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编号:10290036
缺血心肌β受体脱敏现象及机制探讨
http://www.100md.com 《中山大学学报(医学科学版)》 2000年第0期
     作者:唐铁军 吴伟康 别平华 卢汉平 刘秀琴

    单位:唐铁军 吴伟康(中山医科大学中西医结合研究所);别平华(中山医科大学第一军医大学微生物学教研室, 广东 广州 510515);卢汉平 刘秀琴(中山医科大学放免检测中心, 广东 广州 510089)

    关键词:心肌缺血;受体;肾上腺素能β1;脱敏;β1肾上腺素能受体激酶

    00zk15摘 要:【目的】 观察心肌缺血状态下β1肾上腺素能受体(β1-AR)脱敏现象,探讨其脱敏的机制。【方法】 用大剂量垂体后叶素(Pit)造成大鼠心肌缺血,采用放射配基受体结合分析测定心肌细胞膜β1-AR密度,放免测定大鼠外周血及心肌组织中cAMP水平,定量RT-PCR方法测定β1-AR及β1-AR激酶(βARK-1)mRNA的表达。【结果】 心肌缺血时β1-AR密度上调,但亲和力下降,血浆及心肌cAMP水平低于正常组(P<0.01或P<0.05),βARK-1 mRNA表达明显增加(P<0.01)。【结论】 心肌缺血时β-AR数目和功能存在分离现象,这种现象是β-AR脱敏而引起的,其脱敏的机制与β-ARK1 mRNA表达增加有关。
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    中图分类号: R541.402 文献标识码:A

    文章编号:1000-257(2000)04S0-0053-03

    Desensitization of β-adrenoceptor During Myocardial Ischemia

    and Mechanism Investigation

    TANG Tie-jun, WU Wei-kang

    ( Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)

    LU Han-ping, LIU Xiu-qing
, 百拇医药
    (Radioimmunoassay Center of SUMS. Guangzhou, 510089,China.)

    BIE Ping-hua

    (Department of Microbiology, the First Military Medical University, Guangzhou, 510515, China)

    Abstract: 【Objective】 To investigate the mechanism of desensitization of β1-adrenoceptor(β1-AR) during myocardial ischemia. 【Methods】 Myocardial ischemia models of rats were induced by given a booster doses of pituitrin. The density of β1-AR on cardiac membranes was detected by radioligand binding assay. The cAMP levels of plasma and myocardium were detected by radioimmunoassay. The mRNA expression of β-AR and β-adrenoceptor kinase (β-ARK) were detected by RT-PCR assay. 【Results】 In cardiac membranes of ischemic myocardium the density of β-AR were increased but the affinity were decreased. The cAMP levels in plasma and myocardium of myocardial ischemia group were lower than control group(P<0.01 or P<0.05). The mRNA expression of β ARK-1 were significantly increased in the ischemic group. 【Conclusion】 There is a division tendency between the amount and function of β1-AR during myocardial ischemia. It is caused by the desensitization of β1-AR. The mechanism of desensitization is due to the increasing of mRNA expression of β ARK-1.
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    Key words: myocardial ischemia; receptors, adrenergic, beta-1; desensitization ; beta-adrenoceptor kinase

    心肌缺血(myocardial ischemia, MI)是所有缺血性心脏病的病理基础,其病理生理机制十分复杂。近年来研究发现肾上腺素能β受体(β-AR)在MI过程中起到重要作用[1~3]。分布于心脏和冠状血管的β1-AR兴奋,可以直接扩张冠状动脉,改善心肌供血。因此,探讨在MI状态下β-AR信号转导改变对MI病理生理的认识具有重要意义。本研究采用垂体后叶素(pituitrin, Pit)造成大鼠MI模型,测定大鼠心肌细胞膜β1-AR的密度、受体的亲和力、血浆及心肌组织中cAMP含量、β1-AR mRNA表达、β1-AR激酶(β ARK-1)mRNA表达,以了解缺血心肌β1-AR信号转导机制的变化,报告如下。
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    1 材料与方法

