呼吸道合胞病毒和人巨细胞病毒混合感染对感染细胞的影响
作者：龚四堂 董永绥 方峰
单位：龚四堂(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室 现在510120广州市儿童医院)； 董永绥(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室)； 方峰(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室)
关键词：呼吸道合胞病毒；巨细胞病毒属；细胞分裂
中华儿科杂志000213 【摘要】 目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)和人巨细胞病毒(HCMV)混合感染对感染细胞的影响。方法 用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色方法检测下列四组标本的吸光度A值(曾称光密度OD)，包括：未感染病毒细胞组、RSV感染细胞组、RSV和HCMV同时混合感染细胞组、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(每组20孔，共80孔)；流式细胞分析仪检测下列六组标本细胞分裂周期，包括：正常细胞组、RSV感染组细胞、HCMV感染组、HCMV和RSV同时感染细胞组、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(每组12孔，共72孔)。结果 (1)未感染病毒组A值(1.50±0.12)明显高于RSV感染组(1.12±0.13)和混合感染组(1.09±0.08)(P<0.01)，两种病毒混合感染与RSV单独感染组A值差异无显著性(P>0.05)。(2)正常细胞组S期细胞比例(15.31±1.08)较病毒感染组为高(P<0.01)，RSV单独感染组(10.65±0.72)较HCMV单独感染组(5.65±1.35)及RSV和HCMV混合感染组S期细胞比例(5.02±1.08、4.79±0.28、5.14±0.56)为高，HCMV单独感染与混合感染组S期细胞所占比率差异无显著性(P>0.05)。结论 RSV单独感染和与HCMV混合感染，二者对感染细胞活细胞数影响基本相同；RSV和HCMV单独或混合感染均抑制细胞分裂，但以HCMV和两种病毒混合感染抑制作用最强，而RSV单独感染抑制作用较弱。
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The damage to cultured cells caused by respiratory syncytial virus and human cytomegalovirus coinfection
GONG Sitang DONG Yongsui FANG Feng.
Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China
【Abstract】 Objective To investigate the damage to cultured cells caused by respiratory syncytial virus (RSV) and human cytomegalovirus (HCMV) coinfection. Method MTT colorimetric assay was used to measure the A value of the following four WI-38 cell samples, including cells which were not infected with viruses, infected with RSV, infected with RSV and HCMV simultaneously, cells coinfected with HCMV 12 hours after RSV infection, there were altogether 80 samples, 20 samples per group. The cell cycle progression of the following six WI-38 cell samples were investigated by using flow cytometry, including the normal cells, cells infected with RSV, cells infected with HCMV, cells coinfected with RSV and HCMV simultaneously, cells coinfected with HCMV 12 hours after RSV infection and cells coinfected with RSV 12 hours after HCMV infection, there were altogether 72 samples, 12 samples per group. Results (1) The A value of normal cell samples (1.50±0.12) was greater than that of cells infected with RSV (1.12±0.13) and coinfected with RSV and HCMV (1.09±0.08) (P<0.01). The A value of RSV infected cells was not significantly different from that of RSV and HCMV coinfected cells (P>0.05). (2) The proportion of S phase cell of normal cells (15.31±1.08) was higher than that of cells infected with virus (P<0.01), and the proportion of S phase cell of RSV infected cells (10.65±0.72) was higher than that of HCMV infected cells (5.65±1.35) and RSV and HCMV coinfected cells (5.02±1.08, 4.79±0.28, 5.14±0.56) (P<0.01). No significant difference was found in the proportion between HCMV infected cells and RSV and HCMV coinfected cells (P>0.05). Conclusion The numbers of living cells were not different between RSV infected cells and RSV and HCMV coinfection. The cell cycle was inhibited by HCMV and RSV infection, but the inhibition induced by single HCMV infection and coinfection with RSV and HCMV was stronger than that by single RSV infection.
