西藏雪兔子叶的组织培养
作者：王小飞 何叶 张小苗 王凤兴 陈发菊 张丽萍 李玲
单位：王小飞 何叶(湖北三峡学院医学院生物系97级01班 宜昌 443003)；张小苗 王凤兴(生物系99级01班)；陈发菊 张丽萍 李玲(生物系)
关键词：雪兔子；组织培养
实用医学进修杂志00zj02
摘 要 目的：利用离体培养技术以建立雪兔子细胞培养和植株再生系统。方法： 以雪兔子无菌苗的幼叶为外植体，接种到MS补加NAA(1.0～2.0)mg/L、6-BA(0.1～1.0)mg/L的培养基上诱导愈伤组织，经2～3次继代培养后，将生长良好的愈伤组织转接到MS附加6-BA(0.5～2.0)mg/L、 IAA(0.05～0.1)mg/L、 NAA(0.05～0.1)mg/L、GA3 0.5mg/L不同组合培养基上诱导不定芽，不定芽转接到MS + IAA(0.1～0.5)mg/L培养基上诱导生根。结果：MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L的诱导组织培养效果最好，经6周培养即可形成大量的黄绿色愈伤组织，诱导率可达100%。适宜诱导芽的组合为MS + 6-BA 1.0mg/L + IAA 0.1mg/L + GA3 0.5mg/L。不定芽在MS + IAA 0.5mg/L 上冷处理10天，然后25℃培养一个月即可生根。结论：雪兔子器官发生过程中，低温预处理有明显促进器官分化作用。
, 百拇医药
Leaf Tissue Culture and of Saussurea gossypiphora in Xizhang
Wang Xiaofei He Ye Zhang Xiaomiao, et al
Department of Biology,Hubei Three Gorges
University Medical College,Yichang 443003
Abstract Objective:Been made use of the technology of isolated culture established a system of cell culture and plant regeneration of S.gossypiphora.Method:Leaf segments of S. gossypiphora D.Don were cultured on MS medium Supplemented with NAA(1.0～2.0)mg/L, 6-BA(0.1～1.0)mg/L. The callus were shifted to MS medium supplemented with 6-BA(0.5～2.0)mg/L，IAA(0.05～0.1)mg/L, NAA (0.05～0.1)mg/L, GA3 0.5mg/L to induce adventitions buds.The adventitious buds were cultured on MS medium with IAA(0.1～0.5)mg/L。Result:Six weeks later large member of greenish yellow callus would be induced from the excised leaves. An induced frequency of 100% was obtained on the MS medium with NAA 2.0 mg/L + 6-BA 0.5mg/L. The suitable medium to induce adventitions buds was MS + 6-BA 1.0mg/L + IAA 0.1mg/L + GA3 0.5mg/L..The adventitious buds were cultured on MS + IAA 0.5mg/L under low temperature for ten days. Then roots wonld occur after they were cultured at 25℃ for a month.Conclusion:The success of tissue culture of S.gossypiphora offered reference materals for the tissue culture of the other plants of snow lotus.
, 百拇医药
Key Words Saussurea gossypiphora； Tissue culture
雪兔子(Saussurea gossypiphora D.Don)属菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea DC)雪兔子亚属(Subgen. Eriocoryne)植物。分布于我国西藏的聂拉木和亚东县，生长在海拔4200～4700米的高山流石滩。民间称为雪莲花，为名贵中草药。常用于治疗风湿性关节炎、妇科病等，雪兔子是藏药雪莲花的主要原植物之一[1]。但由于长期掠夺性采挖，加上其特异的生长环境，自然生长慢，人工栽培困难，自然资源难以满足医药上的需要。目前对雪兔子药用成份研究报道较多[2，3]，组织培养研究未见报道。本实验用雪兔子幼叶作外植体进行愈伤组织诱导和再生植株的研究，以期利用组织培养技术建立雪兔子快繁系统，不仅为解决雪莲药源短缺问题提供了新思路，而且为进行雪兔子细胞培养的筛选和天然药用成分的细胞合成研究奠定了基础，同时也为其它种雪莲花植物的细胞和组织培养研究积累了资料。
, 百拇医药
1 材料和方法
