NG-硝基-左旋精氨酸甲酯对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脂质过氧化的影响
作者：谢惠芳 田时雨
单位：谢惠芳(第一军医大学珠江医院神经内科，广东 广州 510282)；田时雨(第一军医大学珠江医院神经内科，广东 广州 510282)
关键词：脑缺血再灌注；一氧化氮；脂质过氧化
第一军医大学学报000317 摘要：目的 观察一氧化氮(NO)含量的变化对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脂质过氧化的影响。方法 采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，应用Griss反应法测定脑组织NO含量变化，微量测定法测定超氧物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化产物丙二醛以及NO合酶(NOS)抑制剂NG-硝基-左旋精氨酸甲酯(L-NAME)对它们的影响。结果 脑缺血1 h再灌注1 h脑组织匀浆中NO2-含量升高，SOD活性降低，丙二醛(MDA)含量明显升高，与假手术组比较P<0.01；L-NAME能部分抑制SOD活性的降低及NO2-、MDA含量的升高，与生理盐水治疗对照组比较，P<0.01。结论 小剂量NOS抑制剂能减轻急性脑缺血再灌注损伤脂质过氧化损伤。
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中图分类号：R-33; R743 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0242-03
The effect of NG-nitro-L-arginine methy ester on lipid peroxidation in the rat brain during reperfusion after focal cerebral ischemia
XIE Hui-fang, TIAN Shi-yu
(Department of Neurology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To explore the effects of nitric oxide on lipid peroxidation in the rat brain during reperfusion after focal cerebral ischemia. Methods Focal cerebral ischemia-reperfusion model was made by means of intralumin filament. The concentration of nitric oxide (NO) in the brain tissue was measured using Gress’ method. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the concentration of malondialdehyde (MDA) were determined by using microassay. Results There was a significant increase in the levels of NO product and MDA at 1 h of reperfusion after occlusion of the middle cerebral artery for 1 h. Administration of low-dose nitrin oxide synthase inhibitor, NG-nitro-L-arginine methy ester (L-NAME), prior to reperfusion significantly decreased the levels of NO product and MDA. Conclusion These results indicate that NO plays an important role in the neuronal injury after cerebral inchemic-reperfusion, and the inhibition of NO synthase activity protects against lipid peroxidation during reperfusion after focal cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words: cerebral ischemia reperfusion; nitric oxide; lipid peroxidation
一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种活性很强的自由基，具有广泛的生物学作用，它既是细胞内和细胞间的信使气体分子，又是细胞毒性因子，NO的双重作用决定了它在脑缺血发病机制中的复杂性。为了进一步阐明NO在急性脑缺血再灌注中的作用及其机理，笔者采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型，观察一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)抑制剂NG-硝基-左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methy ester, L-NAME)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脂质过氧化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
