肠病毒RNA和抗ANT抗体在健康献血员中检出的意义
作者：胡丽华 苑海涛 廖玉华
单位：胡丽华(同济医科大学附属协和医院输血科 武汉，430 022)；苑海涛(同济医科大学心血管病研究所)；廖玉华(同济医科大学心血管病研究所)
关键词：肠病毒厚；健康者；心肌病；充血性
临床血液学杂志000508 摘要 目的：探讨肠病毒RNA和抗ANT抗体在健康献血员中检 出的临床意义。方法：应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和逆转录-聚合酶链式反应(RT- PCR)方法对健康献血员和扩张型心肌病(DCM)患者进行抗心肌多肽自身抗体(抗ANT抗体) 和肠病毒(RNA)的检测。结果：48例健康献血员中有4例抗ANT抗体阳性(阳性率为8.3%), 3 例肠病毒RNA阳性(阳性率为6.3%)，而48例DCM患者中有31例抗ANT抗体阳性(阳性率 为64.6%), 29例肠病毒RNA阳性(阳性率为60.4%)，两组比较差异有显著性意义( P<0.05)。在DCM组中，自身抗体和肠病毒RNA的检出具有一致性(r=0.56 )，而健康献血员中，二者则没有相关性(r=0.08)。 结论：健康人可能存在肠病毒隐性感染，但不一定能激活自身免疫系统引 起自身免疫损伤而导致DCM；而肠病毒持续感染与肠病毒感染后激活自身免疫系统引起自身 免疫损伤则可能是DCM的主要发病机制。
, http://www.100md.com
The signficance of enterovirus RNA and
antoantibody against ANT in healthy donors
HU Li-hua
(Department of Transfusion,Union Hospital,Tongi Medical Uni versity,Wuhan 430022)
YUAN Hai-tao LIAO Yu-hua
(Instiute of Cardiology,Union Hospital,Tongji Medical University)
Abstract Objective:To study the signficance of entero virus RNA and antoantibody against ANT in healthy donors.Method:Enterovirus RNA and autoantibody against cardiac pe ptide derived from ANT were detected with RT-PCR and ELISA respectively in two groups of healthy donors(HD) and patients with dilated cardiomyopathy (DCM).Result:Of 48 sera from HD group only 4 (8.3%) bound to the peptide,and EVs-RNA was detected in 3(6.3%) sera of them.But in DCM gr oup,there were 31 (64.6%) and 29(60.4%) sera were positive in detection of autoantibody and enterovirus RNA.Moreover,the autoantibody against ANT had th e EVs-RNA infection had marked relationship in patients with DCM (r=0.56 ),but this correlation was not found in HD group.Conclusion:Inapparent infection of enterovirus may be exis t in healths,but this kind of infection has little chance to activate the immune system and result in immune injury even DCM.On the contrary,immune injury resul ts from activation of immune systeme by enterovirus persistent infection maybe t he main pathogenesis of DCM.
