腹腔注射LPS后大鼠脑内磷酸化p44/42 MAPK表达的变化
作者：王曦 王百忍 黄文晋 段小莉 鞠躬
单位：第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，西安710032
关键词：磷酸化的p44/42 MAPK；脂多糖(LPS)；脑；大鼠
解剖学报00zk13
【摘要】目的 研究腹腔注射LPS后大鼠脑内活化形式的细胞外信号 调节蛋白激酶(p44/42 MAPK)分布的变化。方法用免疫组织化学法。 结果 在隔外侧核、膈下丘脑核、视前区、杏仁中央核、尾侧海马 下丘脑 室旁核、视上核、乳头体上核、中央灰质腹外侧部、臂旁外侧核、蓝斑等阳性细胞数量增加 ，染色增强。结论 p44/42 MAPK的功能不仅与细胞的生长、分化 和神经元的可塑性变化有关，还可能与免疫刺激有关。
【中图分类号】R322.8 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-48
, 百拇医药
THE CHANGES OF THE EXPRESSION OF PHOSPHORYLATED-p44/42 MAPK IN RAT BRAIN AFTER INTRAPERITONEAL INJECTION OF LPS
WANG Xi，WANG Bai-ren，HUANG Wen-jin，DUAN Xiao-li，JU Gong*
(Department of Neuroimmunomodulation，Institute of Neuroscience，the F ourth Medical University，Xian 710032，China)
【Abstract】Objective To study the changes of the expressio n of phosphorylated-p44/42MAPK in rat brain after intraperitoneal injection of L P S.Method Immunohistochemical staining techniques were used,an d immunostained sections were observed and analyzed under a microscope. Results The expression of phosphorylated-p44/42MAPK increased in la teral septum，septohypothalamic nucleus，preoptic area，central nucleus of amygd ala，caudal hyppocampus，hypothalamus paraventricular nucleus，supraoptic nucleu s，supramammilary nucleus，ventrolateral part of periaqueductal gray，lateral pa rabranchial nucleus，locus nucleus，et al.Conclusion It sugge s ted that p44/42 MAPK is related with not only cellular growth，differentiation a nd plasticity of neuron but also immune stimuli probably.
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【key words】p44/42MAPK； LPS； Brain； Rat 近年来的研究表明，中枢神经系统可以接受免疫信息并参与对免疫反应的调节，但对于脑内 参与免疫反应的神经核团尚不清楚。在神经系统功能和形态相结合的研究中，既往应用较多 的是即刻早期基因c-fos，同时egr-1等也有应用。 虽 然不同的应激可引起脑内不同形式的即刻早期基因的表达，但是每种即刻早期基因在脑内的 表达均有一定的局限性。因此，需要结合多种标志物才能更全面地反映出参与免疫反应的脑 内神经核团的活动情况。本研究从信号转导分子的环节研究了免疫反应时神经核团的活动情 况。
细胞外信号调节蛋白激酶(p44/42 MAPK，即ERK1/ERK2)属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族 ，是一类重要的信号转导分子，它被激活成为磷酸化的p44/42 MAPK发挥作用，参与调节细 胞的有丝分裂和分化[1]，并在神经元和胶质细胞的信号传递中起着重要的作用。 我们[2]新近的研究发现，三叉神经脊束核尾侧亚核的p44/42 MAPK活性在面部伤害 性刺激时表达上调，在本研究中我们用免疫组织化学方法，研究了腹腔内给予免疫刺激剂脂 多糖(lipopolysacchride，LPS)后脑内磷酸化的p44/42 MAPK表达的变化。
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材料和方法
1. 动物准备和切片的制备
雄性SD大鼠8只，体重180～250g，随机分为2组：实验组4只，腹腔内注射LPS(500μg/kg；S igma公司；用生理盐水稀释为100mg/L)；对照组4只，每公斤体重腹腔内注射同体积的生理 盐水。3h后，1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射，麻醉后开胸，经心灌流，先用100ml生理盐 水快速灌注冲洗血液，然后用预冷的4%多聚甲醛固定液400ml灌流。待固定液滴注完毕，取 出全脑，用4%多聚甲醛后固定2h，再将脑放入20%蔗糖溶液，4℃过夜。组织块完全沉底后用 冰冻切片机连续冠状切片，每5张取1张，片厚50μm。