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40只雄性Sprague-Dawley成年大鼠，体质量280～330 g(第一军医大学动物实验中心提供)，随机分成5组，即假手术组、缺血1 h再灌注1 h组、L-NAME1(3 mg/kg.b.w.)治疗组、L-NAME2(10 mg/kg.b.w.)治疗组和生理盐水治疗对照组，每组8只。
1.2 动物模型及给药方法
用
用10%水合氯醛3.5 ml/kg.b.w.腹腔注射麻醉大鼠后将其固定在手术台上，颈部左旁中切开，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，在翼腭动脉起始部置一血管夹，结扎切断ECA，在ECA残端的起始部剪一0.2 mm小口，将已经消毒的4-0单丝尼龙线由ECA残端插入使之由ECA经CCA分叉沿ICA入颅，至大脑前动脉，插入深度由分叉部计17.5 mm左右，缺血1 h，抽出尼龙线，于再灌注1 h后处死大鼠取材。L-NAME(Sigma)治疗组于再灌注前5 min腹腔内注射L-NAME(分别为3 mg/kg.b.w.和10 mg/kg.b.w.)，生理盐水对照组于相同时间腹腔内注射等容积的生理盐水，假手术组只是不插入单丝尼龙线，其它步骤同手术组。
, 百拇医药
1.3 MDA、SOD、NO2-的检测
0～4℃条件下快速断头取脑，分离左侧半球的颞叶及顶叶皮质，按脑组织(mg): 冰生理盐水(ml)=100:4的比例在盛有冰块的器皿中用玻璃匀浆管碾磨成脑匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清液–40℃保存待测。硫代巴比妥酸(TBA)法测定脑匀浆MDA，超氧物歧化酶(SOD)的测定采用黄嘌呤氧化法(试剂盒由南京建成生物制品有限公司提供)，NO2-含量的测定按NO2-测定试剂盒(由中国军事医学科学院提供)操作，用分光光度计在545 nm处比色测定光密度后从标准曲线上测出NO2-量。
2 结果
脑缺血1 h再灌注1 h脑组织匀浆中NO2-含量升高，SOD活性降低，MDA含量明显升高，与假手术组比较P<0.01；L-NAME1治疗组能部分抑制SOD活性的降低及NO2-、MDA含量的升高，与生理盐水治疗对照组比较P<0.01，L-NAME2治疗组作用更显著(表1)。
, 百拇医药
表1 L-NAME对大鼠脑组织匀浆NO2-、MDA及SOD 含量的影响(
±s)
Tab.1 Effect of L-NAME on the levels of NO2-, MDA and SOD in brain
tissue after 1 h of ischemia and 1 h of reperfusion (Mean ± SD)
Group
NO2-
(mol/mg.pro)
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MDA
mol/mg.pro)
SOD
(mol/mg.pro)
Sham operation
7.59± 1.07
8.40± 1.20
279.01± 17.5
IR
13.82± 1.73*
16.25± 2.50*
113.61± 14.28*
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NS
9.42± 1.45**
16.43± 1.92
168.80± 26.32**
L-NAME2
7.85± 1.17**
9.91± 1.57**
227.43± 18.69**
IR: ischemia and reperfusion; NS: normal saline;
*P<0.01 vs sham operation group; **P<0.01 vs NS group
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3 讨论
体内的NO是由L-精氨酸经NOS催化产生的，NOS是NO产生的限速因素。近年来研究表明，NO在中枢神经系统损伤中发挥着重要作用，一方面，正常水平的NO是维持血管处于舒张状态的的重要因素，并具有抑制血小板聚集及白细胞粘附于血管内皮，保证脑正常血供，同时还能使NMDA受体下调，从而减少NMDA受体激活导致的细胞损伤；另一方面，NO能与超氧阴离子作用形成过氧亚硝酸阴离子，后者及其分解产物羟自由基能引起脂质过氧化和细胞毒性。
我们的实验发现，脑缺血再灌注损伤早期，脑组织皮质中NO代谢产物NO2-含量增加，应用NOS抑制剂L-NAME能降低NO2-的含量，说明NO2-含量增高是由于内源性NO产生过多所致，脑缺血再灌注损伤时神经末梢释放大量的谷氨酸，刺激NMDA受体，使细胞内Ca2+浓度升高，激活cNOS(nNOS和eNOS)，促进NO的产生[1]。NO表现自由基活性是因为在NO分子轨道上有一不配对的电子，所以极易与O2–反应生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)，ONOO-在pH7.4的半衰期大约是1 s左右，这就使得它在生理条件下的稳态从它生成的位置扩散到反应的靶分子如膜脂和蛋白的巯基，随着脑缺血局部微环境的改变，一旦酸化，立即转化成氧化性很强的振动激发态过氧亚硝酸，同时产生NO2-和类.OH物质，后者比氧自由基具有更强的毒性作用，能使含铁、硫中心的酶类失活致细胞核酸亚硝酸化，破坏DNA螺旋结构[2]，Packer等[3]认为ONOO-形成是氧化应激损伤的主要自由基之一。