, 百拇医药
Key words Enterovirus Blood donor Dilated cardiomyopathy
近年来，我们在检测扩张型心肌病(DCM)患者血清肠病毒RNA 和抗心肌线粒体ADP/ATP载体(以下简称ANT)抗体时，以健康献血员血清作为阴性对照，发 现在少数健康献血员血清中也可以检测出上述病毒和自身抗体〔1〕。由于肠病毒感 染和抗ANT抗体与扩张型心肌病的异常免疫应答有关，抗ANT抗体可以介导心肌细胞钙电流增 加和钙超负荷，导致细胞损害〔2～4〕。由于肠病毒引起的呼吸道和肠道感染容易在 人群中流行，在健康献血员血清中检测出肠病毒RNA和抗ANT抗体是否有临床意义，值得关注 。我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA法)对48例健康献血 员血清肠病毒RNA和抗ANT抗体进行了检测，并与同时48例DCM患者检测结果进行了对比观察，对抗体阳性和病毒阳性的献血员及其受血者进行了追踪观察，现将结果 报告如下。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
本组96例，健康献血员(HD)组：健康献血员48例，男32例，女16例，年龄37.8±17 .4岁。采血前3周内无上呼吸道感染、急性肠炎等病史。DCM组：DCM患者48例，男26例， 女22例，年龄42.3±18.2岁。临床诊断参照1995年WHO/ISFC心肌病的定义和分类标 准进行〔6〕。对健康献血员检测结果异常者及其受血者进行3个月病原学监测和临床 随访。
1.2 肠病毒RNA检测
1.2.1 肠病毒RNA的提取：取血清100 μl，依次加入GITC变性 液200 μl，氯仿-异戊醇(49：1)50 μl，2 mol/L NaAc 25 μl(pH4.0)，水饱和酚 200 μl。剧烈振荡15 s后置-20℃冷却10 min，再以12 000 r/min离心5 min。取上清200 μl加入等体积异丙醇，在-20℃中静置1 h，以12 000 r/min离心10 min，弃上清液用乙醇 洗涤沉淀，开盖自然挥发或烘干备用。
, 百拇医药
1.2.2 RT-PCR：肠病毒RNA提取后再按以下比例加入RT-PCR各成 分：双蒸水14.35 μl，10×Buffer 2 μl，15 mmol MgCL22 μl，10 mmol/L dNTP 各0.1μl共0.4 μl，引物P1(50 pmol)0.4 μl，P2 (50 pmol)0.4 μl，T aq酶0.2 μl，逆转录酶AMV 0.25 μl。42℃恒温水浴逆转录30 min即可进行扩增 。扩增程序如下：94℃变性5 min；94℃变性30 s；60℃复性30 s；72℃延伸90 s；共30个 循环，再在72℃中延伸5 min。
1.2.3 电泳：取扩增产物6 μl加溴酚蓝显示剂点样于2%琼脂糖 凝胶(含EB0.5 μg/ml),100 V电泳30 min，于紫外线灯下观察结果。
1.3 多肽合成
根据计算机预测心肌ANT抗原决定簇的氨基酸序列，在多肽合成仪(PSSM-8型Shimadzu公司 生产)上以固相合成法合成ANT多肽，用高压液相色谱法对合成产物的纯度进行鉴定，其纯 度>95%。
, 百拇医药
1.4 抗ANT抗体检测
以碳酸盐缓冲液 (pH9.6) 稀释ANT多肽 (终浓度50 μg/ml),包被96孔板，每孔100 μl ，置4℃中过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01 mol/L PBS-Tween 20) 加满各孔，置3 min，洗涤3次，然后加入待检血清(1∶100)，以37℃水温浴2 h。洗涤后 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(1∶3 000)(同济医学院附属协和医院病毒室 产品)，以37℃水温浴1 h洗涤后加入0.03% 双氧水和0.01%TMB反应15 min后，以2 mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处读数并记录OD值，以大于健康组OD值的均数与2. 1倍标准差之和为阳性。
1.5 统计方法
数据处理采用χ2检验，作相关分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 健康献血员与DCM患者抗ANT抗体和肠病毒RNA的对比结果
