分5个区：N端区、跨膜区(M1，M2，M3，M4)、细胞外区(E1，E2)、胞浆内连接区(CL)和C端区。N端区和跨膜区M1的细胞内侧端构成充当电压感受器的电荷复合体，细胞外区E1和E2决定间隙连接通道与其他Cx蛋白的相容性，胞内连接区和C端区与间隙连接通道pH值的门控有关[6]。免疫组化证实，内耳非感觉上皮细胞和组织连接细胞表达Cx26蛋白。在声音传导过程中，Cx26蛋白对K+经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调控作用，Cx26基因突变后，K+进入内淋巴液的循环受影响，导致感音神经性聋[7]。
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在欧美等地区高加索人中，Cx26 基因突变占儿童语前聋的20%，占常染色体隐性遗传性聋的40%[8, 9]。在DFNB1中，已发现Cx26 基因25 种突变型(The connexin-deafness homepage: http://www.iro.es/cx26deaf. html)，其中错义突变15种、小缺失突变6种(缺失1～14个碱基)、小插入突变3种(插入1个碱基)和大缺失突变1种(缺失38个碱基)。在高加索人群，特别是在地中海地区DFNB1的突变患者中，编码区30～35(GGGGGG)缺失一个G(命名为30delG或35delG)者约占60%～85 %[8]。在本组39例常染色体隐性遗传性聋家系的先症者中有6例、16例散发先天性聋哑儿童中有2例，检测出Cx26基因6种多态性改变，未发现致病突变。Kudo等[10]在日本人中发现Cx26基因突变率也明显低于其他种族。中国人的绝大多数和日本人都属蒙古人种，因此，我们估计，蒙古人种常染色体隐性遗传NSHI的Cx26突变率可能低于其他人种。对此，我们将收集病例继续进行研究。
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在DFNA3中，已报道Cx26基因4种突变：34 T→C( Met 12 Thr), 71 G→A(Trp 24 Term)，132 G→C (Trp 44 Cys)，223 C→T (Arg 75 Trp)。我们在30个常染色体显性遗传性聋家系中，发现2个家系的先症者Cx26基因呈多态性改变，另1个家系所有患者有Cx26基因cDNA编码区299-300位点AT杂合性缺失，在此家系中，这一突变与耳聋共分离，可以确定属于致病突变。此型突变导致Cx26基因从100号密码子后编码13个新的氨基酸，终止密码子提前至113号，翻译的多肽只有112个氨基酸，比野生型蛋白的226个氨基酸截短了114个，且只有前99个氨基酸与野生型相同。这种突变型Cx26多肽的CL区大部分缺失，M3、E2和M4区完全缺失。推测此突变型蛋白可能丧失对间隙连接通道pH值的调控，降低间隙连接对异型蛋白的辨别能力。在国际互联网上查询，我们发现Usami在1999年2月美国耳鼻咽喉科研究年会(Association for Research in Otolaryngology，ARO)上公布了这一相同的突变，但未说明是在何种遗传类型的耳聋中检测出了此种突变。我们发现Cx26基因突变的这一家系中，先证者从小为非进行性双耳听力障碍，纯音测听示中度感音神经性聋；先证者弟弟为先天性聋哑，ABR证实为双耳深度感音神经性聋；先证者儿子症状与先证者相同，ABR证实为中度感音神经性聋。这一家系的症状与DFNA3的表型相符。因此，我们认为Cx26基因的299-300位点碱基AT杂合性缺失可导致常染色体显性遗传性聋DFNA3，但这一突变点是否为中国DFNA3人群的突变热点，尚有待进一步证实。
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同时，我们在正常对照组和耳聋组都发现了较高的Cx26多态性改变，其中341A→G(Glu 114 Gly)多态性改变在遗传性聋网站Cx26主页上未见公布，442G→A(Val148Ile)、506G→A(Cys167Tyr)、608T→C(Lle205Thr)3种多态性改变虽在我们的对照组中未发现，但国外学者已有这些相同多态性改变的报道在因特网上公布。多态性改变属于正常现象，绝大部分基因的多态性改变在1%左右，Cx26基因的多态性明显高于绝大部分基因。要区分DNA分子碱基改变是正常的多态性还是致病突变，除需在正常人群中大规模筛查和对碱基改变后的基因功能进行分析外，还可根据单基因遗传病家系进行分析，如果碱基改变在家系中与遗传性疾病共同出现(共分离)，则为致病突变；反之，属于多态性改变。由于Cx26基因存在非常高的多态性现象，因此，对耳聋作Cx26基因诊断时，应特别注意辨别是多态性改变还是致病突变。临床开展Cx26基因诊断时，可以在因特网上的“The connexin-deafness homepage”查询，该主页上列有已发现的各种致病突变和多态性改变。
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图1 常染色体显性遗传性聋家系和健康人Cx26基因反向引物测序图(Cx26-3L )。A 常染色体显性遗传性聋家系测
序图，箭头所指为杂合性缺失突变起始位点；B 健康人 Cx26 基因测序图
志谢 本研究全部实验在湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室完成
基金项目：国家863和国家973项目经费及国家自然科学基金(编号：39980040)
通信作者：夏家辉(Email：nlmglcy@public.cs.hn.cn)
参考文献
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2，Kelsell DP,Dunlop J,Stevens HP, et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature, 1997, 387：80-83.
3，Denoyelle F, Lina-Granade G, Plauchu H, et al. Connexin 26 gene linked to a dominant deafness. Nature， 1998, 393: 319-320.
4，Grifa A, Wagner CA, D′Ambrosio L, et al. Mutations in GJB6 cause nonsyndromic autosomal dominant deafness at DFNA3 locus. Nat Genet,1999,23:16-18.
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5，Xia JH, Liu CY, Tang BS, et al. Mutations in the gene encoding gap junction protein β-3 associated with autosomal dominant hearing impairment. Nat Genet, 1998, 20：370-373.
6，Bruzzone R, White TW, Paul DL. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur J Biochem, 1996, 238：1-27.
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9，Green GE, Scott DA, McDonald JM, et al. Carrier rates in the midwestern United States for GJB2 mutations causing inherited deafness. JAMA, 1999, 281:2211-2216.
10，Kudo T, Kure S, Matsubara Y, et al. Identification of a novel common mutation in the connexin 26 gene (GJB2) among Japanese patients with childhood deafness. Am J Hum Genet, 1999，Suppl：A840.
(收稿日期：1999-12-02), 百拇医药