一例阵发性睡眠性血红蛋白尿病人TCR Vβ亚家族T细胞的优势表达和寡克隆性
作者：李扬秋 祁明芳 罗更新 卢育洪 张涛 陈少华 杨力建 廖继东
单位：李扬秋 陈少华 杨力建 廖继东 广州暨南大学血液病研究室*
关键词：TCR Vβ基因；T细胞寡克隆；血红蛋白尿，阵发性睡眠性
临床血液学杂志990509 阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种获得性、克隆性的造血干细胞疾病。研究提示在早期的造血干细胞发生PIG-A基因突变〔1〕，该基因的突变与细胞膜糖基磷脂酰肌醇(GPI)蛋白的产生异常有关。有报道认为，GPI蛋白分子具有激活T细胞的能力。本文利用RT-PCR和基因扫描方法分析1例PNH病人TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性情况。
1 材料与方法
1.1 标本采集和处理 经血液学有关检查确诊的PNH 1例，正常人10例、T细胞株Molt-4和Jurkat作为对照。外周血单个核细胞分离、RNA提取并反转录合成cDNA均按常规方法进行。并以检测β2-微球蛋白基因确定cDNA的质量。
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1.2 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据Vβ 24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物〔2〕。引物由德国柏林TIB公司合成。每一标本分别以一Vβ(1～24)与Cβ引物共进行24次PCR检测。PCR操作按已报道方法进行〔2～4〕。
1.3 T细胞克隆性分析 ①标记PCR产物(runoff reaction):采用一荧光素标记引物Cβ-Fam(位于Cβ内侧)进行不对称PCR扩增，将首次PCR产物标上荧光素(fam)，操作按已报道方法进行〔3，4〕。②基因扫描(Genescan)分析：经荧光素(fam)标记的产物在自动序列分析仪(373ADNA序列仪，ABI，Perkin Elmer公司)中，于6%聚丙酰胺凝胶中电泳，通过分析软件672，即基因扫描(genescan)分析电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰，确定产物的大小和含量；而峰的形态提示产物的均一性(即克隆性)，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，在电泳过程中，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头所显示的结果为一单峰图象，即提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞(即单克隆的细胞)；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性。有关操作步骤按使用指南进行〔3，4〕。
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2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果 正常人外周血表达几乎全部的Vβ亚家族T细胞：Molt-4仅表达Vβ2、Jurkat仅表达Vβ8T细胞〔3，4〕，病人分别表达Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ12、Vβ13、Vβ16和Vβ18等8个亚家族T细胞。
2.2 基因扫描分析结果 正常人所有PCR产物均呈多峰图象，提示为多克隆性；T细胞株的产物则为单克隆性〔3，4〕；而病人的Vβ1家族的PCR产物呈寡克隆性，其它的产物均提示为多克隆性。
3 讨论
利用TCR基因的V、D和J区重排时所构成的高度多样性区(互补决定区3，CDR3)和Vβ基因谱系(24个亚家族)的特点，分析各VβT细胞的分布和克隆性，已是近年国外常用于肿瘤和免疫性疾病的研究方法，借此更深入地了解病人的细胞免疫功能状态〔2～5〕。正常人TCR Vβ基因谱系表达为多家族和多克隆性，即为非特异性的表现〔3，4〕。而某些特异性抗原刺激(如病毒、肿瘤细胞相关抗原等)可诱发机体某些TCR Vβ基因谱系被优势利用或者出现克隆性T细胞，该检测方法给予一些未能明确抗原的疾病如肿瘤和免疫性疾病等等提供了新的研究手段。有关PNH病人T细胞功能改变的研究甚少，有报道病人GPI蛋白分子与淋巴细胞亚群分布和T细胞的活化有关〔6〕，而从TCR基因分析PNH则未见报道。我们分析1例PNH病人TCR Vβ亚家族基因分布情况，首次发现PNH的T细胞亚家族分布存在倾斜性和寡克隆性。倾斜性表现在仅表达8个Vβ亚家族的T细胞，显示了其T细胞亚家族分布的不均匀性，即出现优势表达T细胞克隆；分析克隆性也发现其中病人的Vβ1家族出现了寡克隆性增殖的T细胞。目前的观点认为，选择性表达和寡克隆性增殖TCR VβT细胞的出现，在肿瘤病人可能是机体对肿