48例DCM患者中，抗ANT抗体和肠病毒RNA阳性例数分别为31例和29例，阳性率分别为64.6 %和60.4%；48例健康献血员中抗体和肠病毒RNA阳性例数分别为4例和3例，阳性率分 别为8.3%和6.3%，两组之间差异具有显著性意义(P<0.01)。在DCM组31 例抗ANT抗体阳性患者中，25例肠病毒RNA阳性，而17例抗ANT抗体阴性患者中，仅4例肠病毒 RNA阳性，两检测结果具有高度的一致性(χ2=12.68,P<0.01,r=0.56 )。说明在DCM患者中，肠病毒感染与抗ANT抗体的产生具有一定的关系。正常献血员组抗 ANT抗体与肠病毒RNA检出结果则没有一致性(表1)。
表1 正常献血员抗ANT抗体与肠病毒RNA检测结果的一致性分析 抗ANT抗体
外周血肠病毒RNA
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合计
阳性
阴性
阳性
0
4
4
阴性
3
41
44
合计
3
45
, 百拇医药
48
注：χ2=0，P>0.05，r=0.082.2 健康献血员的病原学监测和临床随访
我们对3例外周血肠病毒RNA阳性和4例抗ANT抗体阳性的健康献血员进行了3个月的随访。3例 肠病毒RNA阳性的献血者中有2例仍为阳性，3例受血者输注肠病毒RNA阳性供血者血清中均可 检测出肠病毒RNA。4例抗ANT抗体阳性献血者抗ANT抗体均为阴性。在临床随访中，3例肠病 毒RNA阳性和4例抗ANT抗体阳性的献血者均无心悸、胸闷、气短等症状，心电图检查没有发 现心律失常和心肌受损；7例受血者经过3个月的观察与随访，均没有发生心律失常和心悸、 胸闷、气短等症状及心电图变化。
3 讨论
肠病毒主要通过呼吸道、消化道侵入人体，可以损伤神经组织和肌肉组织，容易 引起心脏炎症性病变，其中CVB是引起炎症性心脏病的最常见的病毒。研究已经证实，柯萨 奇病毒B3外壳蛋白与人体内线粒体ADP/ATP载体蛋白有一段高度同源的序列。肠病毒感染， 尤其是CVB病毒感染人体后，激活人体免疫系统，产生抗病毒抗体。此抗体可以与ADP/ATP载 体蛋白发生交叉反应，引起心肌自身免疫损伤。Schwimmbeck等根据这段高度同源序列的氨 基酸顺序合成多肽，并作为抗原去检测病毒性心脏病患者血清中的抗多肽抗体，发现有很高 的特异性和敏感性。
, 百拇医药
本研究应用酶联免疫吸附实验和RT-PCR两种方法对正常献血员和扩张型心肌病(DCM)患者 进行抗心肌多肽自身抗体和肠病毒的检测。结果发现DCM患者中肠病毒的感染率和抗ANT自身 抗体的检出率明显高于健康献血员组。追踪调查肠病毒RNA阳性和抗ANT自身抗体阳性的献血 员，没有发现病毒性心脏病的临床表现。
在DCM患者中，肠病毒RNA与抗ANT自身抗体的检出有明显的一致性，而在健康献血 员中，二者则没有相关性。由此证明在DCM的发病中，肠病毒感染及其激活的自身免疫反应 是重要因素。正常人可能存在肠病毒隐性感染，但能否激活自身免疫反应并导致病毒性心脏 病与多种因素有关，如机体感染病毒时的免疫水平、病毒的毒力、激活的免疫反应的性质和 强度等。
(编辑 王铨)
参考文献
1，刘颖，廖玉华，董继华，等. 肠病毒感染及抗ADP/ATP载体抗体在 病毒性心脏病发病中的意义. 临床心血管病杂志，1999, 15：106～109
, http://www.100md.com
2，Liao YH. Functional analysis of autoantibodies against ADP/ATP carrier from d ilated cardiomyopathy. Int J Cardiol, 1996, 54:165～169
3，廖玉华，涂源淑，李淑莉，等. 扩张型心肌病抗心肌线粒体ADP/ATP载体自身抗体的研究 .中华心血管病杂志，1994, 22：43～45
4，Liao Y H, Cheng L X, Dai S P, et al. Autoantibodies against ADP/ATP carrier f rom patients with dilated cardiomyopathy increase activity of voltage-dependent Ca channels in isolated cardiac myocytes. Blood Press Suppl,1996,3:41～44
5，Richardson P, Mckenna W, Bristow M, et al. Report of the 1995 WHO/ISFC Task F orce on the definition and classification of cardiomyopathy. Circulation, 1996, 93: 841～842