2.免疫组织化学染色
先将切片经0.01mol/L PBS漂洗5min×3次后，浸入80%甲醇和0.3%过氧化氢封闭30min，0 .01mol/L PBS漂洗10min×3次，再用1%牛血清白蛋白、3%羊血清和0.3% Triton X-100封 闭1h，同前漂洗过后，用ABC方法进行免疫组织化学染色：兔抗大鼠磷酸化p44/42 MAPK抗 体(1：500，NEB 公司)孵育切片，室温下36h，0.01mol/L PBS 漂洗10min×3次；生物素化 的羊抗兔IgG(1:500，Sigma公司)孵育切片，室温下4h，0.01mol/L PBS漂洗10min×3次 ；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC，1：500， Vector公司)孵育切片，室温2h ， 0.01mol/L PBS漂洗10min×3次；硫酸镍胺加强DAB蓝色反应呈色。当阳性产物呈深蓝色而 背底几乎无色时终止反应。经脱水、透明和封片后，镜检。
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部分切片用做免疫组织化学方法对照实验，一抗用牛血清白蛋白稀释液替代，二抗、ABC复 合物同其他免疫组织化学反应切片，结果未见阳性结构。
3.磷酸化p44/42 MAPK阳性细胞计数方法
根据核团的大小，取每只动物的每个核团相对应的典型平面1～2个，在10×20光镜下观察并 计数阳性细胞数 。该例动物该核团的平均数，即为该动物该核团的阳性细胞数；每组4个动物间取平均值， 即为该组动物该核团的阳性细胞数。采用t检验进行统计分析。
结 果
对实验组和对照组从延髓尾端到端脑的全脑切片进行了对比观察，阳性产物见于神经元的胞 浆、胞核和突起，存在于神经元的胞体、树突和轴突中的量明显多于细胞核中的量。在对照 组动物，活化的p44/42MAPK出现在许多核团，特别是在岛皮质、感觉运动皮质和视、听皮质 、海马内嗅区和背侧、腹侧下托，内侧杏仁核、皮质杏仁核和中介核，视交叉上核、下丘脑 室旁核大细胞部、弓状核、前腹侧视前核、外侧前核、乳头体上核和下丘脑后区、顶盖前区 、中央灰质腹外侧部、蓝斑、臂旁外侧核、小脑浦肯野细胞、A5区、旁巨细胞外侧 核、吻侧(C1区)和尾侧(A1区)延髓腹外侧网状结构等。
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实验组和对照组的不同点是，在某些脑区，磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应神经元的数量 及 阳性神经纤维的密度和长度发生改变。与对照组比较，实验组在外侧隔区(图1，2)、隔下丘 脑核、视前区(图3，4)、杏仁中央核(图5，6)、尾侧海马(图7，8)、下丘脑室旁核(图9，10 )、视上核(图11，12)、乳头体上核(图13，14)、中央灰质腹外侧部、外侧臂旁核、蓝斑(图 15，16)处阳性细胞数量增加、染色增强。数量比较见附表。
附表 实验组(n=4)和对照组(n =4)脑内部
分核团中磷酸化p44/42 MAPK阳性细胞计数
n=4)and experimental group(n=4) 核团名称
对照 组
实验组
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nuclei
control group
experimental group
外侧隔区
25±4
48±7a
(lateral septal region)
隔下丘脑核
31±9
76±13a
(septohypothalamic nucleus)
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视前区
18±3
45±7a
(preoptic region)
杏仁中央核
19±5
83±11a
(central amygdaloid nuclei)
尾侧海马
6±2
21±4a
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(caudal hippocampus)
下丘脑室旁核
69±0
120±19a
(hypothalamic paraventricular nucleus)
视上核后部
21±13
128±23a
(retrochiasmatic part of supraoptic nucleus)
乳头体上核
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38±8
126±31a
(supramammillary nucleus)
中央灰质腹外侧部
13±7
72±19a
(lateral ventral part of central gray)
外侧臂旁核
28±8
59±12a
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蓝斑
54±9
93±13a
(locus ceruleus)
a.与对照组相比P<0.05 a.P<0.05 vs.Contr ol group.