    1.1 实验动物及分组

    Wistar大鼠20只,雌雄不拘,180~200 g,由广东省医学实验动物研究中心提供,分为缺血组及正常组,每组10只。

    1.2 缺血造模

    缺血组:给予Pit 10 U/kg,皮下注射,造成心肌缺血。正常组:相同途径给予同剂量的生理盐水。造模后24 h,眶动静脉丛取血1.5 mL,加5%(v/v) EDTA抗凝,离心分离血浆, 处死动物无菌条件下迅速取心肌组织液氮冻存,用于mRNA提取,或即刻匀浆用于β1-AR密度及cAMP检测。

    1.3 β1-AR密度检测

    采用放射配基受体结合实验方法,高速离心(27 000 g,40 min,4℃)制备心肌细胞膜悬液,以Lowry氏法测定蛋白浓度,用纯度>98%的3H-双氢心得舒(中国原子能科学研究院提供)为放射标记配基,以dL-心得安为非标记配基,作多点饱和分析,Scatchard作图,求得出最大结合位点数(密度,Bmax)及平衡解离常数(亲和力,Kd)。
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    1.4 cAMP检测

    采用125I标记放免检测法,测定血清及心肌组织cAMP含量,放免试剂盒为上海中医药大学同位素室产品,具体操作按试剂盒说明进行。

    1.5 引物设计及合成

    通过GeneBank检索获得大鼠β1-AR mRNA(1 365 bp)、β ARK-1 mRNA(4 190 bp)及β-Actin(325 bp)全序列,用美国Primer 2.2版引物设计软件自行设计3对引物,其引物序列如下:β1-AR:5′-AGCTA CCAGG AACCA TGCAC-3′,5′-CCTCC TACCG CGATT GAA-3′;β ARK-1:5′-ATGAG AAGCT GGAGA CGGAG-3′,5′-CCGAT GATTC GATGC ACAC-3′;β-Actin:5′-CATCG TACTC CTGCT TGCTG-3′,5′-GGCTC CTAGC ACCAT GAAGA-3′。以上引物委托上海生物工程公司合成,PAGE纯化,纯度为99%。扩增片断分别为288 bp,319 bp, 131 bp。
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    1.6 β1-AR及βARK-1 mRNA检测

    采用定量RT-PCR方法检测,组织RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒均为德国Boehringer Mannheim 公司产品,心肌组织总RNA提取按试剂盒说明进行,在含有C.therm.聚合酶的50 μL反应体系中一步完成RT-PCR反应,温度条件设置为94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、70 ℃ 45 s,共循环33次。于第10个循环以后每个循环的延伸时间在前一个循环的基础上增加5 s,最后一个循环结束后,继续72 ℃延伸7 min,结束反应。采用2 g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物,电泳条件为60 V,45 min,电泳结束后将凝胶放入EB染液中染色40 min,在凝胶成象及分析系统(UVP公司GDS7500型产品)下观察并成像如图。根据样本条带的灰度值推算出各样本的含量,计算公式如下:
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    1.7 数据处理方法

    受体结合实验数据用LIGAND受体分析软件处理, Scatchard作图,求得出各样本的受体结合参数Bmax和Kd值。统计学处理用SPSS 8.0版统计软件在微机上进行t检验统计处理。

    2 结 果

    心肌细胞膜β-AR的Bmax及Kd缺血组均高于正常组(P<0.01或P<0.05),说明缺血时β-AR密度增加,但与配体的亲和力下降。见表1。血浆及心肌组织的cAMP水平缺血组均低于正常组(P<0.01或P<0.05)见表2。

    表1 各组大鼠心肌细胞膜β受体Bmax及Kd

    Table 1 Bmax and Kd value of cardiac membraneson each group (±s) Group
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    n

    Bmax(fmol/mg)

    Kd

    Normal

    10

    32.26±3.69

    0.22±0.01

    Ischemia

    10

    39.80±8.53 2)

    0.27±0.03 1)
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    Compared with normal: 1) P<0.05,2) P<0.01