(收稿 2000-05-27), 百拇医药
单位：胡丽华(同济医科大学附属协和医院输血科 武汉，430 022)；苑海涛(同济医科大学心血管病研究所)；廖玉华(同济医科大学心血管病研究所)
关键词：肠病毒厚；健康者；心肌病；充血性
临床血液学杂志000508 摘要 目的：探讨肠病毒RNA和抗ANT抗体在健康献血员中检 出的临床意义。方法：应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和逆转录-聚合酶链式反应(RT- PCR)方法对健康献血员和扩张型心肌病(DCM)患者进行抗心肌多肽自身抗体(抗ANT抗体) 和肠病毒(RNA)的检测。结果：48例健康献血员中有4例抗ANT抗体阳性(阳性率为8.3%), 3 例肠病毒RNA阳性(阳性率为6.3%)，而48例DCM患者中有31例抗ANT抗体阳性(阳性率 为64.6%), 29例肠病毒RNA阳性(阳性率为60.4%)，两组比较差异有显著性意义( P<0.05)。在DCM组中，自身抗体和肠病毒RNA的检出具有一致性(r=0.56 )，而健康献血员中，二者则没有相关性(r=0.08)。 结论：健康人可能存在肠病毒隐性感染，但不一定能激活自身免疫系统引 起自身免疫损伤而导致DCM；而肠病毒持续感染与肠病毒感染后激活自身免疫系统引起自身 免疫损伤则可能是DCM的主要发病机制。
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The signficance of enterovirus RNA and
antoantibody against ANT in healthy donors
HU Li-hua
(Department of Transfusion,Union Hospital,Tongi Medical Uni versity,Wuhan 430022)
YUAN Hai-tao LIAO Yu-hua
(Instiute of Cardiology,Union Hospital,Tongji Medical University)
Abstract Objective:To study the signficance of entero virus RNA and antoantibody against ANT in healthy donors.Method:Enterovirus RNA and autoantibody against cardiac pe ptide derived from ANT were detected with RT-PCR and ELISA respectively in two groups of healthy donors(HD) and patients with dilated cardiomyopathy (DCM).Result:Of 48 sera from HD group only 4 (8.3%) bound to the peptide,and EVs-RNA was detected in 3(6.3%) sera of them.But in DCM gr oup,there were 31 (64.6%) and 29(60.4%) sera were positive in detection of autoantibody and enterovirus RNA.Moreover,the autoantibody against ANT had th e EVs-RNA infection had marked relationship in patients with DCM (r=0.56 ),but this correlation was not found in HD group.Conclusion:Inapparent infection of enterovirus may be exis t in healths,but this kind of infection has little chance to activate the immune system and result in immune injury even DCM.On the contrary,immune injury resul ts from activation of immune systeme by enterovirus persistent infection maybe t he main pathogenesis of DCM.