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【Key words】 Respiratory syncytial viruses; Cytomegalovirus; Cell division
呼吸道合胞病毒(RSV)和人巨细胞病毒(HCMV)均为婴儿呼吸道感染的常见病原，且可混合存在[1]。国内外学者从临床症状、体征及疾病的预后分析提出，两种病毒混合感染不影响婴幼儿下呼吸道感染性疾病的严重程度和转归[2,3]。但两种病毒混合感染是否加重感染细胞的损害以及对感染细胞分裂周期有何影响，尚无定论。本研究用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色方法检测两种病毒混合感染时活细胞数，流式细胞仪分析感染细胞分裂周期的变化，旨在探讨RSV和HCMV混合感染的影响。
材料与方法
一、材料
1. 病毒：HCMV为AD169株，由中国预防医学科学院病毒所提供；RSV为A型Long株，由同济医科大学附属协和医院病毒研究室提供。
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2. 细胞：WI-38细胞(ATCC，CCL-75)由武汉大学细胞保存中心提供。
3. 试剂：四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma)、碘化丙啶(PI)(Sigma)。
4. 仪器：酶标光密度仪(DG3022A型)、流式细胞仪(FACSort氖激光光源488 nm)。
二、方法
(一) HCMV和RSV混合感染对细胞的损害
1.实验分组: 共分四组：a组：未感染病毒的细胞组；b组：RSV感染细胞组；c组：RSV和HCMV同时感染细胞组；d组：HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组。
2.标本收集 :取无菌96孔板，接种WI-38细胞，让细胞长成单层，按上述分组分别接种RSV和HCMV各10 个组织培养感染剂量50(TCID50)，各接种20孔，共80孔。
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3. MTT染色检测：在被检测孔中加10 mg/ml的MTT 10 μl，置CO2培养箱4 h，取出后加100 μl二甲亚砜，在酶标仪上测定570 nm吸收值，以A值(曾称光密度OD)代替活细胞量，每天每组检测4孔，连续检测5 d。
(二)HCMV和RSV混合感染对RSV和HCMV合时感染细胞分裂周期中S期影响
1.实验分组：共分六组：e组：正常细胞对照组；f组：RSV感染细胞组；g组：HCMV感染细胞组；h组：HCMV和RSV同时感染细胞组；i组：RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组；j组：HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组。
2.标本收集:无菌12孔板接种WI-38细胞，让其成长成单层，按上述分组接种RSV和HCMV，病毒量为1 000 TCID50，每组12孔，共72孔。每组24 h收获4孔，弃上清液，用无血清的培养液洗一次，0.25%胰酶消化3 min左右，将消化下的细胞悬液用0.01 mol磷酸盐缓冲盐水溶液( PBS)洗2次，70 %酒精2 ml混匀，-20℃保存，连续观察72 h。
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3.标本检测：取保存标本，离心除酒精，用PI染色30 min，流式细胞仪检测细胞DNA含量，根据DNA量判断各期细胞所占比率。
(三)统计学处理
统计学处理采用多元方差分析(F检验)。
结果
一、 MTT染色所测A值
MTT染色所测A值见表1，未感染病毒的细胞组(a组)每天A值高于RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)。经统计学分析，差异有显著性(P<0.05)；而RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)之间差异无显著性(P>0.05)，显示：未感染病毒的细胞组(a组)的活细胞数明显高于RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c 组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)，而RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组 )、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)的活细胞数差异无显著性。
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二、 RSV、HCMV单独感染及两种病毒混合感染细胞G2、M期细胞比率比较
未感染病毒细胞组G2(e组)、M期细胞比率与RSV感染细胞组(f组)、HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)之间比较，差异无显著性(P>0.05)。显示：RSV、HCMV单独感染和两种病毒混合感染对细胞G2、M期影响较小。
三、 RSV、HCMV单独或混合感染S期细胞比率比较
