小鼠血浆及组织中芦丁和槲皮素HPLC检测方法的建立
作者：汤洁 王剑 沈丽杰
单位：汤洁(解放军第202医院优生优育中心实验室，沈阳 110003)；王剑 沈丽杰(沈阳康利制药厂，沈阳 110003)
关键词：芦丁；槲皮素；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报00zk18 摘 要 血浆或组织匀浆液标本经甲醇-冰醋酸提取，采用HPLC法测定小鼠血浆和组织中芦丁和槲皮素的含量.芦丁和槲皮素线性范围均在1～150 μg/mL内;最低检测浓度芦丁为0.3 μg/mL、槲皮素为0.5 μg/mL.芦丁及槲皮素日内、日间RSD分别在2.04%～6.87%、2.32%～7.03%范围内；芦丁的方法回收率为89.5%～104.6%、槲皮素为87.6%～105.7%；提取回收率芦丁为70.9%～95.6%、槲皮素为79.9%～99.3%.建立了血浆或组织中芦丁和槲皮素HPLC测定法，方法简便、灵敏、可靠，能满足体内药物分析的需要.
, 百拇医药
分类号 R917
Determination of the Rutin and Quercetin in Plasma and Tissues of Mice by HPLC
Tang Jie, Wang Jian, Shen Lijie
(No.202 Hospital of PLA,Shenyang 110003)
Abstract We used ODS column and the mobile phase acetonitrile-water and detected the concentration of rutin and quercetin in plasma and tissues of mice at 360 nm.The linearity of rutin and quercetin was within the range of 1～150 μg/mL.The limit of detection of rutin was 0.3 μg/mL and that of quercetin was 0.5 μg/mL. The method showed good precision, and the recovery of rutin from plasma and tissues was 89.5%～104.6%,that of quercetin was 87.6%～105.7%.The extraction recovery of rutin was 70.9%～95.6%, that of quercetin was 79.9%～99.3%.The inter-day RSD and intra-day RSD of rutin were 2.04%～6.87%, those of quercetin were 2.32%～7.03%,respectively.An HPLC method was established for the determination of rutin and quercetin in plasma and tissues of mice.The results showed that this method was simple, sensitive and good enough to be used in clinical study for rutin and quercetin.
, 百拇医药
Key words rutin；quercetin；HPLC
芦丁、槲皮素为黄酮类化合物，具有抗炎祛脂作用，能维持血管抵抗力、减少脆性，在心脑血管等方面具有广泛的药理功效〔1〕.已有报道用紫外分光光度法〔2，3〕、高效液相色谱法〔4，5〕等测定各种制剂中黄酮化合物的含量.作者以香兰素为内标，建立了血浆及各种组织(心、肝、脾、肾、肺、胃、肌肉)中芦丁和槲皮素HPLC的测定方法，为进行芦丁和槲皮素的体内药物分析及相关研究提供了一个灵敏、可靠的检测手段.
1 仪器与材料
美国Beckman公司System Gold高效液相色谱仪：SDM 110B色谱泵，AIM 406紫外检测器，ULTRASPHERE ODS柱(5 μm,4.6 mm×250 mm).流动相：芦丁为乙腈-水(V∶V=19∶81)，槲皮素为乙腈-水(V∶V=33∶67).流速为0.8 mL/min，检测波长为360 nm.芦丁、槲皮素由中国药品生物制品检定所提供，香兰素、冰醋酸为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯.小鼠(25～30 g)由沈阳药科大学动物实验中心提供.
, 百拇医药
2 实验方法
2.1 采集标本
取小鼠，断头处死，立即取血0.25 mL左右，肝素抗凝，制成血浆，同时迅速取出心脏、肝、脾、肺、肾、胃和肌肉组织，滤纸吸干，分别称取0.2 g各组织加入生理盐水0.5 mL，制成匀浆，制得血浆及各组织匀浆样品.
2.2 提取方法
精确吸取样品(血浆或组织匀浆液)0.1 mL,置于1.0 mL离心管中，加入10 μL内标液(含香兰素1.51 mg/mL),加入0.4 mL提取液(甲醇-冰醋酸=9∶1，V∶V)，振荡3 min，10 000 r/min离心2 min，取上清液进样，进行高效液相色谱分析.