讨 论
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)属细胞内蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，是一类重要的接受 单次跨膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的信号转导分子，参与多种细胞功能的 调控。迄今为止，在MAPK家族中已有3个亚家族被描述，分别为p44/42 MAPK(ERK1/ERK2，细 胞外信号调节蛋白激酶)、JNK(c-junN末端蛋白激酶，也被称为SAPK，即应 急激活蛋白激酶)和p38 MAPK(也被称作HOG，即高渗透性甘油反应激酶。)生长因子和有丝分 裂信号通过Ras、Raf、MEK1/MEK2等一系列级连反应使p44/42 MAPK磷酸化，成为活化的p44/ 42 MAPK而发挥作用。
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p42/44 MAPK被激活后，既可以从胞浆进入胞核并作用于核蛋白如Elk1、c-myc和TAL1 [ 3，4]等转录因子，影响下游基因的表达，又可以在胞浆内作用于底物丝裂原活化蛋白- 2 (MAP2)[5]、突触素[6]、髓鞘碱性蛋白(MBP)[7]或细胞表面分子 如表皮生长因子受体[8]、磷脂酶A2[9]，并使底物磷酸化，影响细胞骨架 的重塑和突触形成。本实验中，我们发现活化的p44/42 MAPK存在于神经元的胞体、树突和 轴 突中的量明显多于细胞核中的量。虽然磷酸化的p44/42 MAPK可以从胞浆转移到核内，使核 内 的转录因子磷酸化，但是轴突和树突中的磷酸化的p44/42 MAPK距离细胞核较远，所以磷酸 化 的p44/42 MAPK更有可能作用于胞浆中的底物，比如MAP2、TAL、MBP和突触素，参与免疫应 激引起神经元功能代谢后发生的细胞骨架和突触的重塑。
本研究结果显示在对照组大鼠脑中，活化的p44/42 MAPK有广泛的表达，这提示了p44/42 MA PK在脑的众多功能的信号传导过程中的重要性。在我们以往的实验中，发现给予动物疼痛刺 激后，脑内三叉神经脊束核尾侧亚核磷酸化的p44/42 MAPK表达增高[2]，提示p44/ 42 MAPK的功能远不止以往文献中所提到的那些。因此，本研究中我们用免疫组织化学方法 ，观 察了腹腔内给予免疫刺激剂LPS后脑内磷酸化的p44/42 MAPK表达的变化，结果发现脑内磷酸 化的p44/42 MAPK表达增加。
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既往研究发现，损毁蓝斑和臂旁核等脑干结构均不同程度地影响免疫功能[10]；下 丘脑一直被认为是神经-内分泌-免疫调节的中枢，隔外侧核与下丘脑关系密切，隔外侧核 损 毁可引起T细胞应答的明显改变[11]；损毁背侧海马和杏仁复合体导致一过性的脾 、胸腺细胞数量增加和T细胞增殖反应增强[12]；Rivest[13]发现腹腔内 注射LPS，3h后以下核团的c-fosmRNA达到表达高峰：室旁核大细胞部和小 细胞部、视上核、内侧视前区、蓝斑、杏仁中央核和外侧臂旁核等。Saphier等[14] 证明，SRBCs免疫动物后，在初次抗体生成高峰期(免疫后第5d)PO/AH放电增加，用环胞菌 素A抑制外周免疫反应后，中枢的放电变化消失，提示PO/AH的放电变化与外周免疫反应有关 。 Lysle等[15]报道，将吗啡注射到中央灰质腹外侧部，可引起T、B淋巴细胞增殖功 能降低、自然杀伤细胞毒性降低、IL-2和γ-干扰素合成减少。以上报道均提示这些核团 与免疫调节有关，而这些核团在本实验中免疫刺激后磷酸化p44/42 MAPK表达均增加、增强 ， 提示p44/42 MAPK参与了这些核团对免疫反应的调节。文献报道LPS腹腔内注射后，刺激腹 腔内巨噬细胞产生IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子。我们推测这些细胞因子既 可能 通过血源性途径进入脑并作用于脑，又可能通过神经机制将免疫信息传递到脑，使脑内产生 细胞因子或其他介质，通过MAPK途径影响不同核团内神经元的功能活动。
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图1 对照组外侧隔核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标 尺示40μm
图2 实验组外侧隔核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图3 对照组视前区内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图4 实验组视前区内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图5 对照组杏仁中央核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μ m
图6 实验组杏仁中央核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图7 对照组海马内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80μm
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图8 实验组海马内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80μm
图9 对照组室旁核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图10 实验组室旁核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm[ ZK)〗
图11 对照组视上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm[ ZK)〗
图12 实验组视上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm[ ZK)〗
图13 对照组乳头体上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80 μm
图14 实验组乳头体上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80 μm
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图15 对照组蓝斑内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图16 实验组蓝斑内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
Fig.1 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the lateral nucleus of septum(LSV)in the control group.Bar=40μm
Fig.2 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd f ibers in the lateral nucleus of septum(LSV)in the experimental group.Bar=40μm[ ZK)〗
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Fig.3 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the preoptic area(PO)in the control group.Bar=40μm
Fig.4 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42 MAPK-LI cells and fibers in the preoptic area (PO)in the experimental group.Bar=40μm
Fig.5 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42 MAPK-LI cells and fibers in the central nucleus of amygdala(CeA)in the control group.Bar=40μm
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Fig.6 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibe rs in the central nucleus of amygdala(CeA)in the experimental group.Bar=40μm
Fig.7 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42 MAPK-LI cells and fibers in the caudal hippocampus in the control group. Bar=80μm
Fig.8 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a n d fibers in the caudal hippocampus in the experimental group.Bar=80μm
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Fig.9 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the hypothalamus paraventricular nucleus(PVN)in the control group.Bar=40μm
Fig.10 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fiber s in the hypothalamus paraventricular nucleus(PVN)in the experimental group.Bar= 40μm
Fig.11 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the supraoptic nucleus(SON)in the control group.Bar=40μm
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Fig.12 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells an d fibers in the supraoptic nucleus(SON) in the experimental group.Bar=40μm
Fig.13 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells an d fibers in the supramammilary nucleus(SuM)in the control group.Bar=80μm
Fig.14 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fibers in the supramammilary nucleus(SuM)in the experimental group.Bar=80μm
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Fig.15 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fibers in the locus nucleus(LC)in the control group.Bar=40μm
Fig.16 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fibers in the locus nucleus(LC)in the experimental group.Bar=40μm
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39830130)；全军“九五”重点 课题资助项目(96Z044)
【作者简介】王曦(1970—)，女(汉族)，山东青岛市人，硕士，主治医师
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参考文献
[1]Kortenjann M，Thomae O，Shaw PE.Inhibition of v -raf-dependent c-fos expressio n and transformation by a kinase-defective mutant of the mitogen-activated pro tein kinase Erk2[J].Mol Cell Biol，1994，14(7):4815-4824.