未感染病毒细胞组(e组)、RSV感染细胞组(f组)、HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)S期细胞所占比率(表2)，未感染病毒细胞组(e组)S期细胞比率(%)与RSV感染细胞组(f组)、HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)分别比较，差异有显著性(P<0.01)。显示：病毒感染组细胞S期比率下降。RSV感染细胞组(f组)S期细胞比率与HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h 组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)分别比较，差异有显著性(P<0.01)，显示：RSV单独感染组细胞S期比率下降程度较HCMV和混合感染组细胞S期比率下降弱。HCMV单独感染组(g组)与混合感染组(h组) HCMV和RSV同时感染组、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)分别比较及HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i 组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)两两比较，差异均无显著性(P>0.05)，显示：HCMV单独感染与混合感染组感染细胞S期比率下降程度相当。
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表1 各组每天所测A值(
±s，n=4) 组别
1d
2d
3d
4d
5d
F值
未感染组
1.50±0.12
1.33±0.18
1.56±0.28
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1.67±0.24
1.24±0.09
6.08*
RSV感染组
1.12±0.13
1.09±0.12
0.84±0.14
0.83±0.06
0.77±0.09
7.86*
RSV+HCMV
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1.09±0.08
1.13±0.14
0.94±0.02
0.77±0.10
0.83±0.16
5.89*
HCMV(12 h)+RSV
1.12±0.10
1.10±0.05
0.95±0.03
0.89±0.08
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0.92±0.04
2.74**
F值
9.09*
3.08**
26.07*
45.42*
10.53*
*P<0.01, ** P>0.05表2 RSV、HCMV单独及混合感染细胞周期S期值(±s，n=4,%) 组别
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24 h
48 h
72 h
F值
正常组
15.31±1.08*
18.37±0.97*
19.54±0.59*
44.54▲
RSV
10.65±0.72△
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13.83±1.35△
15.64±1.09△
56.83▲
HCMV
5.65±1.35
5.82±1.20
4.21±0.71
8.44▲
HCMV+RSV
5.02±1.08
5.69±0.56
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4.42±0.75
5.32▲▲
RSV(12h)+HCMV
4.79±0.28
5.97±1.17
5.14±0.24
5.28▲▲
HCMV(12h)+RSV
5.14±0.56
4.50±0.60
3.80±0.27
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5.92▲▲
F值
121.89▲
211.72▲
314.79▲
* 正常组分别与其它各组两两比较，P<0.01;△ RSV组分别与HCMV、HCMV+RSV、RSV(12 h)+HCMV、HCMV(12 h)+RSV组两两比较，P<0.01;HCMV组分别与HCMV+RSV、RSV(12 h)+HCMV、HCMV(12 h)+RSV组两两比较，P>0.05, ▲ P<0.01; ▲▲ P<0.05讨论
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一、小儿呼吸道RSV和HCMV混合感染
RSV是小儿呼吸道感染的主要病原之一，可与多种病毒混合感染，其中HCMV的混合感染率较高。国外Zandotti等[4]检测165例RSV感染患者，其中RSV和HCMV混合感染20例，国内王世俊等[1]、刘祖强等[2]检测RSV和HCMV混合感染率分别为53.3 %和71.1 %。三位学者均得出小儿呼吸道RSV单独与混合感染，两组病例在病情严重程度差异无显著性。但未进行进一步研究。
二、 RSV和HCMV混合感染对活细胞量的影响及临床意义
MTT是一种染料，只有活细胞线粒体脱氢酶可以还原MTT为蓝色产物，通过酶标仪测570nm吸收值，能表示活细胞的数量。Watanabe等[5]用MTT染色方法检测不同抗病毒药物作用后的A值，以此来评价药物的疗效。用MTT染色方法检测不同时间不同组别的A值表示活细胞量，从而评价RSV单独感染及与HCMV混合感染对细胞的损害。未感染病毒的细胞组(a组)、RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)每天A值，未感染病毒的细胞组(a组)均值高于RSV感染细胞组(b 组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)，差异具有显著性，而RSV感染细胞组(b 组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)之间差异无显著性。因此，在所观察的时间内，RSV单独感染与HCMV混合感染WI-38细胞，既没有增加也没有减少感染细胞的活细胞量。可能是RSV是杀细胞病毒，损害细胞快，而HCMV是慢病毒，其感染后引起细胞损害发生较慢，两种病毒混合感染时对活细胞数的影响，在实验观察的时间内，主要是由RSV所致。从而从实验上证实了国内学者王世俊等[1]、刘祖强等[2]及国外学者Zandotti等[4]在临床上观察小儿呼吸道RSV单独感染与合并HCMV感染，未发现两组病例在病情严重程度上存在差异。
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三、RSV和HCMV感染对细胞周期的影响