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瘤细胞相关抗原的一种反应〔2～4〕；而在免疫性疾病病人则是由于自身存在一些异常抗原对机体的刺激作用而引起机体相应的细胞免疫反应〔5〕。而在PNH病人所发现的这种T细胞亚家族表达的倾斜性和克隆性改变的特点，也可能与机体所出现的异常干细胞或存在相关的异常抗原有关，它是否与GPI蛋白有关以及它与该病的关系尚不清楚。由于病例少，对其临床意义及其进一步的应用价值，有待继续研究。
*邮政编码：广州市，510632
祁明芳 罗更新 卢育洪 张涛广州暨南大学第一附属医院血液科
参考文献
[1] Nafa K,Bessler M,Castro-Malaspina H,et al.The spectrum of somatic mutations in the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria includes large deletions and small duplications.Blood Cells Mol Dis,1998,24:370～384
, http://www.100md.com
[2] Puiseux I,Even J,Pannetier C,et al.Oligoclonality of tumor-infiltrating lymphocytes from human melano-mas.J Immunol,1994,153:2807～2818
[3] 李扬秋，汪明春，Siegert W,et al.利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族CDR3长度的方法检测AML的T细胞克隆性.肿瘤，1997，17：435～438
[4] 李扬秋、杜欣、汪明春，等.用RT-PCR和Genescan分析CML急变期病人TCR VβT细胞的表达和克隆性.临床血液学杂志，1998，11：98～101
[5] Lim A,Toubert A,Pannetier C,et al.Spread of clonal T-cell expansions in rheumatoid arthritis patients.Human immunol,1996,48:77～83
[6] Richards SJ,Norfolk DR,Swirsky DM,et al.Lymphocyte subset analysis and glycosylphospha-tidylinositol phenotype in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.Blood,1998,92:1799～1806
1998-12-10 收稿, 百拇医药
单位：李扬秋 陈少华 杨力建 廖继东 广州暨南大学血液病研究室*
关键词：TCR Vβ基因；T细胞寡克隆；血红蛋白尿，阵发性睡眠性
临床血液学杂志990509 阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种获得性、克隆性的造血干细胞疾病。研究提示在早期的造血干细胞发生PIG-A基因突变〔1〕，该基因的突变与细胞膜糖基磷脂酰肌醇(GPI)蛋白的产生异常有关。有报道认为，GPI蛋白分子具有激活T细胞的能力。本文利用RT-PCR和基因扫描方法分析1例PNH病人TCR Vβ亚家族T细胞的表达和克隆性情况。
1 材料与方法
1.1 标本采集和处理 经血液学有关检查确诊的PNH 1例，正常人10例、T细胞株Molt-4和Jurkat作为对照。外周血单个核细胞分离、RNA提取并反转录合成cDNA均按常规方法进行。并以检测β2-微球蛋白基因确定cDNA的质量。
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1.2 反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据Vβ 24个亚家族基因设计相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物〔2〕。引物由德国柏林TIB公司合成。每一标本分别以一Vβ(1～24)与Cβ引物共进行24次PCR检测。PCR操作按已报道方法进行〔2～4〕。
1.3 T细胞克隆性分析 ①标记PCR产物(runoff reaction):采用一荧光素标记引物Cβ-Fam(位于Cβ内侧)进行不对称PCR扩增，将首次PCR产物标上荧光素(fam)，操作按已报道方法进行〔3，4〕。②基因扫描(Genescan)分析：经荧光素(fam)标记的产物在自动序列分析仪(373ADNA序列仪，ABI，Perkin Elmer公司)中，于6%聚丙酰胺凝胶中电泳，通过分析软件672，即基因扫描(genescan)分析电泳过程中所收集的不同位置和高度的峰，确定产物的大小和含量；而峰的形态提示产物的均一性(即克隆性)，当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致时，在电泳过程中，其迁移率完全相同，故在同一时间点通过扫描探头所显示的结果为一单峰图象，即提示为PCR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞(即单克隆的细胞)；而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性。有关操作步骤按使用指南进行〔3，4〕。