[2]Huang WJ，Wang BR，Yao LB，et al.Activity of p44/42 MAP kinase in th e caudal s ubnucleus of trigeminal spinal nucleus is increased following perioral noxious s timulation in the mouse[J].Brain Res，2000，861(1):181-185.
, 百拇医药
[3]Brunet A，Roux D，Lenormand P，et al.Nuclear translocation of p42/p4 4 mitogen- activated protein kinase is required for growth factor-induced gene expression and cell cycle entry[J].EMBO J，1999，18(3):664-674.
[4]Alvarez E，Northwood IC，Gonzalez FA，et al.Pro-Leu-Ser/Thr-Pro i s a consensus primary sequence for substrate protein phosphorylation.Characterization of the phosphorylation of c-myc and c-jun proteins by an epidermal growth factor rece pt or threonine 669 protein kinase[J].J Biol Chem，1991，266(23):15277-15285.
, 百拇医药
[5]Miyasaka T，Miyasaka J，Saltiel AR.Okadaic acid stimulates the activ ity of mi crotubule associated protein kinase in PC-12 pheochromocytoma cells [J].Bioch em Biophys Res Commun，1990，168(3):1237-1243.
[6]Jovanovic JN，Benfenati F，Siow YL，et al.Neurotrophins stimulate phosphory lation of synapsin I by MAP kinase and regulate synapsin I-actin interactions [J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(8):3679-3683.
[7]Atkins CM，Yon M，Groome NP，et al.Regulation of myelin basic protei n phosphor ylation by mitogen-activated protein kinase during increased action potential f iring in the hippocampus[J].J Neurochem，1999，73(3):1090-1097.
, http://www.100md.com
[8]Takishima K，Griswold PI，Ingebritsen T，et al.Epidermal growth fact or(EGF)rec eptor T669 peptide kinase from 3T3-L1 cells is an EGF-stimulated"MAP"kinase[J ].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(6):2520-2524.
[9]Lin LL，Wartmann M，Lin AY，et al.cPLA2 is phosphorylated and activa ted by MAP kinase [J].Cell，1993，72(2):269-278.
[10]Kadlecova O，Masek K，Seifert J，et al The involvement of some brai n structur es in the effects of immunomodulators[J].Annals of the New York Academy of Sci ence，1987，496(1):394-398.
, 百拇医药
[11]Nance DM，Rayson D，Carr RI，et al. The effects of lesions in the l ateral se ptal and hippocampal area on the humoral immune response of adult female rats[J ].Brain Behav Immun，1987，(1):292-305.
[12]Brooks WH，Cross RJ，Roszman TL，et al.Neuroimmunomodulation:neural anatom ical basis for impairment and facilitation[J].Ann Neurol，1982，12(1):56-61.
[13]Rivest S，Laflamme N.Neuronal activity and neuropeptide gene transc ription in the brains of immune-challenged rats[J].J Neuroendocrinol，1995，7(7):501 -525.
, http://www.100md.com
[14]Saphier D，Abramsky O，Mor G，et al.Multuinit electrical activity i n couci ous rats during an immune response[J].Brain Behav Immun，1987，1(1):40-51.
[15]Lysle DT，Hoffman KE，Dykstra LA.Evidence for the involvement of th e caudal region of the periaqueductal gray in subset of morphine-induced alterations of i mmune status[J].J Pharmacol Exp Ther，1996，277(3):1533-1540.