2.3 绘制标准曲线
于空白样品(血浆或组织匀浆液)中加入不同量的芦丁和槲皮素标准液，配成5,10,20,40,60,80,100,150 μg/mL系列浓度，按上述方法提取测定.芦丁、槲皮素的浓度按检测药物的峰高与内标峰高比值进行计算，然后以药物标准浓度为横坐标，峰高比为纵坐标绘制标准曲线.
, 百拇医药
3 结果与讨论
3.1 色谱结果
芦丁和血浆(或组织匀浆液)及内标香兰素的分离效果良好，芦丁及内标物的保留时间分别为7.4 min，9.5 min；槲皮素和血浆(或组织匀浆液)及内标香兰素的分离效果良好，槲皮素及内标物的保留时间分别为8.3 min，5.1 min.
3.2 线性关系
芦丁及槲皮素浓度在1～150 μg/mL范围内标准曲线相关性良好，回归方程为Y=A+BX，其A、B、r值见表1，表2.
Tab.1 The calibration equation of rutin in plasma and tissues(n=5) samples
A
, 百拇医药
B
r
kidney
0.123 3
0.139 1
0.995
lung
0.088 0
0.135 2
0.998
heart
0.424 4
0.221 6
, 百拇医药
0.996
liver
0.185 8
0.160 4
0.999
spleen
0.209 6
0.184 8
0.997
stomach
0.150 9
0.202 9
, 百拇医药
0.999
muscle
0.107 5
0.143 9
0.997
plasma
0.153 0
0.015 2
0.997
Tab.2 The calibration equation of quercetin in plasma and tissues(n=5) samples
A
, 百拇医药
B
r
kidney
0.023 7
0.148 6
0.995
lung
0.090 9
0.197 2
0.999
heart
0.021 9
0.210 4
, 百拇医药
0.998
liver
0.217 6
0.208 8
0.996
spleen
0.090 4
0.223 5
0.997
stomach
0.017 2
0.176 4
, 百拇医药
0.999
muscle
0.164 7
0.191 6
0.997
plasma
0.253 8
0.031 0
0.998
3.3 精密度、回收率和灵敏度
分别取血浆及各组织样品配制成芦丁、槲皮素浓度为5,10,50,100 μg/mL样品各5份，进行HPLC测定.由标准曲线计算回收率及日内和日间RSD.芦丁日内、日间RSD在2.04%～6.87%范围内,槲皮素日内、日间RSD在2.32%～7.03%范围内.血浆及各组织中不同浓度芦丁的方法回收率为89.5%～104.6%、槲皮素为87.6%～105.7%；提取回收率芦丁为70.9%～95.6%、槲皮素为79.9%～99.3%.血浆中芦丁和槲皮素的最低检测限分别为0.3 μg/mL、0.5 μg/mL.芦丁和槲皮素在组织匀浆液中的最低检测限均为1.25 μg/g.
, 百拇医药
3.4 药物在生物样品中的稳定性
于空白血浆及各组织样品中加入芦丁或槲皮素标准品，配制成20 μg/mL浓度生物样品数份，置于-20℃冰箱保存，分别于当日、第5,15,30 d按实验方法进行测定，RSD均小于7.11%，说明在-20℃冰箱保存下，这两种药物在血浆及各组织中至少可稳定一个月.