HCMV感染细胞后对细胞周期影响有过不少报道，1974年，Jeor 等[6]提出HCMV感染细胞可刺激细胞DNA合成，而紫外线失活的HCMV则不能刺激细胞DNA合成；但Boldogh等 [7] 认为紫外线失活的HCMV可刺激细胞DNA合成。近年来，随着对细胞分裂周期调控研究的深入， Francoise 等[8]用HCMV感染人包皮成纤维细胞，P53水平增加，抑制细胞从G1进入S期，Kovacs 等[9]得出相同的结论。
用流式细胞仪对HCMV感染细胞，与未感染病毒的正常细胞，检测不同时间G1、S、G2、M期细胞所占比率，各组G2、M期细胞比率无明显差异，而G1、S期细胞比率成反比例；24、48、72 h各时间段未感染细胞S期细胞比率明显高于HCMV感染细胞S期细胞比率，HCMV感染抑制细胞从G1期进入S期，这与Mansuo等[10]观点相同。
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RSV感染细胞，对细胞周期的直接作用，尚无确切的报道。Sathind等报道[11]RSV感染细胞，产生白细胞介素-1抑制因子，该因子可抑制细胞分裂，阻止细胞从G1期进入S期。用RSV感染细胞与正常细胞进行对照分析，每24 h取样用流式细胞仪检测S期细胞比率。正常细胞S期比率明显高于RSV感染细胞。因此，RSV感染细胞同样抑制细胞从G1期进入S期。其抑制程度与HCMV感染比较，RSV感染对细胞从G1期进入S期的抑制作用比HCMV感染时弱。
HCMV和RSV混合感染，不管两种病毒作用先后顺序如何，对细胞分裂周期影响作用差异无显著性；与单纯HCMV感染比较，其作用程度差异亦无显著性，但较RSV感染时作用强。这可能是RSV是急性杀细胞病毒，本身对细胞分裂周期影响较弱，而HCMV是慢病毒，对细胞分裂周期影响较强，二者混合感染时对细胞分裂周期影响主要是以HCMV感染的影响作用为主之故。
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参考文献
[1]王世俊，董永绥. 小儿巨细胞病毒相关性下呼吸道感染. 中国实用儿科杂志，1994,9：346-348.
[2]刘祖强，何淑君，贺云莉，等. 小儿肺炎多种病毒混同感染病原学与临床研究. 中华医学杂志，1998,22：99-101.
[3]Subbarao EK, Griffis J, Waner JL. Detection of multiple viral agents in nasopharyngeal specimens yielding respiratory syncytial virus (RSV): an assessment of diagnostic strategy and clinical significance. Diagn Microbiol Infect Dis, 1998, 12:327-336.
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[4]Zandotti CM,Delamballerie XN,Vignoli C,et al.Simultaneous pulmonary infection with respiratory syncytial virus and human cytomegalovirus. Arch Dis Child ,1994,70:452-459.
[5]Watanabe W, Konno k, Ijichi K, et al. MTT colorimetric assay system for the screening of anti-orthomyxo and anti-paramyxoviral agents. J Viral Methods, 1994,48: 257-263.
[6]Jeor S, Albrecht ST, Funk F, et al. Stimulation of cellular DNA synthesis by human cytomegalovirus. J Virol, 1974, 13: 353-360.
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[7]Boldogh I, Gartner L, Vaezl I. Stimulation of host DNA synthesis and induction of early antigens by ultraviolet light irradiated human cytomegalovirus. Arch, 1978,58:289-294.
[8]Francoise MJ, Jault JM, Ruchti F, et al. Cytomegalovirus infection induces high levels of cyclins, phosphorylated Rb, and P53, lesding to cell cycle arrest. J Virol, 1995, 69: 6697-6704.
[9]Kovacs A, Weber ML, Burns LJ, et al. Cytoplasmic sequestration of p53 in cytomegalovirus-infected human endothelial cells. Am J Pathol, 1996,149: 1531-1539.
, 百拇医药
[10]Mansuo LU, Shenk T. Human cytomegalovirus infection inhibits cell cycle progression at multiple points, including the transition from G1 to S.J Virol, 1966, 70:8850-8859.
[11]Sathind AR, McCrthy Do, Nichols JE, et al. Interleukin-1-inhibitor activity induced by respiratory syncytial virus: abrogation of virus-specific and alternate human lymphocyte proliferative responeses. J Infect Dis, 1991, 163:71-80.