【收稿日期】2000-07-17 【修回日期】2000-08-25, http://www.100md.com
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关键词：磷酸化的p44/42 MAPK；脂多糖(LPS)；脑；大鼠
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【摘要】目的 研究腹腔注射LPS后大鼠脑内活化形式的细胞外信号 调节蛋白激酶(p44/42 MAPK)分布的变化。方法用免疫组织化学法。 结果 在隔外侧核、膈下丘脑核、视前区、杏仁中央核、尾侧海马 下丘脑 室旁核、视上核、乳头体上核、中央灰质腹外侧部、臂旁外侧核、蓝斑等阳性细胞数量增加 ，染色增强。结论 p44/42 MAPK的功能不仅与细胞的生长、分化 和神经元的可塑性变化有关，还可能与免疫刺激有关。
【中图分类号】R322.8 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-48
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THE CHANGES OF THE EXPRESSION OF PHOSPHORYLATED-p44/42 MAPK IN RAT BRAIN AFTER INTRAPERITONEAL INJECTION OF LPS
WANG Xi，WANG Bai-ren，HUANG Wen-jin，DUAN Xiao-li，JU Gong*
(Department of Neuroimmunomodulation，Institute of Neuroscience，the F ourth Medical University，Xian 710032，China)
【Abstract】Objective To study the changes of the expressio n of phosphorylated-p44/42MAPK in rat brain after intraperitoneal injection of L P S.Method Immunohistochemical staining techniques were used,an d immunostained sections were observed and analyzed under a microscope. Results The expression of phosphorylated-p44/42MAPK increased in la teral septum，septohypothalamic nucleus，preoptic area，central nucleus of amygd ala，caudal hyppocampus，hypothalamus paraventricular nucleus，supraoptic nucleu s，supramammilary nucleus，ventrolateral part of periaqueductal gray，lateral pa rabranchial nucleus，locus nucleus，et al.Conclusion It sugge s ted that p44/42 MAPK is related with not only cellular growth，differentiation a nd plasticity of neuron but also immune stimuli probably.
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【key words】p44/42MAPK； LPS； Brain； Rat 近年来的研究表明，中枢神经系统可以接受免疫信息并参与对免疫反应的调节，但对于脑内 参与免疫反应的神经核团尚不清楚。在神经系统功能和形态相结合的研究中，既往应用较多 的是即刻早期基因c-fos，同时egr-1等也有应用。 虽 然不同的应激可引起脑内不同形式的即刻早期基因的表达，但是每种即刻早期基因在脑内的 表达均有一定的局限性。因此，需要结合多种标志物才能更全面地反映出参与免疫反应的脑 内神经核团的活动情况。本研究从信号转导分子的环节研究了免疫反应时神经核团的活动情 况。
细胞外信号调节蛋白激酶(p44/42 MAPK，即ERK1/ERK2)属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族 ，是一类重要的信号转导分子，它被激活成为磷酸化的p44/42 MAPK发挥作用，参与调节细 胞的有丝分裂和分化[1]，并在神经元和胶质细胞的信号传递中起着重要的作用。 我们[2]新近的研究发现，三叉神经脊束核尾侧亚核的p44/42 MAPK活性在面部伤害 性刺激时表达上调，在本研究中我们用免疫组织化学方法，研究了腹腔内给予免疫刺激剂脂 多糖(lipopolysacchride，LPS)后脑内磷酸化的p44/42 MAPK表达的变化。
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材料和方法
1. 动物准备和切片的制备