雪兔子种子由北京锦绣大地公司提供。用洗将种子置于200 ml三角瓶中，自来水冲洗将浮于水面的种子去掉，洗洁精水液浸洗半小时，蒸镏水冲洗几次后，加150 ml每1000 ml含10滴“吐温40”的蒸镏水充分摇动10 min，经70%酒精消毒30 sec，0.1% HgCl2灭菌10 min，无菌水冲洗5次，再放到无菌滤纸上吸干水分以供接种。将灭菌的雪兔子种子接种到不加激素的MS培养基上萌发成无菌苗，将无菌苗的幼叶切成0.5 cm2的切块作外植体，接种于MS附加NAA(1.0～2.0)mg/L、6-BA(0.1～1.0)mg/L的培养基上诱导愈伤组织。选择生长良好的愈伤组织转移到MS 补加6-BA(0.5～2.0)mg/L、IAA(0.05～0.1)mg/L、NAA(0.05～0.1)mg/L、GA30.5mg/L不同组合培养基上诱导不定芽，将分化的不定芽移置到MS + IAA (0.1～0.5)mg/L培养基上诱导生根。除不同温度处理外，培养室温度为25 ± 2℃，每天光照时间14 h，光照强度2000lux。
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2 结果
2.1 愈伤组织的诱导和生长
2.1.1 愈伤组织的诱导 将幼叶外植体分别接种于1. MS + NAA 1.0mg/L + 6-BA0.1mg/L；2. MS + NAA 1.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L；3. MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L；4. MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 1.0mg/L四组不同激素组合培养基上培养，10天后可见叶外植体切口处均有增厚，一个月已可见较多的黄绿色较致密的颗粒状愈伤组织。在所设实验组合中，以MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L的诱导效果最好，诱导率可达100%，1、2、4组培养基上的诱导率分别为6.8%、10%和78%。
2.1.2 愈伤组织的生长
以所得愈伤组织为材料接种于MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L固体培养基上，25 ℃下光照培养，每隔1～2天取样，称取愈伤组织鲜重，观察24天。从图1可以看到雪兔子细胞生长曲线基本符合“S”型。愈伤组织转接到新培养基上，经过短时间的延迟期
, 百拇医药
图1 雪兔子固体培养愈伤组织生长曲线
后约在第十天开始进入对数生长期，第11天到第18天呈现对数生长，18天后进入静止期，此时藓重达到最大值。根据愈伤组织的生长曲线我们选择出继代培养时间20天较为合适。
2.1.3 温度对愈伤组织生长的影响 试验中我们选择20℃、25℃、30℃三个温度梯度、25℃～10℃，30℃～10℃两个昼夜温差、4℃冷处理1周后转入25C和25℃～10℃七种培养条件。每种条件培养8瓶，培养3周后分别测定每种条件下每1克接种量鲜重生长量，实验结果表明(图2)：三个温度梯度中，25℃培养有利于愈伤组织的生长，昼夜温差培养对愈伤组织生长有一定促进作用，而低温预处理对愈伤组织的生长具有明显的促进作用。
图2 不同温度条件对愈伤组织生长的影响
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2.2 器官发生
将生长良好的愈伤组织转接到MS补加6-BA(0.5～2.0)mg/L、IAA(0.05～0.1)mg/L、NAA(0.05～0.1)mg/L、GA3 0.5mg/L不同组合培养基上诱导芽。接种后分为两组，1组直接在25℃下培养，另一组4℃处理10天后25℃培养,实验结果(见表1)6-BA、NAA、GA3的各组合均能诱导出不定芽，其中以MS + 6-BA 1.0mg/L + IAA 0.5mg/L + GA3 0.5mg/L培养基诱导效果最好，不仅出芽率高，而且丛生芽的个数多。GA3有利于芽的分化和丛生芽的形成，不加GA3的培养基上丛生芽的个数少。实验还表明适宜的低温处理对芽的分化具有明显的促进作用，经低温处理分化出的丛生芽多，且芽生长健壮而稳定。
待不定芽长到2～3 cm高时，将不定芽从愈伤组织块上切下转接到MS补加IAA(0.1～0.5)mg/L培养基上培养2周后，在4℃冰箱冷藏45天，然后放到培养室培养1个月后，发现在MS + IAA 0.5mg/L培养基上的不定芽基部出现一些乳黄色的根突，继续培养根突伸长成根，根的诱导率为63%。 附表 不同激素组合及低温处理对雪兔子芽分化的影响 激素组合(mg/L)
, 百拇医药
芽诱导率(%)
25℃培养
4℃处理10天后25℃培养
6-BA0.5++IAA0.05
6-BA0.5+IAA0.1+GA30.5
6-BA1.0+IAA0.05
6-BA1.0+IAA0.1+GA30.5
6-BA2.0+IAA0.05
6-BA1.0+NAA0.05+GA30.5
6-BA1.0+NAA0.1+GA30.5
, 百拇医药
6-BA2.0+NAA0.1+GA30.5
0
6
57.8
81.3
41.4
50.3
60.1
51.4
33.7
0
10.1
70.2
, 百拇医药
100
53.7
67.9
73.1
65.3
41.7
3 小结与讨论
本实验以雪兔子萌发的无菌苗幼叶作外植体诱导愈伤组织，在MS + NAA2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L培养基上得到了大量的黄绿色愈伤组织，诱导率高达100%。在愈伤组织继代培养中发现，适宜愈伤组织生长的温度为25℃，昼夜温差及低温预处理对愈伤组织生长均有明显的促进作用，这一工作为进一步研究雪兔子的器官分化、细胞悬浮培养及细胞天然药物合成提供了条件和资料。
