超抗原诱导细胞毒性T淋巴细胞抗膀胱肿瘤效应的研究
作者：韩丛辉 郑宝钟 田军 徐中华 刘照旭 玄绪军 周尊林 崔先泉
单位：山东医科大学附属医院泌尿外科济南，250012
关键词：超抗原；膀胱肿瘤；T淋巴细胞；细胞毒性
临床泌尿外科杂志000612 摘要 目的：研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对淋巴细胞激活、增殖的作用及对E-J膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者的T淋巴细胞，加SEA培养使其活化增殖，用MTT显色法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞增殖动力学及对E-J膀胱肿瘤细胞体外抗肿瘤的作用。结果：T淋巴细胞在培养48 h后大量增殖，96 h达顶峰，与对照组比较具极显著性差异(P<0.01)；增殖后的CTL细胞对E-J膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：超抗原作为一种新型的、高效的抗肿瘤生物制剂，有明显的抑癌效应。
Superantigen-induce cytotoxic T lymphocytes suppress growth of bladder carcinoma cells
, http://www.100md.com
HAN Cong-hui ZHENG Bao-zhong TIAN Jun XU Zong-hua
LIU Zhao-xu XUAN Xu-jun ZHOU Zun-lin CUI Xian-quan
(Department of Urology,the Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan,250012)
Abstract Purpose:To investigate the proliferation of cytotoxic T lymphocytes(CTL) induced by superantigen SEA and their anti-tumor effects on EJ bladder carcinoma cells in vitro.Methods:CTL were generated by culturing T cells stimulated by SEA.Proliferation and cytotoxic effect of CTL on bladder carinoma cells were measured by MTT assays.Results:Cytotoxic T cell had begun prolicferation after 48 hours stimutated by SEA,Peak proliferation were observed in 96 hours,P<0.01 as compared with medium,CTL had highly cytotoxicity against bladder caricnoma cells in vitro.Conclusions:The results indicates that superantigen has high effects on suppressing bladder-tumor cells grouth in vitro.
, 百拇医药
Key words Superantigen Bladder tumor T-Lymphocytes,cytotoxic
超抗原是一种新型的蛋白质分子，具有多种免疫活性，能激活比普通抗原多达数千倍的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，并分泌多种足量的细胞因子，对肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。而细胞免疫功能低下是肿瘤产生的主要原因之一。本文通过研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对体外培养的膀胱肿瘤细胞的杀伤作用，以了解其抗肿瘤效果。现将研究情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SEA冻干粉剂1 ml/瓶(军事医学科学院微生物流行病研究所产品)、E-J膀胱肿瘤细胞(由北京医科大学泌尿外科研究所惠赠)及MTT试剂(购自Sigma公司)，将MTT试剂配制成5 g/L浓度待用。
, http://www.100md.com
1.2 淋巴细胞制备
抽取正常青年男性外周血10 ml，经淋巴细胞分离液常规分离后，取淋巴细胞悬液待用。本实验设反应组和对照组。
1.3 测定方法
SEA刺激淋巴细胞增殖反应的测定：反应组按Mosman〔1〕报告的方法，将10 ng/L的SEA与每孔2×105淋巴细胞混合培养于96孔板中。对照组加等量的1640液。取不同培养时间的细胞经MTT染色后，在570 nm波长下测定OD值。
SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞杀伤效应的测定：用不同浓度的SEA激活分离的淋巴细胞24 h后，加入E-J膀胱肿瘤细胞(1×104/孔)，使E∶T(效∶靶)分别为2.5∶1和5∶1。对照组加入等量1640液72 h后，加入20 μl MTT试剂。两组再培养4 h后吸去上清液，加二甲基亚砜150 μl/孔，充分振荡后测定OD值。按以下公式计算细胞死亡率：