雄性SD大鼠8只，体重180～250g，随机分为2组：实验组4只，腹腔内注射LPS(500μg/kg；S igma公司；用生理盐水稀释为100mg/L)；对照组4只，每公斤体重腹腔内注射同体积的生理 盐水。3h后，1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射，麻醉后开胸，经心灌流，先用100ml生理盐 水快速灌注冲洗血液，然后用预冷的4%多聚甲醛固定液400ml灌流。待固定液滴注完毕，取 出全脑，用4%多聚甲醛后固定2h，再将脑放入20%蔗糖溶液，4℃过夜。组织块完全沉底后用 冰冻切片机连续冠状切片，每5张取1张，片厚50μm。
2.免疫组织化学染色
先将切片经0.01mol/L PBS漂洗5min×3次后，浸入80%甲醇和0.3%过氧化氢封闭30min，0 .01mol/L PBS漂洗10min×3次，再用1%牛血清白蛋白、3%羊血清和0.3% Triton X-100封 闭1h，同前漂洗过后，用ABC方法进行免疫组织化学染色：兔抗大鼠磷酸化p44/42 MAPK抗 体(1：500，NEB 公司)孵育切片，室温下36h，0.01mol/L PBS 漂洗10min×3次；生物素化 的羊抗兔IgG(1:500，Sigma公司)孵育切片，室温下4h，0.01mol/L PBS漂洗10min×3次 ；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC，1：500， Vector公司)孵育切片，室温2h ， 0.01mol/L PBS漂洗10min×3次；硫酸镍胺加强DAB蓝色反应呈色。当阳性产物呈深蓝色而 背底几乎无色时终止反应。经脱水、透明和封片后，镜检。
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部分切片用做免疫组织化学方法对照实验，一抗用牛血清白蛋白稀释液替代，二抗、ABC复 合物同其他免疫组织化学反应切片，结果未见阳性结构。
3.磷酸化p44/42 MAPK阳性细胞计数方法
根据核团的大小，取每只动物的每个核团相对应的典型平面1～2个，在10×20光镜下观察并 计数阳性细胞数 。该例动物该核团的平均数，即为该动物该核团的阳性细胞数；每组4个动物间取平均值， 即为该组动物该核团的阳性细胞数。采用t检验进行统计分析。
结 果
对实验组和对照组从延髓尾端到端脑的全脑切片进行了对比观察，阳性产物见于神经元的胞 浆、胞核和突起，存在于神经元的胞体、树突和轴突中的量明显多于细胞核中的量。在对照 组动物，活化的p44/42MAPK出现在许多核团，特别是在岛皮质、感觉运动皮质和视、听皮质 、海马内嗅区和背侧、腹侧下托，内侧杏仁核、皮质杏仁核和中介核，视交叉上核、下丘脑 室旁核大细胞部、弓状核、前腹侧视前核、外侧前核、乳头体上核和下丘脑后区、顶盖前区 、中央灰质腹外侧部、蓝斑、臂旁外侧核、小脑浦肯野细胞、A5区、旁巨细胞外侧 核、吻侧(C1区)和尾侧(A1区)延髓腹外侧网状结构等。
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实验组和对照组的不同点是，在某些脑区，磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应神经元的数量 及 阳性神经纤维的密度和长度发生改变。与对照组比较，实验组在外侧隔区(图1，2)、隔下丘 脑核、视前区(图3，4)、杏仁中央核(图5，6)、尾侧海马(图7，8)、下丘脑室旁核(图9，10 )、视上核(图11，12)、乳头体上核(图13，14)、中央灰质腹外侧部、外侧臂旁核、蓝斑(图 15，16)处阳性细胞数量增加、染色增强。数量比较见附表。
附表 实验组(n=4)和对照组(n =4)脑内部
分核团中磷酸化p44/42 MAPK阳性细胞计数
n=4)and experimental group(n=4) 核团名称
对照 组
实验组
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nuclei
control group
experimental group
外侧隔区
25±4
48±7a
(lateral septal region)
隔下丘脑核
31±9
76±13a
(septohypothalamic nucleus)
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视前区
18±3
45±7a
(preoptic region)
杏仁中央核
19±5
83±11a
(central amygdaloid nuclei)
尾侧海马
6±2
21±4a
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(caudal hippocampus)
下丘脑室旁核
69±0
120±19a
(hypothalamic paraventricular nucleus)
视上核后部
21±13
128±23a
(retrochiasmatic part of supraoptic nucleus)
乳头体上核
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38±8
126±31a
(supramammillary nucleus)
中央灰质腹外侧部
13±7
72±19a
(lateral ventral part of central gray)
外侧臂旁核
28±8
59±12a
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蓝斑
54±9
93±13a
(locus ceruleus)
a.与对照组相比P<0.05 a.P<0.05 vs.Contr ol group.