收稿日期：1999-05-07, 百拇医药
单位：龚四堂(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室 现在510120广州市儿童医院)； 董永绥(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室)； 方峰(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科教研室)
关键词：呼吸道合胞病毒；巨细胞病毒属；细胞分裂
中华儿科杂志000213 【摘要】 目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)和人巨细胞病毒(HCMV)混合感染对感染细胞的影响。方法 用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色方法检测下列四组标本的吸光度A值(曾称光密度OD)，包括：未感染病毒细胞组、RSV感染细胞组、RSV和HCMV同时混合感染细胞组、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(每组20孔，共80孔)；流式细胞分析仪检测下列六组标本细胞分裂周期，包括：正常细胞组、RSV感染组细胞、HCMV感染组、HCMV和RSV同时感染细胞组、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(每组12孔，共72孔)。结果 (1)未感染病毒组A值(1.50±0.12)明显高于RSV感染组(1.12±0.13)和混合感染组(1.09±0.08)(P<0.01)，两种病毒混合感染与RSV单独感染组A值差异无显著性(P>0.05)。(2)正常细胞组S期细胞比例(15.31±1.08)较病毒感染组为高(P<0.01)，RSV单独感染组(10.65±0.72)较HCMV单独感染组(5.65±1.35)及RSV和HCMV混合感染组S期细胞比例(5.02±1.08、4.79±0.28、5.14±0.56)为高，HCMV单独感染与混合感染组S期细胞所占比率差异无显著性(P>0.05)。结论 RSV单独感染和与HCMV混合感染，二者对感染细胞活细胞数影响基本相同；RSV和HCMV单独或混合感染均抑制细胞分裂，但以HCMV和两种病毒混合感染抑制作用最强，而RSV单独感染抑制作用较弱。
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The damage to cultured cells caused by respiratory syncytial virus and human cytomegalovirus coinfection
GONG Sitang DONG Yongsui FANG Feng.
Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China
【Abstract】 Objective To investigate the damage to cultured cells caused by respiratory syncytial virus (RSV) and human cytomegalovirus (HCMV) coinfection. Method MTT colorimetric assay was used to measure the A value of the following four WI-38 cell samples, including cells which were not infected with viruses, infected with RSV, infected with RSV and HCMV simultaneously, cells coinfected with HCMV 12 hours after RSV infection, there were altogether 80 samples, 20 samples per group. The cell cycle progression of the following six WI-38 cell samples were investigated by using flow cytometry, including the normal cells, cells infected with RSV, cells infected with HCMV, cells coinfected with RSV and HCMV simultaneously, cells coinfected with HCMV 12 hours after RSV infection and cells coinfected with RSV 12 hours after HCMV infection, there were altogether 72 samples, 12 samples per group. Results (1) The A value of normal cell samples (1.50±0.12) was greater than that of cells infected with RSV (1.12±0.13) and coinfected with RSV and HCMV (1.09±0.08) (P<0.01). The A value of RSV infected cells was not significantly different from that of RSV and HCMV coinfected cells (P>0.05). (2) The proportion of S phase cell of normal cells (15.31±1.08) was higher than that of cells infected with virus (P<0.01), and the proportion of S phase cell of RSV infected cells (10.65±0.72) was higher than that of HCMV infected cells (5.65±1.35) and RSV and HCMV coinfected cells (5.02±1.08, 4.79±0.28, 5.14±0.56) (P<0.01). No significant difference was found in the proportion between HCMV infected cells and RSV and HCMV coinfected cells (P>0.05). Conclusion The numbers of living cells were not different between RSV infected cells and RSV and HCMV coinfection. The cell cycle was inhibited by HCMV and RSV infection, but the inhibition induced by single HCMV infection and coinfection with RSV and HCMV was stronger than that by single RSV infection.