, 百拇医药
细胞死亡率=(1-(实验组OD值)/(对照组OD值))×100%
1.4 统计学处理
采用组间t检验。
2 结果
SEA刺激淋巴细胞增殖结果见图1。
图1 SEA刺激淋巴细胞增殖的动力学
从图1可以看出，10 ng/L的SEA与2×105/孔的淋巴细胞共同培养48 h后开始增殖，96 h达高峰，之后开始下降。反应组与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞的杀伤效应见图2。
, 百拇医药
图2 SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞的杀伤效应
从图2可以看出，经SEA诱导后的细胞毒T淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞有明显的杀伤作用，在E∶T=5∶1、SEA为1 μg/L时，肿瘤细胞死亡率最高，达85%。反应组与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
3 讨论
机体免疫功能下降是肿瘤发病的最主要病因之一，而抗肿瘤免疫主要是细胞免疫。超抗原是一种新型蛋白质分子，可激活比普通抗原多达数千仍至数万倍的CTL，促使活化的T细胞分泌多种足量的细胞因子，如TNF-α、TNF-β、TNF-、IL-2及IL-6等〔2～5〕，直接或间接的杀伤肿瘤细胞。国外学者实验显示，用SEA刺激培养人的外周血单核细胞(PBMC)3 d，可使后者产生强大的杀伤肿瘤细胞的作用，在效应细胞与靶细胞之比低至2.5∶1时，其诱发抗肿瘤作用的最低浓度仅为10 ng/L，而半数最大抗肿瘤作用的浓度也只需100 ng/L〔6〕。1992年Hansson等〔7〕的动物实验显示，SEA能在注入小鼠腹腔后激活大量的CTL细胞，杀伤MHC-Ⅱ类分子阳性肿瘤。他由此推断腹腔内如局部注射超抗原可治疗腹腔器官肿瘤。国内学者实验亦证实经SEA诱导的T淋巴细胞对肝癌、胃癌细胞有较强的杀伤作用〔8〕。
, http://www.100md.com
本研究显示，经SEA刺激后48 h，T淋巴细胞开始增殖，96 h即达效应最强水平，扩增近10倍，其活化产生的CTL细胞对E-J膀胱肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。在E∶T为5∶1、SEA刺激剂量仅为1 μg/L时，E-J肿瘤细胞死亡率即高达85%，表明超抗原作为一种新型的、高效的抗肿瘤生物制剂，有明显的抑癌效应，为超抗原应用于膀胱肿瘤动物模型，从而进一步应用于临床提供了一定的实验依据。
(本研究得到北京医科大学泌尿外科研究所俞莉章教授的热情帮助和指导，在此表示衷心的感谢!)
(编辑 王铨)
本课题为山东省卫生厅资助项目
参考文献
[1]Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and surrival capplication to proliferation and cytoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55～59
, 百拇医药
[2]Hedlund G,Dohlsten M,Petrsson C,et al.Superan-tigon-based tumor therapy in vivo activation of cytotoxic T cell.Cancer Immunol Immunother,1993,36:89～74
[3]Kuge S,Miura Y,Makamura Y,et al.Superantigen induced human CD+4 helper/killer cell and application to tumor immunothrapy.J Immunol,1995,154:1775～1779
[4]DoHlsten M,Lando P A,Hedlund G,et al.Targeting of human cytotoxic T lymphocytes to MHC class Ⅱ-expressing cell by staphylococcal enterotoxins.Immunology,1990,71:96～100
, http://www.100md.com
[5]Dohlsten M,Sundstedt A,Bjorklund M,et al.Superantigen-induce cytokines suppress grouth of human colon-carcinoma cells.Int J Cancer,1993,54:482～487
[6]Lando P,Hedund G,Dohlston M,et al.Bacterial superantigens as anti-tumor agents:Induction of tumor cytotoxicity in human lymphocytes by staphococcal enterotoxion.Cancer Immunol Immunother,1991,33:231～235