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自由基损伤的主要病理机制是引起脂质过氧化，测定LPO稳定的代谢产物丙二醛(MDA)含量可了解脂质过氧化程度[4]。本实验发现，急性脑缺血再灌注损伤早期MDA的变化与NO2-的变化基本一致， L-NAME可抑制内源性NO的增高，同时亦能降低脑缺血再灌注损伤过程中产生MDA的含量。我们认为，首先，在脑缺血再灌注损伤过程中，同时生成的NO和O2-有可能继续互相作用生成ONOO-。其次，在此过程中产生的NO与O2-有某种关联，增多的NO通过cGMP的作用，使细胞内钙离子增加，从而激活细胞膜上的NADPH氧化酶，使其由“休止”状态进入“激活”状态，导致O2-大量增加[5]。
超氧物歧化酶是一种金属蛋白酶，也是机体内非常重要的氧自由基清除剂。在本实验中，脑缺血再灌注损伤过程中，伴随着NO、O2-的升高，SOD则经历一个与之相反的变化过程。脑缺血再灌注损伤过程中，SOD活性下降使其对O2-的清除作用减弱，导致氧自由基对组织细胞损伤加重，也使得O2-与NO反应生成ONOO-的量大大增加，从而导致更严重的组织损伤。本实验还发现，L-NAME抑制NO产生的同时，SOD活性升高，而我们认为NO本身也可能影响SOD的活性。已有研究表明SOD对NO具有调控作用，在脑缺血再灌注时，外源性SOD能使NO释放减少[ 6 ]。
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L-NAME是非特异性NOS抑制剂，对神经细胞及内皮细胞中的NOS均具有抑制作用并呈剂量依赖性[ 7 ]。小剂量NOS抑制剂通过抑制神经元产生的NO可充分起到神经保护作用[8]，本实验发现小剂量NOS抑制剂L-NAME能明显减轻脂质过氧化，进一步肯定了NO自由基在脑缺血再灌注损伤中的病理生理作用，同时也说明NO致神经损伤过程中脂质过氧化作用增强，这可能是NO发挥其神经损伤作用的机制之一。
谢惠芳(1965-),女,浙江绍兴人,1987年毕业于第一军医大学,主治医师,讲师,硕士
参考文献
1.Yamamoto S, Golanov EV, Berger SB et al. Inhibition of nitric oxide synthesis increase focal ischemic infarction in rat[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1992, 12 (5): 717～26.
, 百拇医药
2.赵保路, 李海涛, 侯京武等. 巨噬细胞产生NO.和O2.-自由基的分子机理[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 1998, 14 (3): 328～33.
3.Packer MA, Murphy MA. Peroxynitrite formed by simultanous nitric oxide and superoxide generation causes cyclosporin-A-sensitive mitochondrial calcium efflux and depolarisation [J]. Eur J Biochem, 1995, 234 (1): 231～9.
4.Braughler JM, Hall ED. Central nervous system trauma and stroke: Biochemical consideration for oxygen radical formation and lipid peroxidation[J]. Free Radical Biol Med, 1989, 6 (3): 289～301.
, 百拇医药
5.陈瑗, 周玫. 自由基医学[M]. 北京: 人民军医出版社, 1991. 112.
6.Kumura E, Yoshimine J, Kubo S et al. Effects of superfusion after focal cerebral ischemia in rats[J]. Neurosci-Lett, 1995, 200 (2): 137～40.
7.Traystman RJ, Moore LE, Helfear MA et al. Nitro-L-arginine analogues dose-and time-related nitric oxide synthase inhibition in brain [J]. Stroke, 1995, 26 (5): 664～9.
8.Buisson A, Plotkine M, Boulu RG. The neuroprotective effect of nitric oxide inhibitor in rat model of focal cerebral ischemia[J]. Br J Pharmacol, 1992, 106 (4): 766～7.