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【Key words】 Respiratory syncytial viruses; Cytomegalovirus; Cell division
呼吸道合胞病毒(RSV)和人巨细胞病毒(HCMV)均为婴儿呼吸道感染的常见病原，且可混合存在[1]。国内外学者从临床症状、体征及疾病的预后分析提出，两种病毒混合感染不影响婴幼儿下呼吸道感染性疾病的严重程度和转归[2,3]。但两种病毒混合感染是否加重感染细胞的损害以及对感染细胞分裂周期有何影响，尚无定论。本研究用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色方法检测两种病毒混合感染时活细胞数，流式细胞仪分析感染细胞分裂周期的变化，旨在探讨RSV和HCMV混合感染的影响。
材料与方法
一、材料
1. 病毒：HCMV为AD169株，由中国预防医学科学院病毒所提供；RSV为A型Long株，由同济医科大学附属协和医院病毒研究室提供。
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2. 细胞：WI-38细胞(ATCC，CCL-75)由武汉大学细胞保存中心提供。
3. 试剂：四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma)、碘化丙啶(PI)(Sigma)。
4. 仪器：酶标光密度仪(DG3022A型)、流式细胞仪(FACSort氖激光光源488 nm)。
二、方法
(一) HCMV和RSV混合感染对细胞的损害
1.实验分组: 共分四组：a组：未感染病毒的细胞组；b组：RSV感染细胞组；c组：RSV和HCMV同时感染细胞组；d组：HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组。
2.标本收集 :取无菌96孔板，接种WI-38细胞，让细胞长成单层，按上述分组分别接种RSV和HCMV各10 个组织培养感染剂量50(TCID50)，各接种20孔，共80孔。
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3. MTT染色检测：在被检测孔中加10 mg/ml的MTT 10 μl，置CO2培养箱4 h，取出后加100 μl二甲亚砜，在酶标仪上测定570 nm吸收值，以A值(曾称光密度OD)代替活细胞量，每天每组检测4孔，连续检测5 d。
(二)HCMV和RSV混合感染对RSV和HCMV合时感染细胞分裂周期中S期影响
1.实验分组：共分六组：e组：正常细胞对照组；f组：RSV感染细胞组；g组：HCMV感染细胞组；h组：HCMV和RSV同时感染细胞组；i组：RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组；j组：HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组。
2.标本收集:无菌12孔板接种WI-38细胞，让其成长成单层，按上述分组接种RSV和HCMV，病毒量为1 000 TCID50，每组12孔，共72孔。每组24 h收获4孔，弃上清液，用无血清的培养液洗一次，0.25%胰酶消化3 min左右，将消化下的细胞悬液用0.01 mol磷酸盐缓冲盐水溶液( PBS)洗2次，70 %酒精2 ml混匀，-20℃保存，连续观察72 h。
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3.标本检测：取保存标本，离心除酒精，用PI染色30 min，流式细胞仪检测细胞DNA含量，根据DNA量判断各期细胞所占比率。
(三)统计学处理
统计学处理采用多元方差分析(F检验)。
结果
一、 MTT染色所测A值
MTT染色所测A值见表1，未感染病毒的细胞组(a组)每天A值高于RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)。经统计学分析，差异有显著性(P<0.05)；而RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)之间差异无显著性(P>0.05)，显示：未感染病毒的细胞组(a组)的活细胞数明显高于RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c 组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)，而RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组 )、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)的活细胞数差异无显著性。
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二、 RSV、HCMV单独感染及两种病毒混合感染细胞G2、M期细胞比率比较
未感染病毒细胞组G2(e组)、M期细胞比率与RSV感染细胞组(f组)、HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)之间比较，差异无显著性(P>0.05)。显示：RSV、HCMV单独感染和两种病毒混合感染对细胞G2、M期影响较小。
三、 RSV、HCMV单独或混合感染S期细胞比率比较
未感染病毒细胞组(e组)、RSV感染细胞组(f组)、HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)S期细胞所占比率(表2)，未感染病毒细胞组(e组)S期细胞比率(%)与RSV感染细胞组(f组)、HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)分别比较，差异有显著性(P<0.01)。显示：病毒感染组细胞S期比率下降。RSV感染细胞组(f组)S期细胞比率与HCMV感染细胞组(g组)、HCMV和RSV同时感染组(h 组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)分别比较，差异有显著性(P<0.01)，显示：RSV单独感染组细胞S期比率下降程度较HCMV和混合感染组细胞S期比率下降弱。HCMV单独感染组(g组)与混合感染组(h组) HCMV和RSV同时感染组、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)分别比较及HCMV和RSV同时感染组(h组)、RSV感染12 h后再感染HCMV细胞组(i 组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(j组)两两比较，差异均无显著性(P>0.05)，显示：HCMV单独感染与混合感染组感染细胞S期比率下降程度相当。