参考文献
1，刘桂霞，孙玉玮，金兆祥.银杏叶的研究进展.国外医药.植物药分册,1994,9(1):10～14
2，庄向平,虞杏英,杨更生,等.银杏叶中黄酮含量的测定和提取方法.中草药，1992,23(3):122～123
3，刘重芳,吴志荣,方青汉.银杏叶总黄酮提取工艺探讨.中成药，1992,14(7):7～8
4，Sticher O. Quality of ginkgo preparations.Planta Med,1993,59:2～4
5，刘松青,唐先哲,马文秀,等.高效液相色谱法测定银杏制品中总黄酮.中草药,1995,26(9):461～463
收稿日期:2000-04-07, 百拇医药
单位：汤洁(解放军第202医院优生优育中心实验室，沈阳 110003)；王剑 沈丽杰(沈阳康利制药厂，沈阳 110003)
关键词：芦丁；槲皮素；高效液相色谱法
沈阳药科大学学报00zk18 摘 要 血浆或组织匀浆液标本经甲醇-冰醋酸提取，采用HPLC法测定小鼠血浆和组织中芦丁和槲皮素的含量.芦丁和槲皮素线性范围均在1～150 μg/mL内;最低检测浓度芦丁为0.3 μg/mL、槲皮素为0.5 μg/mL.芦丁及槲皮素日内、日间RSD分别在2.04%～6.87%、2.32%～7.03%范围内；芦丁的方法回收率为89.5%～104.6%、槲皮素为87.6%～105.7%；提取回收率芦丁为70.9%～95.6%、槲皮素为79.9%～99.3%.建立了血浆或组织中芦丁和槲皮素HPLC测定法，方法简便、灵敏、可靠，能满足体内药物分析的需要.
, 百拇医药
分类号 R917
Determination of the Rutin and Quercetin in Plasma and Tissues of Mice by HPLC
Tang Jie, Wang Jian, Shen Lijie
(No.202 Hospital of PLA,Shenyang 110003)
Abstract We used ODS column and the mobile phase acetonitrile-water and detected the concentration of rutin and quercetin in plasma and tissues of mice at 360 nm.The linearity of rutin and quercetin was within the range of 1～150 μg/mL.The limit of detection of rutin was 0.3 μg/mL and that of quercetin was 0.5 μg/mL. The method showed good precision, and the recovery of rutin from plasma and tissues was 89.5%～104.6%,that of quercetin was 87.6%～105.7%.The extraction recovery of rutin was 70.9%～95.6%, that of quercetin was 79.9%～99.3%.The inter-day RSD and intra-day RSD of rutin were 2.04%～6.87%, those of quercetin were 2.32%～7.03%,respectively.An HPLC method was established for the determination of rutin and quercetin in plasma and tissues of mice.The results showed that this method was simple, sensitive and good enough to be used in clinical study for rutin and quercetin.
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Key words rutin；quercetin；HPLC
芦丁、槲皮素为黄酮类化合物，具有抗炎祛脂作用，能维持血管抵抗力、减少脆性，在心脑血管等方面具有广泛的药理功效〔1〕.已有报道用紫外分光光度法〔2，3〕、高效液相色谱法〔4，5〕等测定各种制剂中黄酮化合物的含量.作者以香兰素为内标，建立了血浆及各种组织(心、肝、脾、肾、肺、胃、肌肉)中芦丁和槲皮素HPLC的测定方法，为进行芦丁和槲皮素的体内药物分析及相关研究提供了一个灵敏、可靠的检测手段.
1 仪器与材料
美国Beckman公司System Gold高效液相色谱仪：SDM 110B色谱泵，AIM 406紫外检测器，ULTRASPHERE ODS柱(5 μm,4.6 mm×250 mm).流动相：芦丁为乙腈-水(V∶V=19∶81)，槲皮素为乙腈-水(V∶V=33∶67).流速为0.8 mL/min，检测波长为360 nm.芦丁、槲皮素由中国药品生物制品检定所提供，香兰素、冰醋酸为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯.小鼠(25～30 g)由沈阳药科大学动物实验中心提供.
, 百拇医药
2 实验方法
2.1 采集标本
取小鼠，断头处死，立即取血0.25 mL左右，肝素抗凝，制成血浆，同时迅速取出心脏、肝、脾、肺、肾、胃和肌肉组织，滤纸吸干，分别称取0.2 g各组织加入生理盐水0.5 mL，制成匀浆，制得血浆及各组织匀浆样品.
2.2 提取方法
精确吸取样品(血浆或组织匀浆液)0.1 mL,置于1.0 mL离心管中，加入10 μL内标液(含香兰素1.51 mg/mL),加入0.4 mL提取液(甲醇-冰醋酸=9∶1，V∶V)，振荡3 min，10 000 r/min离心2 min，取上清液进样，进行高效液相色谱分析.