, 百拇医药 适宜雪兔子不定芽和根分化的培养基组合分别MS + 6-BA 1.0 mg/L + IAA 0.5 mg/L + GA3 0.5mg/L和MS + IAA 0.5mg/L，在一定条件下芽的分化率较高，但根的诱导率相对较低，优化生根培养基和培养条件以提高生根率是建立快繁系统的重要环节，我们将作进一步的研究。在雪兔子器官发生过程中，低温预处理有明显促进器官分化的作用，这一结果与古巴诺娃在新疆雪莲的研究中观察到一定的低温有利于芽和根的分化相一致[4]。这很可能与雪莲类植物长期适应严寒的遗传积累有关，低温在雪莲植物器官分化中的作用有待于进一步研究。
参考文献
1，青藏高原综合考察队.西藏植物志[M].第四卷.北京：科学出版社，1995：878
2，邱林刚，连敏，马忠武，等.雪兔子的成分研究[J].植物学报, 1989；31(5):398
3，余建华，程珍，郑尚珍，等.雪兔子中木脂素成分的研究[J].中草药,1997；23(6):283
4，瓦.古巴诺娃，刘杰龙，石玉湖.新疆雪莲的组织培养[J].新疆农业科学,1990；(5):221, http://www.100md.com
单位：王小飞 何叶(湖北三峡学院医学院生物系97级01班 宜昌 443003)；张小苗 王凤兴(生物系99级01班)；陈发菊 张丽萍 李玲(生物系)
关键词：雪兔子；组织培养
实用医学进修杂志00zj02
摘 要 目的：利用离体培养技术以建立雪兔子细胞培养和植株再生系统。方法： 以雪兔子无菌苗的幼叶为外植体，接种到MS补加NAA(1.0～2.0)mg/L、6-BA(0.1～1.0)mg/L的培养基上诱导愈伤组织，经2～3次继代培养后，将生长良好的愈伤组织转接到MS附加6-BA(0.5～2.0)mg/L、 IAA(0.05～0.1)mg/L、 NAA(0.05～0.1)mg/L、GA3 0.5mg/L不同组合培养基上诱导不定芽，不定芽转接到MS + IAA(0.1～0.5)mg/L培养基上诱导生根。结果：MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L的诱导组织培养效果最好，经6周培养即可形成大量的黄绿色愈伤组织，诱导率可达100%。适宜诱导芽的组合为MS + 6-BA 1.0mg/L + IAA 0.1mg/L + GA3 0.5mg/L。不定芽在MS + IAA 0.5mg/L 上冷处理10天，然后25℃培养一个月即可生根。结论：雪兔子器官发生过程中，低温预处理有明显促进器官分化作用。
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Leaf Tissue Culture and of Saussurea gossypiphora in Xizhang
Wang Xiaofei He Ye Zhang Xiaomiao, et al
Department of Biology,Hubei Three Gorges
University Medical College,Yichang 443003
Abstract Objective:Been made use of the technology of isolated culture established a system of cell culture and plant regeneration of S.gossypiphora.Method:Leaf segments of S. gossypiphora D.Don were cultured on MS medium Supplemented with NAA(1.0～2.0)mg/L, 6-BA(0.1～1.0)mg/L. The callus were shifted to MS medium supplemented with 6-BA(0.5～2.0)mg/L，IAA(0.05～0.1)mg/L, NAA (0.05～0.1)mg/L, GA3 0.5mg/L to induce adventitions buds.The adventitious buds were cultured on MS medium with IAA(0.1～0.5)mg/L。Result:Six weeks later large member of greenish yellow callus would be induced from the excised leaves. An induced frequency of 100% was obtained on the MS medium with NAA 2.0 mg/L + 6-BA 0.5mg/L. The suitable medium to induce adventitions buds was MS + 6-BA 1.0mg/L + IAA 0.1mg/L + GA3 0.5mg/L..The adventitious buds were cultured on MS + IAA 0.5mg/L under low temperature for ten days. Then roots wonld occur after they were cultured at 25℃ for a month.Conclusion:The success of tissue culture of S.gossypiphora offered reference materals for the tissue culture of the other plants of snow lotus.