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表1 各组每天所测A值(
±s，n=4) 组别1d
2d
3d
4d
5d
F值
未感染组
1.50±0.12
1.33±0.18
1.56±0.28
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1.67±0.24
1.24±0.09
6.08*
RSV感染组
1.12±0.13
1.09±0.12
0.84±0.14
0.83±0.06
0.77±0.09
7.86*
RSV+HCMV
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1.09±0.08
1.13±0.14
0.94±0.02
0.77±0.10
0.83±0.16
5.89*
HCMV(12 h)+RSV
1.12±0.10
1.10±0.05
0.95±0.03
0.89±0.08
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0.92±0.04
2.74**
F值
9.09*
3.08**
26.07*
45.42*
10.53*
*P<0.01, ** P>0.05表2 RSV、HCMV单独及混合感染细胞周期S期值(
±s，n=4,%) 组别, 百拇医药
24 h
48 h
72 h
F值
正常组
15.31±1.08*
18.37±0.97*
19.54±0.59*
44.54▲
RSV
10.65±0.72△
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13.83±1.35△
15.64±1.09△
56.83▲
HCMV
5.65±1.35
5.82±1.20
4.21±0.71
8.44▲
HCMV+RSV
5.02±1.08
5.69±0.56
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4.42±0.75
5.32▲▲
RSV(12h)+HCMV
4.79±0.28
5.97±1.17
5.14±0.24
5.28▲▲
HCMV(12h)+RSV
5.14±0.56
4.50±0.60
3.80±0.27
, http://www.100md.com
5.92▲▲
F值
121.89▲
211.72▲
314.79▲
* 正常组分别与其它各组两两比较，P<0.01;△ RSV组分别与HCMV、HCMV+RSV、RSV(12 h)+HCMV、HCMV(12 h)+RSV组两两比较，P<0.01;HCMV组分别与HCMV+RSV、RSV(12 h)+HCMV、HCMV(12 h)+RSV组两两比较，P>0.05, ▲ P<0.01; ▲▲ P<0.05讨论
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一、小儿呼吸道RSV和HCMV混合感染
RSV是小儿呼吸道感染的主要病原之一，可与多种病毒混合感染，其中HCMV的混合感染率较高。国外Zandotti等[4]检测165例RSV感染患者，其中RSV和HCMV混合感染20例，国内王世俊等[1]、刘祖强等[2]检测RSV和HCMV混合感染率分别为53.3 %和71.1 %。三位学者均得出小儿呼吸道RSV单独与混合感染，两组病例在病情严重程度差异无显著性。但未进行进一步研究。
二、 RSV和HCMV混合感染对活细胞量的影响及临床意义
MTT是一种染料，只有活细胞线粒体脱氢酶可以还原MTT为蓝色产物，通过酶标仪测570nm吸收值，能表示活细胞的数量。Watanabe等[5]用MTT染色方法检测不同抗病毒药物作用后的A值，以此来评价药物的疗效。用MTT染色方法检测不同时间不同组别的A值表示活细胞量，从而评价RSV单独感染及与HCMV混合感染对细胞的损害。未感染病毒的细胞组(a组)、RSV感染细胞组(b组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)每天A值，未感染病毒的细胞组(a组)均值高于RSV感染细胞组(b 组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)，差异具有显著性，而RSV感染细胞组(b 组)、RSV和HCMV同时感染细胞组(c组)、HCMV感染12 h后再感染RSV细胞组(d组)之间差异无显著性。因此，在所观察的时间内，RSV单独感染与HCMV混合感染WI-38细胞，既没有增加也没有减少感染细胞的活细胞量。可能是RSV是杀细胞病毒，损害细胞快，而HCMV是慢病毒，其感染后引起细胞损害发生较慢，两种病毒混合感染时对活细胞数的影响，在实验观察的时间内，主要是由RSV所致。从而从实验上证实了国内学者王世俊等[1]、刘祖强等[2]及国外学者Zandotti等[4]在临床上观察小儿呼吸道RSV单独感染与合并HCMV感染，未发现两组病例在病情严重程度上存在差异。
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三、RSV和HCMV感染对细胞周期的影响
HCMV感染细胞后对细胞周期影响有过不少报道，1974年，Jeor 等[6]提出HCMV感染细胞可刺激细胞DNA合成，而紫外线失活的HCMV则不能刺激细胞DNA合成；但Boldogh等 [7] 认为紫外线失活的HCMV可刺激细胞DNA合成。近年来，随着对细胞分裂周期调控研究的深入， Francoise 等[8]用HCMV感染人包皮成纤维细胞，P53水平增加，抑制细胞从G1进入S期，Kovacs 等[9]得出相同的结论。