讨 论
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)属细胞内蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，是一类重要的接受 单次跨膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的信号转导分子，参与多种细胞功能的 调控。迄今为止，在MAPK家族中已有3个亚家族被描述，分别为p44/42 MAPK(ERK1/ERK2，细 胞外信号调节蛋白激酶)、JNK(c-junN末端蛋白激酶，也被称为SAPK，即应 急激活蛋白激酶)和p38 MAPK(也被称作HOG，即高渗透性甘油反应激酶。)生长因子和有丝分 裂信号通过Ras、Raf、MEK1/MEK2等一系列级连反应使p44/42 MAPK磷酸化，成为活化的p44/ 42 MAPK而发挥作用。
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p42/44 MAPK被激活后，既可以从胞浆进入胞核并作用于核蛋白如Elk1、c-myc和TAL1 [ 3，4]等转录因子，影响下游基因的表达，又可以在胞浆内作用于底物丝裂原活化蛋白- 2 (MAP2)[5]、突触素[6]、髓鞘碱性蛋白(MBP)[7]或细胞表面分子 如表皮生长因子受体[8]、磷脂酶A2[9]，并使底物磷酸化，影响细胞骨架 的重塑和突触形成。本实验中，我们发现活化的p44/42 MAPK存在于神经元的胞体、树突和 轴 突中的量明显多于细胞核中的量。虽然磷酸化的p44/42 MAPK可以从胞浆转移到核内，使核 内 的转录因子磷酸化，但是轴突和树突中的磷酸化的p44/42 MAPK距离细胞核较远，所以磷酸 化 的p44/42 MAPK更有可能作用于胞浆中的底物，比如MAP2、TAL、MBP和突触素，参与免疫应 激引起神经元功能代谢后发生的细胞骨架和突触的重塑。
本研究结果显示在对照组大鼠脑中，活化的p44/42 MAPK有广泛的表达，这提示了p44/42 MA PK在脑的众多功能的信号传导过程中的重要性。在我们以往的实验中，发现给予动物疼痛刺 激后，脑内三叉神经脊束核尾侧亚核磷酸化的p44/42 MAPK表达增高[2]，提示p44/ 42 MAPK的功能远不止以往文献中所提到的那些。因此，本研究中我们用免疫组织化学方法 ，观 察了腹腔内给予免疫刺激剂LPS后脑内磷酸化的p44/42 MAPK表达的变化，结果发现脑内磷酸 化的p44/42 MAPK表达增加。
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既往研究发现，损毁蓝斑和臂旁核等脑干结构均不同程度地影响免疫功能[10]；下 丘脑一直被认为是神经-内分泌-免疫调节的中枢，隔外侧核与下丘脑关系密切，隔外侧核 损 毁可引起T细胞应答的明显改变[11]；损毁背侧海马和杏仁复合体导致一过性的脾 、胸腺细胞数量增加和T细胞增殖反应增强[12]；Rivest[13]发现腹腔内 注射LPS，3h后以下核团的c-fosmRNA达到表达高峰：室旁核大细胞部和小 细胞部、视上核、内侧视前区、蓝斑、杏仁中央核和外侧臂旁核等。Saphier等[14] 证明，SRBCs免疫动物后，在初次抗体生成高峰期(免疫后第5d)PO/AH放电增加，用环胞菌 素A抑制外周免疫反应后，中枢的放电变化消失，提示PO/AH的放电变化与外周免疫反应有关 。 Lysle等[15]报道，将吗啡注射到中央灰质腹外侧部，可引起T、B淋巴细胞增殖功 能降低、自然杀伤细胞毒性降低、IL-2和γ-干扰素合成减少。以上报道均提示这些核团 与免疫调节有关，而这些核团在本实验中免疫刺激后磷酸化p44/42 MAPK表达均增加、增强 ， 提示p44/42 MAPK参与了这些核团对免疫反应的调节。文献报道LPS腹腔内注射后，刺激腹 腔内巨噬细胞产生IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子。我们推测这些细胞因子既 可能 通过血源性途径进入脑并作用于脑，又可能通过神经机制将免疫信息传递到脑，使脑内产生 细胞因子或其他介质，通过MAPK途径影响不同核团内神经元的功能活动。
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图1 对照组外侧隔核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标 尺示40μm
图2 实验组外侧隔核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图3 对照组视前区内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图4 实验组视前区内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图5 对照组杏仁中央核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μ m
图6 实验组杏仁中央核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图7 对照组海马内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80μm
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图8 实验组海马内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80μm
图9 对照组室旁核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图10 实验组室旁核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm[ ZK)〗
图11 对照组视上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm[ ZK)〗
图12 实验组视上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm[ ZK)〗
图13 对照组乳头体上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80 μm
图14 实验组乳头体上核内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示80 μm
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图15 对照组蓝斑内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
图16 实验组蓝斑内磷酸化p44/42 MAPK样免疫反应细胞和突起。标尺示40μm
Fig.1 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the lateral nucleus of septum(LSV)in the control group.Bar=40μm
Fig.2 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd f ibers in the lateral nucleus of septum(LSV)in the experimental group.Bar=40μm[ ZK)〗
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Fig.3 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the preoptic area(PO)in the control group.Bar=40μm
Fig.4 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42 MAPK-LI cells and fibers in the preoptic area (PO)in the experimental group.Bar=40μm
Fig.5 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42 MAPK-LI cells and fibers in the central nucleus of amygdala(CeA)in the control group.Bar=40μm
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Fig.6 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibe rs in the central nucleus of amygdala(CeA)in the experimental group.Bar=40μm
Fig.7 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42 MAPK-LI cells and fibers in the caudal hippocampus in the control group. Bar=80μm
Fig.8 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a n d fibers in the caudal hippocampus in the experimental group.Bar=80μm
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Fig.9 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the hypothalamus paraventricular nucleus(PVN)in the control group.Bar=40μm
Fig.10 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fiber s in the hypothalamus paraventricular nucleus(PVN)in the experimental group.Bar= 40μm
Fig.11 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells a nd fibers in the supraoptic nucleus(SON)in the control group.Bar=40μm
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Fig.12 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells an d fibers in the supraoptic nucleus(SON) in the experimental group.Bar=40μm
Fig.13 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells an d fibers in the supramammilary nucleus(SuM)in the control group.Bar=80μm
Fig.14 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fibers in the supramammilary nucleus(SuM)in the experimental group.Bar=80μm
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Fig.15 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fibers in the locus nucleus(LC)in the control group.Bar=40μm
Fig.16 Photomicrograph showing the phosphorylated-p44/42MAPK-LI cells and fibers in the locus nucleus(LC)in the experimental group.Bar=40μm
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39830130)；全军“九五”重点 课题资助项目(96Z044)
【作者简介】王曦(1970—)，女(汉族)，山东青岛市人，硕士，主治医师
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参考文献
[1]Kortenjann M，Thomae O，Shaw PE.Inhibition of v -raf-dependent c-fos expressio n and transformation by a kinase-defective mutant of the mitogen-activated pro tein kinase Erk2[J].Mol Cell Biol，1994，14(7):4815-4824.