1999-02-02, http://www.100md.com
单位：谢惠芳(第一军医大学珠江医院神经内科，广东 广州 510282)；田时雨(第一军医大学珠江医院神经内科，广东 广州 510282)
关键词：脑缺血再灌注；一氧化氮；脂质过氧化
第一军医大学学报000317 摘要：目的 观察一氧化氮(NO)含量的变化对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脂质过氧化的影响。方法 采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，应用Griss反应法测定脑组织NO含量变化，微量测定法测定超氧物歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化产物丙二醛以及NO合酶(NOS)抑制剂NG-硝基-左旋精氨酸甲酯(L-NAME)对它们的影响。结果 脑缺血1 h再灌注1 h脑组织匀浆中NO2-含量升高，SOD活性降低，丙二醛(MDA)含量明显升高，与假手术组比较P<0.01；L-NAME能部分抑制SOD活性的降低及NO2-、MDA含量的升高，与生理盐水治疗对照组比较，P<0.01。结论 小剂量NOS抑制剂能减轻急性脑缺血再灌注损伤脂质过氧化损伤。
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中图分类号：R-33; R743 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)03-0242-03
The effect of NG-nitro-L-arginine methy ester on lipid peroxidation in the rat brain during reperfusion after focal cerebral ischemia
XIE Hui-fang, TIAN Shi-yu
(Department of Neurology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To explore the effects of nitric oxide on lipid peroxidation in the rat brain during reperfusion after focal cerebral ischemia. Methods Focal cerebral ischemia-reperfusion model was made by means of intralumin filament. The concentration of nitric oxide (NO) in the brain tissue was measured using Gress’ method. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the concentration of malondialdehyde (MDA) were determined by using microassay. Results There was a significant increase in the levels of NO product and MDA at 1 h of reperfusion after occlusion of the middle cerebral artery for 1 h. Administration of low-dose nitrin oxide synthase inhibitor, NG-nitro-L-arginine methy ester (L-NAME), prior to reperfusion significantly decreased the levels of NO product and MDA. Conclusion These results indicate that NO plays an important role in the neuronal injury after cerebral inchemic-reperfusion, and the inhibition of NO synthase activity protects against lipid peroxidation during reperfusion after focal cerebral ischemia.
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Key words: cerebral ischemia reperfusion; nitric oxide; lipid peroxidation
一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种活性很强的自由基，具有广泛的生物学作用，它既是细胞内和细胞间的信使气体分子，又是细胞毒性因子，NO的双重作用决定了它在脑缺血发病机制中的复杂性。为了进一步阐明NO在急性脑缺血再灌注中的作用及其机理，笔者采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型，观察一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)抑制剂NG-硝基-左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methy ester, L-NAME)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脂质过氧化的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