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Key Words Saussurea gossypiphora； Tissue culture
雪兔子(Saussurea gossypiphora D.Don)属菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea DC)雪兔子亚属(Subgen. Eriocoryne)植物。分布于我国西藏的聂拉木和亚东县，生长在海拔4200～4700米的高山流石滩。民间称为雪莲花，为名贵中草药。常用于治疗风湿性关节炎、妇科病等，雪兔子是藏药雪莲花的主要原植物之一[1]。但由于长期掠夺性采挖，加上其特异的生长环境，自然生长慢，人工栽培困难，自然资源难以满足医药上的需要。目前对雪兔子药用成份研究报道较多[2，3]，组织培养研究未见报道。本实验用雪兔子幼叶作外植体进行愈伤组织诱导和再生植株的研究，以期利用组织培养技术建立雪兔子快繁系统，不仅为解决雪莲药源短缺问题提供了新思路，而且为进行雪兔子细胞培养的筛选和天然药用成分的细胞合成研究奠定了基础，同时也为其它种雪莲花植物的细胞和组织培养研究积累了资料。
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1 材料和方法
雪兔子种子由北京锦绣大地公司提供。用洗将种子置于200 ml三角瓶中，自来水冲洗将浮于水面的种子去掉，洗洁精水液浸洗半小时，蒸镏水冲洗几次后，加150 ml每1000 ml含10滴“吐温40”的蒸镏水充分摇动10 min，经70%酒精消毒30 sec，0.1% HgCl2灭菌10 min，无菌水冲洗5次，再放到无菌滤纸上吸干水分以供接种。将灭菌的雪兔子种子接种到不加激素的MS培养基上萌发成无菌苗，将无菌苗的幼叶切成0.5 cm2的切块作外植体，接种于MS附加NAA(1.0～2.0)mg/L、6-BA(0.1～1.0)mg/L的培养基上诱导愈伤组织。选择生长良好的愈伤组织转移到MS 补加6-BA(0.5～2.0)mg/L、IAA(0.05～0.1)mg/L、NAA(0.05～0.1)mg/L、GA30.5mg/L不同组合培养基上诱导不定芽，将分化的不定芽移置到MS + IAA (0.1～0.5)mg/L培养基上诱导生根。除不同温度处理外，培养室温度为25 ± 2℃，每天光照时间14 h，光照强度2000lux。
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2 结果
2.1 愈伤组织的诱导和生长
2.1.1 愈伤组织的诱导 将幼叶外植体分别接种于1. MS + NAA 1.0mg/L + 6-BA0.1mg/L；2. MS + NAA 1.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L；3. MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L；4. MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 1.0mg/L四组不同激素组合培养基上培养，10天后可见叶外植体切口处均有增厚，一个月已可见较多的黄绿色较致密的颗粒状愈伤组织。在所设实验组合中，以MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L的诱导效果最好，诱导率可达100%，1、2、4组培养基上的诱导率分别为6.8%、10%和78%。
2.1.2 愈伤组织的生长
以所得愈伤组织为材料接种于MS + NAA 2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L固体培养基上，25 ℃下光照培养，每隔1～2天取样，称取愈伤组织鲜重，观察24天。从图1可以看到雪兔子细胞生长曲线基本符合“S”型。愈伤组织转接到新培养基上，经过短时间的延迟期
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图1 雪兔子固体培养愈伤组织生长曲线
后约在第十天开始进入对数生长期，第11天到第18天呈现对数生长，18天后进入静止期，此时藓重达到最大值。根据愈伤组织的生长曲线我们选择出继代培养时间20天较为合适。