用流式细胞仪对HCMV感染细胞，与未感染病毒的正常细胞，检测不同时间G1、S、G2、M期细胞所占比率，各组G2、M期细胞比率无明显差异，而G1、S期细胞比率成反比例；24、48、72 h各时间段未感染细胞S期细胞比率明显高于HCMV感染细胞S期细胞比率，HCMV感染抑制细胞从G1期进入S期，这与Mansuo等[10]观点相同。
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RSV感染细胞，对细胞周期的直接作用，尚无确切的报道。Sathind等报道[11]RSV感染细胞，产生白细胞介素-1抑制因子，该因子可抑制细胞分裂，阻止细胞从G1期进入S期。用RSV感染细胞与正常细胞进行对照分析，每24 h取样用流式细胞仪检测S期细胞比率。正常细胞S期比率明显高于RSV感染细胞。因此，RSV感染细胞同样抑制细胞从G1期进入S期。其抑制程度与HCMV感染比较，RSV感染对细胞从G1期进入S期的抑制作用比HCMV感染时弱。
HCMV和RSV混合感染，不管两种病毒作用先后顺序如何，对细胞分裂周期影响作用差异无显著性；与单纯HCMV感染比较，其作用程度差异亦无显著性，但较RSV感染时作用强。这可能是RSV是急性杀细胞病毒，本身对细胞分裂周期影响较弱，而HCMV是慢病毒，对细胞分裂周期影响较强，二者混合感染时对细胞分裂周期影响主要是以HCMV感染的影响作用为主之故。
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参考文献
[1]王世俊，董永绥. 小儿巨细胞病毒相关性下呼吸道感染. 中国实用儿科杂志，1994,9：346-348.
[2]刘祖强，何淑君，贺云莉，等. 小儿肺炎多种病毒混同感染病原学与临床研究. 中华医学杂志，1998,22：99-101.
[3]Subbarao EK, Griffis J, Waner JL. Detection of multiple viral agents in nasopharyngeal specimens yielding respiratory syncytial virus (RSV): an assessment of diagnostic strategy and clinical significance. Diagn Microbiol Infect Dis, 1998, 12:327-336.
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[4]Zandotti CM,Delamballerie XN,Vignoli C,et al.Simultaneous pulmonary infection with respiratory syncytial virus and human cytomegalovirus. Arch Dis Child ,1994,70:452-459.
[5]Watanabe W, Konno k, Ijichi K, et al. MTT colorimetric assay system for the screening of anti-orthomyxo and anti-paramyxoviral agents. J Viral Methods, 1994,48: 257-263.
[6]Jeor S, Albrecht ST, Funk F, et al. Stimulation of cellular DNA synthesis by human cytomegalovirus. J Virol, 1974, 13: 353-360.
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[7]Boldogh I, Gartner L, Vaezl I. Stimulation of host DNA synthesis and induction of early antigens by ultraviolet light irradiated human cytomegalovirus. Arch, 1978,58:289-294.
[8]Francoise MJ, Jault JM, Ruchti F, et al. Cytomegalovirus infection induces high levels of cyclins, phosphorylated Rb, and P53, lesding to cell cycle arrest. J Virol, 1995, 69: 6697-6704.
[9]Kovacs A, Weber ML, Burns LJ, et al. Cytoplasmic sequestration of p53 in cytomegalovirus-infected human endothelial cells. Am J Pathol, 1996,149: 1531-1539.
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[10]Mansuo LU, Shenk T. Human cytomegalovirus infection inhibits cell cycle progression at multiple points, including the transition from G1 to S.J Virol, 1966, 70:8850-8859.
[11]Sathind AR, McCrthy Do, Nichols JE, et al. Interleukin-1-inhibitor activity induced by respiratory syncytial virus: abrogation of virus-specific and alternate human lymphocyte proliferative responeses. J Infect Dis, 1991, 163:71-80.
收稿日期：1999-05-07, 百拇医药