2.3 绘制标准曲线
于空白样品(血浆或组织匀浆液)中加入不同量的芦丁和槲皮素标准液，配成5,10,20,40,60,80,100,150 μg/mL系列浓度，按上述方法提取测定.芦丁、槲皮素的浓度按检测药物的峰高与内标峰高比值进行计算，然后以药物标准浓度为横坐标，峰高比为纵坐标绘制标准曲线.
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3 结果与讨论
3.1 色谱结果
芦丁和血浆(或组织匀浆液)及内标香兰素的分离效果良好，芦丁及内标物的保留时间分别为7.4 min，9.5 min；槲皮素和血浆(或组织匀浆液)及内标香兰素的分离效果良好，槲皮素及内标物的保留时间分别为8.3 min，5.1 min.
3.2 线性关系
芦丁及槲皮素浓度在1～150 μg/mL范围内标准曲线相关性良好，回归方程为Y=A+BX，其A、B、r值见表1，表2.
Tab.1 The calibration equation of rutin in plasma and tissues(n=5) samples
A
, 百拇医药
B
r
kidney
0.123 3
0.139 1
0.995
lung
0.088 0
0.135 2
0.998
heart
0.424 4
0.221 6
, 百拇医药
0.996
liver
0.185 8
0.160 4
0.999
spleen
0.209 6
0.184 8
0.997
stomach
0.150 9
0.202 9
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0.999
muscle
0.107 5
0.143 9
0.997
plasma
0.153 0
0.015 2
0.997
Tab.2 The calibration equation of quercetin in plasma and tissues(n=5) samples
A
, 百拇医药
B
r
kidney
0.023 7
0.148 6
0.995
lung
0.090 9
0.197 2
0.999
heart
0.021 9
0.210 4
, 百拇医药
0.998
liver
0.217 6
0.208 8
0.996
spleen
0.090 4
0.223 5
0.997
stomach
0.017 2
0.176 4
, 百拇医药
0.999
muscle
0.164 7
0.191 6
0.997
plasma
0.253 8
0.031 0
0.998
3.3 精密度、回收率和灵敏度
分别取血浆及各组织样品配制成芦丁、槲皮素浓度为5,10,50,100 μg/mL样品各5份，进行HPLC测定.由标准曲线计算回收率及日内和日间RSD.芦丁日内、日间RSD在2.04%～6.87%范围内,槲皮素日内、日间RSD在2.32%～7.03%范围内.血浆及各组织中不同浓度芦丁的方法回收率为89.5%～104.6%、槲皮素为87.6%～105.7%；提取回收率芦丁为70.9%～95.6%、槲皮素为79.9%～99.3%.血浆中芦丁和槲皮素的最低检测限分别为0.3 μg/mL、0.5 μg/mL.芦丁和槲皮素在组织匀浆液中的最低检测限均为1.25 μg/g.
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3.4 药物在生物样品中的稳定性
于空白血浆及各组织样品中加入芦丁或槲皮素标准品，配制成20 μg/mL浓度生物样品数份，置于-20℃冰箱保存，分别于当日、第5,15,30 d按实验方法进行测定，RSD均小于7.11%，说明在-20℃冰箱保存下，这两种药物在血浆及各组织中至少可稳定一个月.
参考文献
1，刘桂霞，孙玉玮，金兆祥.银杏叶的研究进展.国外医药.植物药分册,1994,9(1):10～14
2，庄向平,虞杏英,杨更生,等.银杏叶中黄酮含量的测定和提取方法.中草药，1992,23(3):122～123
3，刘重芳,吴志荣,方青汉.银杏叶总黄酮提取工艺探讨.中成药，1992,14(7):7～8
4，Sticher O. Quality of ginkgo preparations.Planta Med,1993,59:2～4
5，刘松青,唐先哲,马文秀,等.高效液相色谱法测定银杏制品中总黄酮.中草药,1995,26(9):461～463
收稿日期:2000-04-07, 百拇医药