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Key words Enterovirus Blood donor Dilated cardiomyopathy
近年来，我们在检测扩张型心肌病(DCM)患者血清肠病毒RNA 和抗心肌线粒体ADP/ATP载体(以下简称ANT)抗体时，以健康献血员血清作为阴性对照，发 现在少数健康献血员血清中也可以检测出上述病毒和自身抗体〔1〕。由于肠病毒感 染和抗ANT抗体与扩张型心肌病的异常免疫应答有关，抗ANT抗体可以介导心肌细胞钙电流增 加和钙超负荷，导致细胞损害〔2～4〕。由于肠病毒引起的呼吸道和肠道感染容易在 人群中流行，在健康献血员血清中检测出肠病毒RNA和抗ANT抗体是否有临床意义，值得关注 。我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA法)对48例健康献血 员血清肠病毒RNA和抗ANT抗体进行了检测，并与同时48例DCM患者检测结果进行了对比观察，对抗体阳性和病毒阳性的献血员及其受血者进行了追踪观察，现将结果 报告如下。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
本组96例，健康献血员(HD)组：健康献血员48例，男32例，女16例，年龄37.8±17 .4岁。采血前3周内无上呼吸道感染、急性肠炎等病史。DCM组：DCM患者48例，男26例， 女22例，年龄42.3±18.2岁。临床诊断参照1995年WHO/ISFC心肌病的定义和分类标 准进行〔6〕。对健康献血员检测结果异常者及其受血者进行3个月病原学监测和临床 随访。
1.2 肠病毒RNA检测
1.2.1 肠病毒RNA的提取：取血清100 μl，依次加入GITC变性 液200 μl，氯仿-异戊醇(49：1)50 μl，2 mol/L NaAc 25 μl(pH4.0)，水饱和酚 200 μl。剧烈振荡15 s后置-20℃冷却10 min，再以12 000 r/min离心5 min。取上清200 μl加入等体积异丙醇，在-20℃中静置1 h，以12 000 r/min离心10 min，弃上清液用乙醇 洗涤沉淀，开盖自然挥发或烘干备用。
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1.2.2 RT-PCR：肠病毒RNA提取后再按以下比例加入RT-PCR各成 分：双蒸水14.35 μl，10×Buffer 2 μl，15 mmol MgCL22 μl，10 mmol/L dNTP 各0.1μl共0.4 μl，引物P1(50 pmol)0.4 μl，P2 (50 pmol)0.4 μl，T aq酶0.2 μl，逆转录酶AMV 0.25 μl。42℃恒温水浴逆转录30 min即可进行扩增 。扩增程序如下：94℃变性5 min；94℃变性30 s；60℃复性30 s；72℃延伸90 s；共30个 循环，再在72℃中延伸5 min。
1.2.3 电泳：取扩增产物6 μl加溴酚蓝显示剂点样于2%琼脂糖 凝胶(含EB0.5 μg/ml),100 V电泳30 min，于紫外线灯下观察结果。
1.3 多肽合成
根据计算机预测心肌ANT抗原决定簇的氨基酸序列，在多肽合成仪(PSSM-8型Shimadzu公司 生产)上以固相合成法合成ANT多肽，用高压液相色谱法对合成产物的纯度进行鉴定，其纯 度>95%。
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1.4 抗ANT抗体检测
以碳酸盐缓冲液 (pH9.6) 稀释ANT多肽 (终浓度50 μg/ml),包被96孔板，每孔100 μl ，置4℃中过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01 mol/L PBS-Tween 20) 加满各孔，置3 min，洗涤3次，然后加入待检血清(1∶100)，以37℃水温浴2 h。洗涤后 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(1∶3 000)(同济医学院附属协和医院病毒室 产品)，以37℃水温浴1 h洗涤后加入0.03% 双氧水和0.01%TMB反应15 min后，以2 mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处读数并记录OD值，以大于健康组OD值的均数与2. 1倍标准差之和为阳性。
1.5 统计方法
数据处理采用χ2检验，作相关分析。
2 结果
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2.1 健康献血员与DCM患者抗ANT抗体和肠病毒RNA的对比结果