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2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果 正常人外周血表达几乎全部的Vβ亚家族T细胞：Molt-4仅表达Vβ2、Jurkat仅表达Vβ8T细胞〔3，4〕，病人分别表达Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ12、Vβ13、Vβ16和Vβ18等8个亚家族T细胞。
2.2 基因扫描分析结果 正常人所有PCR产物均呈多峰图象，提示为多克隆性；T细胞株的产物则为单克隆性〔3，4〕；而病人的Vβ1家族的PCR产物呈寡克隆性，其它的产物均提示为多克隆性。
3 讨论
利用TCR基因的V、D和J区重排时所构成的高度多样性区(互补决定区3，CDR3)和Vβ基因谱系(24个亚家族)的特点，分析各VβT细胞的分布和克隆性，已是近年国外常用于肿瘤和免疫性疾病的研究方法，借此更深入地了解病人的细胞免疫功能状态〔2～5〕。正常人TCR Vβ基因谱系表达为多家族和多克隆性，即为非特异性的表现〔3，4〕。而某些特异性抗原刺激(如病毒、肿瘤细胞相关抗原等)可诱发机体某些TCR Vβ基因谱系被优势利用或者出现克隆性T细胞，该检测方法给予一些未能明确抗原的疾病如肿瘤和免疫性疾病等等提供了新的研究手段。有关PNH病人T细胞功能改变的研究甚少，有报道病人GPI蛋白分子与淋巴细胞亚群分布和T细胞的活化有关〔6〕，而从TCR基因分析PNH则未见报道。我们分析1例PNH病人TCR Vβ亚家族基因分布情况，首次发现PNH的T细胞亚家族分布存在倾斜性和寡克隆性。倾斜性表现在仅表达8个Vβ亚家族的T细胞，显示了其T细胞亚家族分布的不均匀性，即出现优势表达T细胞克隆；分析克隆性也发现其中病人的Vβ1家族出现了寡克隆性增殖的T细胞。目前的观点认为，选择性表达和寡克隆性增殖TCR VβT细胞的出现，在肿瘤病人可能是机体对肿
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瘤细胞相关抗原的一种反应〔2～4〕；而在免疫性疾病病人则是由于自身存在一些异常抗原对机体的刺激作用而引起机体相应的细胞免疫反应〔5〕。而在PNH病人所发现的这种T细胞亚家族表达的倾斜性和克隆性改变的特点，也可能与机体所出现的异常干细胞或存在相关的异常抗原有关，它是否与GPI蛋白有关以及它与该病的关系尚不清楚。由于病例少，对其临床意义及其进一步的应用价值，有待继续研究。
*邮政编码：广州市，510632
祁明芳 罗更新 卢育洪 张涛广州暨南大学第一附属医院血液科
参考文献
[1] Nafa K,Bessler M,Castro-Malaspina H,et al.The spectrum of somatic mutations in the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria includes large deletions and small duplications.Blood Cells Mol Dis,1998,24:370～384
, http://www.100md.com
[2] Puiseux I,Even J,Pannetier C,et al.Oligoclonality of tumor-infiltrating lymphocytes from human melano-mas.J Immunol,1994,153:2807～2818
[3] 李扬秋，汪明春，Siegert W,et al.利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族CDR3长度的方法检测AML的T细胞克隆性.肿瘤，1997，17：435～438
[4] 李扬秋、杜欣、汪明春，等.用RT-PCR和Genescan分析CML急变期病人TCR VβT细胞的表达和克隆性.临床血液学杂志，1998，11：98～101
[5] Lim A,Toubert A,Pannetier C,et al.Spread of clonal T-cell expansions in rheumatoid arthritis patients.Human immunol,1996,48:77～83
[6] Richards SJ,Norfolk DR,Swirsky DM,et al.Lymphocyte subset analysis and glycosylphospha-tidylinositol phenotype in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.Blood,1998,92:1799～1806
1998-12-10 收稿, 百拇医药