[7]Hansson J,Ericsson P O,Dohlsten M,et al.Locally superantigen-activated perictoneal cytolytic T lympho-cytes belong to the CD+8 CD45RC-subset and lyse MHC class Ⅱ tumor cells.Immunol Letter,1992,34:229～233
[8]许树旭，沈敬华.超抗原诱导肝癌患者外周单个核细胞产生细胞因子及抗肿瘤作用研究.中国实验临床免疫学杂志，1998，10：271～273
(收稿 1999-05-07), 百拇医药
单位：山东医科大学附属医院泌尿外科济南，250012
关键词：超抗原；膀胱肿瘤；T淋巴细胞；细胞毒性
临床泌尿外科杂志000612 摘要 目的：研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对淋巴细胞激活、增殖的作用及对E-J膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者的T淋巴细胞，加SEA培养使其活化增殖，用MTT显色法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞增殖动力学及对E-J膀胱肿瘤细胞体外抗肿瘤的作用。结果：T淋巴细胞在培养48 h后大量增殖，96 h达顶峰，与对照组比较具极显著性差异(P<0.01)；增殖后的CTL细胞对E-J膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：超抗原作为一种新型的、高效的抗肿瘤生物制剂，有明显的抑癌效应。
Superantigen-induce cytotoxic T lymphocytes suppress growth of bladder carcinoma cells
, http://www.100md.com
HAN Cong-hui ZHENG Bao-zhong TIAN Jun XU Zong-hua
LIU Zhao-xu XUAN Xu-jun ZHOU Zun-lin CUI Xian-quan
(Department of Urology,the Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan,250012)
Abstract Purpose:To investigate the proliferation of cytotoxic T lymphocytes(CTL) induced by superantigen SEA and their anti-tumor effects on EJ bladder carcinoma cells in vitro.Methods:CTL were generated by culturing T cells stimulated by SEA.Proliferation and cytotoxic effect of CTL on bladder carinoma cells were measured by MTT assays.Results:Cytotoxic T cell had begun prolicferation after 48 hours stimutated by SEA,Peak proliferation were observed in 96 hours,P<0.01 as compared with medium,CTL had highly cytotoxicity against bladder caricnoma cells in vitro.Conclusions:The results indicates that superantigen has high effects on suppressing bladder-tumor cells grouth in vitro.
, 百拇医药
Key words Superantigen Bladder tumor T-Lymphocytes,cytotoxic
超抗原是一种新型的蛋白质分子，具有多种免疫活性，能激活比普通抗原多达数千倍的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，并分泌多种足量的细胞因子，对肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。而细胞免疫功能低下是肿瘤产生的主要原因之一。本文通过研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对体外培养的膀胱肿瘤细胞的杀伤作用，以了解其抗肿瘤效果。现将研究情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SEA冻干粉剂1 ml/瓶(军事医学科学院微生物流行病研究所产品)、E-J膀胱肿瘤细胞(由北京医科大学泌尿外科研究所惠赠)及MTT试剂(购自Sigma公司)，将MTT试剂配制成5 g/L浓度待用。
, http://www.100md.com
1.2 淋巴细胞制备
抽取正常青年男性外周血10 ml，经淋巴细胞分离液常规分离后，取淋巴细胞悬液待用。本实验设反应组和对照组。
1.3 测定方法
SEA刺激淋巴细胞增殖反应的测定：反应组按Mosman〔1〕报告的方法，将10 ng/L的SEA与每孔2×105淋巴细胞混合培养于96孔板中。对照组加等量的1640液。取不同培养时间的细胞经MTT染色后，在570 nm波长下测定OD值。
SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞杀伤效应的测定：用不同浓度的SEA激活分离的淋巴细胞24 h后，加入E-J膀胱肿瘤细胞(1×104/孔)，使E∶T(效∶靶)分别为2.5∶1和5∶1。对照组加入等量1640液72 h后，加入20 μl MTT试剂。两组再培养4 h后吸去上清液，加二甲基亚砜150 μl/孔，充分振荡后测定OD值。按以下公式计算细胞死亡率：
, 百拇医药
细胞死亡率=(1-(实验组OD值)/(对照组OD值))×100%
1.4 统计学处理
采用组间t检验。
2 结果
SEA刺激淋巴细胞增殖结果见图1。
图1 SEA刺激淋巴细胞增殖的动力学
从图1可以看出，10 ng/L的SEA与2×105/孔的淋巴细胞共同培养48 h后开始增殖，96 h达高峰，之后开始下降。反应组与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞的杀伤效应见图2。
, 百拇医药
图2 SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞的杀伤效应
从图2可以看出，经SEA诱导后的细胞毒T淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞有明显的杀伤作用，在E∶T=5∶1、SEA为1 μg/L时，肿瘤细胞死亡率最高，达85%。反应组与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
3 讨论
机体免疫功能下降是肿瘤发病的最主要病因之一，而抗肿瘤免疫主要是细胞免疫。超抗原是一种新型蛋白质分子，可激活比普通抗原多达数千仍至数万倍的CTL，促使活化的T细胞分泌多种足量的细胞因子，如TNF-α、TNF-β、TNF-、IL-2及IL-6等〔2～5〕，直接或间接的杀伤肿瘤细胞。国外学者实验显示，用SEA刺激培养人的外周血单核细胞(PBMC)3 d，可使后者产生强大的杀伤肿瘤细胞的作用，在效应细胞与靶细胞之比低至2.5∶1时，其诱发抗肿瘤作用的最低浓度仅为10 ng/L，而半数最大抗肿瘤作用的浓度也只需100 ng/L〔6〕。1992年Hansson等〔7〕的动物实验显示，SEA能在注入小鼠腹腔后激活大量的CTL细胞，杀伤MHC-Ⅱ类分子阳性肿瘤。他由此推断腹腔内如局部注射超抗原可治疗腹腔器官肿瘤。国内学者实验亦证实经SEA诱导的T淋巴细胞对肝癌、胃癌细胞有较强的杀伤作用〔8〕。
, http://www.100md.com
本研究显示，经SEA刺激后48 h，T淋巴细胞开始增殖，96 h即达效应最强水平，扩增近10倍，其活化产生的CTL细胞对E-J膀胱肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。在E∶T为5∶1、SEA刺激剂量仅为1 μg/L时，E-J肿瘤细胞死亡率即高达85%，表明超抗原作为一种新型的、高效的抗肿瘤生物制剂，有明显的抑癌效应，为超抗原应用于膀胱肿瘤动物模型，从而进一步应用于临床提供了一定的实验依据。
(本研究得到北京医科大学泌尿外科研究所俞莉章教授的热情帮助和指导，在此表示衷心的感谢!)
(编辑 王铨)
本课题为山东省卫生厅资助项目
参考文献
[1]Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and surrival capplication to proliferation and cytoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65:55～59
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, http://www.100md.com
[5]Dohlsten M,Sundstedt A,Bjorklund M,et al.Superantigen-induce cytokines suppress grouth of human colon-carcinoma cells.Int J Cancer,1993,54:482～487
[6]Lando P,Hedund G,Dohlston M,et al.Bacterial superantigens as anti-tumor agents:Induction of tumor cytotoxicity in human lymphocytes by staphococcal enterotoxion.Cancer Immunol Immunother,1991,33:231～235
[7]Hansson J,Ericsson P O,Dohlsten M,et al.Locally superantigen-activated perictoneal cytolytic T lympho-cytes belong to the CD+8 CD45RC-subset and lyse MHC class Ⅱ tumor cells.Immunol Letter,1992,34:229～233
[8]许树旭，沈敬华.超抗原诱导肝癌患者外周单个核细胞产生细胞因子及抗肿瘤作用研究.中国实验临床免疫学杂志，1998，10：271～273
(收稿 1999-05-07), 百拇医药