[2]Huang WJ，Wang BR，Yao LB，et al.Activity of p44/42 MAP kinase in th e caudal s ubnucleus of trigeminal spinal nucleus is increased following perioral noxious s timulation in the mouse[J].Brain Res，2000，861(1):181-185.
, 百拇医药
[3]Brunet A，Roux D，Lenormand P，et al.Nuclear translocation of p42/p4 4 mitogen- activated protein kinase is required for growth factor-induced gene expression and cell cycle entry[J].EMBO J，1999，18(3):664-674.
[4]Alvarez E，Northwood IC，Gonzalez FA，et al.Pro-Leu-Ser/Thr-Pro i s a consensus primary sequence for substrate protein phosphorylation.Characterization of the phosphorylation of c-myc and c-jun proteins by an epidermal growth factor rece pt or threonine 669 protein kinase[J].J Biol Chem，1991，266(23):15277-15285.
, 百拇医药
[5]Miyasaka T，Miyasaka J，Saltiel AR.Okadaic acid stimulates the activ ity of mi crotubule associated protein kinase in PC-12 pheochromocytoma cells [J].Bioch em Biophys Res Commun，1990，168(3):1237-1243.
[6]Jovanovic JN，Benfenati F，Siow YL，et al.Neurotrophins stimulate phosphory lation of synapsin I by MAP kinase and regulate synapsin I-actin interactions [J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(8):3679-3683.
[7]Atkins CM，Yon M，Groome NP，et al.Regulation of myelin basic protei n phosphor ylation by mitogen-activated protein kinase during increased action potential f iring in the hippocampus[J].J Neurochem，1999，73(3):1090-1097.
, http://www.100md.com
[8]Takishima K，Griswold PI，Ingebritsen T，et al.Epidermal growth fact or(EGF)rec eptor T669 peptide kinase from 3T3-L1 cells is an EGF-stimulated"MAP"kinase[J ].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(6):2520-2524.
[9]Lin LL，Wartmann M，Lin AY，et al.cPLA2 is phosphorylated and activa ted by MAP kinase [J].Cell，1993，72(2):269-278.
[10]Kadlecova O，Masek K，Seifert J，et al The involvement of some brai n structur es in the effects of immunomodulators[J].Annals of the New York Academy of Sci ence，1987，496(1):394-398.
, 百拇医药
[11]Nance DM，Rayson D，Carr RI，et al. The effects of lesions in the l ateral se ptal and hippocampal area on the humoral immune response of adult female rats[J ].Brain Behav Immun，1987，(1):292-305.
[12]Brooks WH，Cross RJ，Roszman TL，et al.Neuroimmunomodulation:neural anatom ical basis for impairment and facilitation[J].Ann Neurol，1982，12(1):56-61.
[13]Rivest S，Laflamme N.Neuronal activity and neuropeptide gene transc ription in the brains of immune-challenged rats[J].J Neuroendocrinol，1995，7(7):501 -525.
, http://www.100md.com
[14]Saphier D，Abramsky O，Mor G，et al.Multuinit electrical activity i n couci ous rats during an immune response[J].Brain Behav Immun，1987，1(1):40-51.
[15]Lysle DT，Hoffman KE，Dykstra LA.Evidence for the involvement of th e caudal region of the periaqueductal gray in subset of morphine-induced alterations of i mmune status[J].J Pharmacol Exp Ther，1996，277(3):1533-1540.
【收稿日期】2000-07-17 【修回日期】2000-08-25, http://www.100md.com