48例DCM患者中，抗ANT抗体和肠病毒RNA阳性例数分别为31例和29例，阳性率分别为64.6 %和60.4%；48例健康献血员中抗体和肠病毒RNA阳性例数分别为4例和3例，阳性率分 别为8.3%和6.3%，两组之间差异具有显著性意义(P<0.01)。在DCM组31 例抗ANT抗体阳性患者中，25例肠病毒RNA阳性，而17例抗ANT抗体阴性患者中，仅4例肠病毒 RNA阳性，两检测结果具有高度的一致性(χ2=12.68,P<0.01,r=0.56 )。说明在DCM患者中，肠病毒感染与抗ANT抗体的产生具有一定的关系。正常献血员组抗 ANT抗体与肠病毒RNA检出结果则没有一致性(表1)。
表1 正常献血员抗ANT抗体与肠病毒RNA检测结果的一致性分析 抗ANT抗体
外周血肠病毒RNA
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合计
阳性
阴性
阳性
0
4
4
阴性
3
41
44
合计
3
45
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48
注：χ2=0，P>0.05，r=0.082.2 健康献血员的病原学监测和临床随访
我们对3例外周血肠病毒RNA阳性和4例抗ANT抗体阳性的健康献血员进行了3个月的随访。3例 肠病毒RNA阳性的献血者中有2例仍为阳性，3例受血者输注肠病毒RNA阳性供血者血清中均可 检测出肠病毒RNA。4例抗ANT抗体阳性献血者抗ANT抗体均为阴性。在临床随访中，3例肠病 毒RNA阳性和4例抗ANT抗体阳性的献血者均无心悸、胸闷、气短等症状，心电图检查没有发 现心律失常和心肌受损；7例受血者经过3个月的观察与随访，均没有发生心律失常和心悸、 胸闷、气短等症状及心电图变化。
3 讨论
肠病毒主要通过呼吸道、消化道侵入人体，可以损伤神经组织和肌肉组织，容易 引起心脏炎症性病变，其中CVB是引起炎症性心脏病的最常见的病毒。研究已经证实，柯萨 奇病毒B3外壳蛋白与人体内线粒体ADP/ATP载体蛋白有一段高度同源的序列。肠病毒感染， 尤其是CVB病毒感染人体后，激活人体免疫系统，产生抗病毒抗体。此抗体可以与ADP/ATP载 体蛋白发生交叉反应，引起心肌自身免疫损伤。Schwimmbeck等根据这段高度同源序列的氨 基酸顺序合成多肽，并作为抗原去检测病毒性心脏病患者血清中的抗多肽抗体，发现有很高 的特异性和敏感性。
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本研究应用酶联免疫吸附实验和RT-PCR两种方法对正常献血员和扩张型心肌病(DCM)患者 进行抗心肌多肽自身抗体和肠病毒的检测。结果发现DCM患者中肠病毒的感染率和抗ANT自身 抗体的检出率明显高于健康献血员组。追踪调查肠病毒RNA阳性和抗ANT自身抗体阳性的献血 员，没有发现病毒性心脏病的临床表现。
在DCM患者中，肠病毒RNA与抗ANT自身抗体的检出有明显的一致性，而在健康献血 员中，二者则没有相关性。由此证明在DCM的发病中，肠病毒感染及其激活的自身免疫反应 是重要因素。正常人可能存在肠病毒隐性感染，但能否激活自身免疫反应并导致病毒性心脏 病与多种因素有关，如机体感染病毒时的免疫水平、病毒的毒力、激活的免疫反应的性质和 强度等。
(编辑 王铨)
参考文献
1，刘颖，廖玉华，董继华，等. 肠病毒感染及抗ADP/ATP载体抗体在 病毒性心脏病发病中的意义. 临床心血管病杂志，1999, 15：106～109
, http://www.100md.com
2，Liao YH. Functional analysis of autoantibodies against ADP/ATP carrier from d ilated cardiomyopathy. Int J Cardiol, 1996, 54:165～169
3，廖玉华，涂源淑，李淑莉，等. 扩张型心肌病抗心肌线粒体ADP/ATP载体自身抗体的研究 .中华心血管病杂志，1994, 22：43～45
4，Liao Y H, Cheng L X, Dai S P, et al. Autoantibodies against ADP/ATP carrier f rom patients with dilated cardiomyopathy increase activity of voltage-dependent Ca channels in isolated cardiac myocytes. Blood Press Suppl,1996,3:41～44
5，Richardson P, Mckenna W, Bristow M, et al. Report of the 1995 WHO/ISFC Task F orce on the definition and classification of cardiomyopathy. Circulation, 1996, 93: 841～842
(收稿 2000-05-27), 百拇医药