    缺血组β1-AR mRNA表达与正常组比较无显著差异(P>0.05),β ARK-1 mRNA表达高于正常组(P<0.01),见表3。琼脂糖凝胶电泳图见图1。

    表2 各组大鼠血浆及心肌cAMP含量

    Table 2 cAMP level in plasma and myocardium (±s) Group

    n

    Plasma(pmol/ml)

    Myocardium(pmol/g)
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    Normal

    10

    30.10±4.45

    887.71±102.93

    Ischemia

    10

    23.63±5.57 1)

    767.93±143.52 2)

    Compared with normal: 1) P<0.01, 2) P<0.05表3 大鼠心肌β1-AR 及β ARK-1 mRNA的表达

    Table 3 β1-AR & β ARK-1 mRNA expression in rat myocardium(ng, ±s) Group
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    n

    β1-AR mRNA

    β ARK-1 mRNA

    Normal

    5

    19.84±2.79

    15.97±2.91

    Ischemia

    5

    21.14±3.83

    42.07±3.29 1)

, 百拇医药     Compared with normal: 1) P<0.01

    图1 各组琼脂糖凝胶电泳图

    Fig.1 Agarose gel electrophoresis of each group

    1: normal group β1-AR, 2: ischemic group β1-AR, 3: normal group β ARK-1, 4: ischemic group β ARK-1, M: Marker

    3 讨 论

    随着分子心血管病学的发展,近年来对MI的分子机制的认识许多国内外学者认为与β-AR及其信号转导有密切关系[1~3], β-AR属于G蛋白偶联受体,有3种亚型,分布于心脏和血管平滑肌的主要是β1-AR[4,5]
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    Ungerer等[6]采用大鼠离体心脏Langendoff灌流MI模型,观察到β1-AR在数量与功能的分离现象,这一现象是由于β1-AR脱敏而引起的,关于β1-AR脱敏的机制, 目前认为最主要的是由于β ARK-1 使激动剂占据的活性受体磷酸化, 磷酸化的β1-AR尚失了激活AC-c-AMP等第二信使的能力, 由此使β1-AR功能的70%被抑制[7],最近的研究表明, 在β ARK-1过度表达的转基因小鼠体内, 其心肌收缩力显著的减弱, 反之, β ARK-1抑制蛋白的过度表达, 则可增强心肌收缩力[8],β ARK-1抑制剂可以恢复心肌脱敏的β-AR的信号传递[9],由此可见, β ARK-1在β-AR信号转导过程中起到十分重要的作用。

    目前国内外对缺血心肌β-AR脱敏的研究多数采用离体心脏灌流方法[6],或冠状动脉结扎法,尚无采用在体药物造模方法研究β-AR脱敏的报道,本研究采用Pit诱导冠脉痉挛,造成MI模型,其缺血效果明显[10],而且避免了结扎冠脉产生的创伤应激反应,去除了交感神经系统应激对β-AR的影响,发现大鼠缺血心肌细胞膜同样存在β1-AR密度上调,亲和力下降,其信号转导的第二信使cAMP水平下降,此现象产生的原因与β ARK-1过度表达有关,首次在Pit 所致的MI模型上证实了β-AR脱敏现象及其产生机制。
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    基金项目:中国博士后基金资助项目([1999]10);广东省中医药管理局基金资助项目(99564)

    作者简介:唐铁军(1962-),男,黑龙江牡丹江人,博士,副教授.

    参考文献:

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, 百拇医药
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, 百拇医药
    [7] Lohes M J, Andexinger S, Pitcher J, et al. Receptor-specific desensitization with purified proteins: kinase dependence and receptor- specificity of β- arrestin and arrestin in the β2-adrenergic receptor and rhodopsin systems [J]. J Biol Chem, 1992, 267: 8558.

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    [9] Akhter S, Skare C A, Kypson A P, et al. Restoration of beta-adrenergic signaling in failing cardiac ventricular myocytes via adenoviral-mediated gene transfer [J]. Proc Natl Acad Sci, 1997,94(22): 12100.

    [10] 唐铁军, 别平华, 陈镜合,等. 实验性冠心病大鼠模型的制作和应用 [J]. 国际心血管杂志, 1999,1(4): 318.

    收稿日期:2000-03-24, 百拇医药