2.1.3 温度对愈伤组织生长的影响 试验中我们选择20℃、25℃、30℃三个温度梯度、25℃～10℃，30℃～10℃两个昼夜温差、4℃冷处理1周后转入25C和25℃～10℃七种培养条件。每种条件培养8瓶，培养3周后分别测定每种条件下每1克接种量鲜重生长量，实验结果表明(图2)：三个温度梯度中，25℃培养有利于愈伤组织的生长，昼夜温差培养对愈伤组织生长有一定促进作用，而低温预处理对愈伤组织的生长具有明显的促进作用。
图2 不同温度条件对愈伤组织生长的影响
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2.2 器官发生
将生长良好的愈伤组织转接到MS补加6-BA(0.5～2.0)mg/L、IAA(0.05～0.1)mg/L、NAA(0.05～0.1)mg/L、GA3 0.5mg/L不同组合培养基上诱导芽。接种后分为两组，1组直接在25℃下培养，另一组4℃处理10天后25℃培养,实验结果(见表1)6-BA、NAA、GA3的各组合均能诱导出不定芽，其中以MS + 6-BA 1.0mg/L + IAA 0.5mg/L + GA3 0.5mg/L培养基诱导效果最好，不仅出芽率高，而且丛生芽的个数多。GA3有利于芽的分化和丛生芽的形成，不加GA3的培养基上丛生芽的个数少。实验还表明适宜的低温处理对芽的分化具有明显的促进作用，经低温处理分化出的丛生芽多，且芽生长健壮而稳定。
待不定芽长到2～3 cm高时，将不定芽从愈伤组织块上切下转接到MS补加IAA(0.1～0.5)mg/L培养基上培养2周后，在4℃冰箱冷藏45天，然后放到培养室培养1个月后，发现在MS + IAA 0.5mg/L培养基上的不定芽基部出现一些乳黄色的根突，继续培养根突伸长成根，根的诱导率为63%。 附表 不同激素组合及低温处理对雪兔子芽分化的影响 激素组合(mg/L)
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芽诱导率(%)
25℃培养
4℃处理10天后25℃培养
6-BA0.5++IAA0.05
6-BA0.5+IAA0.1+GA30.5
6-BA1.0+IAA0.05
6-BA1.0+IAA0.1+GA30.5
6-BA2.0+IAA0.05
6-BA1.0+NAA0.05+GA30.5
6-BA1.0+NAA0.1+GA30.5
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6-BA2.0+NAA0.1+GA30.5
0
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57.8
81.3
41.4
50.3
60.1
51.4
33.7
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10.1
70.2
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100
53.7
67.9
73.1
65.3
41.7
3 小结与讨论
本实验以雪兔子萌发的无菌苗幼叶作外植体诱导愈伤组织，在MS + NAA2.0mg/L + 6-BA 0.5mg/L培养基上得到了大量的黄绿色愈伤组织，诱导率高达100%。在愈伤组织继代培养中发现，适宜愈伤组织生长的温度为25℃，昼夜温差及低温预处理对愈伤组织生长均有明显的促进作用，这一工作为进一步研究雪兔子的器官分化、细胞悬浮培养及细胞天然药物合成提供了条件和资料。
, 百拇医药 适宜雪兔子不定芽和根分化的培养基组合分别MS + 6-BA 1.0 mg/L + IAA 0.5 mg/L + GA3 0.5mg/L和MS + IAA 0.5mg/L，在一定条件下芽的分化率较高，但根的诱导率相对较低，优化生根培养基和培养条件以提高生根率是建立快繁系统的重要环节，我们将作进一步的研究。在雪兔子器官发生过程中，低温预处理有明显促进器官分化的作用，这一结果与古巴诺娃在新疆雪莲的研究中观察到一定的低温有利于芽和根的分化相一致[4]。这很可能与雪莲类植物长期适应严寒的遗传积累有关，低温在雪莲植物器官分化中的作用有待于进一步研究。
参考文献
1，青藏高原综合考察队.西藏植物志[M].第四卷.北京：科学出版社，1995：878
2，邱林刚，连敏，马忠武，等.雪兔子的成分研究[J].植物学报, 1989；31(5):398
3，余建华，程珍，郑尚珍，等.雪兔子中木脂素成分的研究[J].中草药,1997；23(6):283
4，瓦.古巴诺娃，刘杰龙，石玉湖.新疆雪莲的组织培养[J].新疆农业科学,1990；(5):221, http://www.100md.com