, http://www.100md.com
40只雄性Sprague-Dawley成年大鼠，体质量280～330 g(第一军医大学动物实验中心提供)，随机分成5组，即假手术组、缺血1 h再灌注1 h组、L-NAME1(3 mg/kg.b.w.)治疗组、L-NAME2(10 mg/kg.b.w.)治疗组和生理盐水治疗对照组，每组8只。
1.2 动物模型及给药方法
用
用10%水合氯醛3.5 ml/kg.b.w.腹腔注射麻醉大鼠后将其固定在手术台上，颈部左旁中切开，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，在翼腭动脉起始部置一血管夹，结扎切断ECA，在ECA残端的起始部剪一0.2 mm小口，将已经消毒的4-0单丝尼龙线由ECA残端插入使之由ECA经CCA分叉沿ICA入颅，至大脑前动脉，插入深度由分叉部计17.5 mm左右，缺血1 h，抽出尼龙线，于再灌注1 h后处死大鼠取材。L-NAME(Sigma)治疗组于再灌注前5 min腹腔内注射L-NAME(分别为3 mg/kg.b.w.和10 mg/kg.b.w.)，生理盐水对照组于相同时间腹腔内注射等容积的生理盐水，假手术组只是不插入单丝尼龙线，其它步骤同手术组。
, 百拇医药
1.3 MDA、SOD、NO2-的检测
0～4℃条件下快速断头取脑，分离左侧半球的颞叶及顶叶皮质，按脑组织(mg): 冰生理盐水(ml)=100:4的比例在盛有冰块的器皿中用玻璃匀浆管碾磨成脑匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清液–40℃保存待测。硫代巴比妥酸(TBA)法测定脑匀浆MDA，超氧物歧化酶(SOD)的测定采用黄嘌呤氧化法(试剂盒由南京建成生物制品有限公司提供)，NO2-含量的测定按NO2-测定试剂盒(由中国军事医学科学院提供)操作，用分光光度计在545 nm处比色测定光密度后从标准曲线上测出NO2-量。
2 结果
脑缺血1 h再灌注1 h脑组织匀浆中NO2-含量升高，SOD活性降低，MDA含量明显升高，与假手术组比较P<0.01；L-NAME1治疗组能部分抑制SOD活性的降低及NO2-、MDA含量的升高，与生理盐水治疗对照组比较P<0.01，L-NAME2治疗组作用更显著(表1)。
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表1 L-NAME对大鼠脑组织匀浆NO2-、MDA及SOD 含量的影响(
±s)Tab.1 Effect of L-NAME on the levels of NO2-, MDA and SOD in brain
tissue after 1 h of ischemia and 1 h of reperfusion (Mean ± SD)
Group
NO2-
(mol/mg.pro)
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MDA
mol/mg.pro)
SOD
(mol/mg.pro)
Sham operation
7.59± 1.07
8.40± 1.20
279.01± 17.5
IR
13.82± 1.73*
16.25± 2.50*
113.61± 14.28*
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NS
9.42± 1.45**
16.43± 1.92
168.80± 26.32**
L-NAME2
7.85± 1.17**
9.91± 1.57**
227.43± 18.69**
IR: ischemia and reperfusion; NS: normal saline;
*P<0.01 vs sham operation group; **P<0.01 vs NS group
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3 讨论
体内的NO是由L-精氨酸经NOS催化产生的，NOS是NO产生的限速因素。近年来研究表明，NO在中枢神经系统损伤中发挥着重要作用，一方面，正常水平的NO是维持血管处于舒张状态的的重要因素，并具有抑制血小板聚集及白细胞粘附于血管内皮，保证脑正常血供，同时还能使NMDA受体下调，从而减少NMDA受体激活导致的细胞损伤；另一方面，NO能与超氧阴离子作用形成过氧亚硝酸阴离子，后者及其分解产物羟自由基能引起脂质过氧化和细胞毒性。
我们的实验发现，脑缺血再灌注损伤早期，脑组织皮质中NO代谢产物NO2-含量增加，应用NOS抑制剂L-NAME能降低NO2-的含量，说明NO2-含量增高是由于内源性NO产生过多所致，脑缺血再灌注损伤时神经末梢释放大量的谷氨酸，刺激NMDA受体，使细胞内Ca2+浓度升高，激活cNOS(nNOS和eNOS)，促进NO的产生[1]。NO表现自由基活性是因为在NO分子轨道上有一不配对的电子，所以极易与O2–反应生成过氧亚硝基阴离子(ONOO-)，ONOO-在pH7.4的半衰期大约是1 s左右，这就使得它在生理条件下的稳态从它生成的位置扩散到反应的靶分子如膜脂和蛋白的巯基，随着脑缺血局部微环境的改变，一旦酸化，立即转化成氧化性很强的振动激发态过氧亚硝酸，同时产生NO2-和类.OH物质，后者比氧自由基具有更强的毒性作用，能使含铁、硫中心的酶类失活致细胞核酸亚硝酸化，破坏DNA螺旋结构[2]，Packer等[3]认为ONOO-形成是氧化应激损伤的主要自由基之一。
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自由基损伤的主要病理机制是引起脂质过氧化，测定LPO稳定的代谢产物丙二醛(MDA)含量可了解脂质过氧化程度[4]。本实验发现，急性脑缺血再灌注损伤早期MDA的变化与NO2-的变化基本一致， L-NAME可抑制内源性NO的增高，同时亦能降低脑缺血再灌注损伤过程中产生MDA的含量。我们认为，首先，在脑缺血再灌注损伤过程中，同时生成的NO和O2-有可能继续互相作用生成ONOO-。其次，在此过程中产生的NO与O2-有某种关联，增多的NO通过cGMP的作用，使细胞内钙离子增加，从而激活细胞膜上的NADPH氧化酶，使其由“休止”状态进入“激活”状态，导致O2-大量增加[5]。
超氧物歧化酶是一种金属蛋白酶，也是机体内非常重要的氧自由基清除剂。在本实验中，脑缺血再灌注损伤过程中，伴随着NO、O2-的升高，SOD则经历一个与之相反的变化过程。脑缺血再灌注损伤过程中，SOD活性下降使其对O2-的清除作用减弱，导致氧自由基对组织细胞损伤加重，也使得O2-与NO反应生成ONOO-的量大大增加，从而导致更严重的组织损伤。本实验还发现，L-NAME抑制NO产生的同时，SOD活性升高，而我们认为NO本身也可能影响SOD的活性。已有研究表明SOD对NO具有调控作用，在脑缺血再灌注时，外源性SOD能使NO释放减少[ 6 ]。
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L-NAME是非特异性NOS抑制剂，对神经细胞及内皮细胞中的NOS均具有抑制作用并呈剂量依赖性[ 7 ]。小剂量NOS抑制剂通过抑制神经元产生的NO可充分起到神经保护作用[8]，本实验发现小剂量NOS抑制剂L-NAME能明显减轻脂质过氧化，进一步肯定了NO自由基在脑缺血再灌注损伤中的病理生理作用，同时也说明NO致神经损伤过程中脂质过氧化作用增强，这可能是NO发挥其神经损伤作用的机制之一。
谢惠芳(1965-),女,浙江绍兴人,1987年毕业于第一军医大学,主治医师,讲师,硕士
参考文献
1.Yamamoto S, Golanov EV, Berger SB et al. Inhibition of nitric oxide synthesis increase focal ischemic infarction in rat[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1992, 12 (5): 717～26.
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2.赵保路, 李海涛, 侯京武等. 巨噬细胞产生NO.和O2.-自由基的分子机理[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 1998, 14 (3): 328～33.
3.Packer MA, Murphy MA. Peroxynitrite formed by simultanous nitric oxide and superoxide generation causes cyclosporin-A-sensitive mitochondrial calcium efflux and depolarisation [J]. Eur J Biochem, 1995, 234 (1): 231～9.
4.Braughler JM, Hall ED. Central nervous system trauma and stroke: Biochemical consideration for oxygen radical formation and lipid peroxidation[J]. Free Radical Biol Med, 1989, 6 (3): 289～301.
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5.陈瑗, 周玫. 自由基医学[M]. 北京: 人民军医出版社, 1991. 112.
6.Kumura E, Yoshimine J, Kubo S et al. Effects of superfusion after focal cerebral ischemia in rats[J]. Neurosci-Lett, 1995, 200 (2): 137～40.
7.Traystman RJ, Moore LE, Helfear MA et al. Nitro-L-arginine analogues dose-and time-related nitric oxide synthase inhibition in brain [J]. Stroke, 1995, 26 (5): 664～9.
8.Buisson A, Plotkine M, Boulu RG. The neuroprotective effect of nitric oxide inhibitor in rat model of focal cerebral ischemia[J]. Br J Pharmacol, 1992, 106 (4): 766～7.
1999-02-02, http://www.100md.com