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编号:10290578
急性缺氧时内皮细胞中vWF的变化
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     作者:宋丽娜 董小黎 周以健

    单位:100054 北京,首都医科大学病理解剖学教研室

    关键词:急性缺氧;血管内皮细胞;血管性血友病因子;高凝状态

    中华血液学杂志000908

    【摘要】 目的 观察急性缺氧时内皮细胞中血管性血友病因子(vWF)的变化及其与血液高凝状态之间的关系,确定其在反映血管内皮细胞损伤和血液高凝状态研究中的价值。方法 用免疫组织化学染色和显微分光光度计及ELISA方法分别对急性缺氧所致大鼠肺血管内皮细胞和血中vWF的含量进行检测,并用磷钨酸苏木素染色法显示肺血管中纤维蛋白的含量。 结果 随着缺氧时间的延长,内皮细胞的vWF含量呈递减趋势,血中vWF 的含量呈递增趋势,血管中的纤维蛋白逐渐增多。结论 急性缺氧可引起血管内皮细胞损伤,vWF释放入血增加;血中vWF的含量与血液高凝状态之间存在相关性,因而vWF可以作为反映血管内皮细胞损伤和血液高凝状态的指标。
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    Changes of vWF in vascular endothelial cells with acute hypoxia

    SONG Lina DONG Xiaoli ZHOU Yijian

    (Department of Pathological Anatomy, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, China)

    【Abstract】 Objective To investigate changes of vWF in vascular endothelial cells with acute hypoxia and assess its significance in the study of vascular injury and hypercoagulability. Methods vWF in vascular endothelial cells and in blood were measured by immunohistochemical staining image analysis and ELISA technique. Fibrin was displayed by phosphotungstic hematoxylin staining. Results The amount of vWF in vascular endothelial cells decreased progressively, while in blood increased progressively with hypoxica. Fibrin prominently increased with hypoxia. Conclusion Acute hypoxia caused severe injury of vascular endothelial cells which resulted in release of vWF into blood from endothelial cells. The vWF amounts in blood may reflect the hypercoagulability, and may serve as a useful indicator of vascular injury and hypercoagulability.
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    【Key words】 Acute hypoxia; Vascular endothelial cells; von Willebrand factor; Hypercoagulability

    血管内皮细胞是位于循环血液和内皮下组织之间的单层细胞,在防止血栓形成、 维持机体正常生理机能方面具有重要意义[1, 2]。内皮细胞损伤是许多疾病发生发展的病理过程,血管性血友病因子(vWF)做为内皮细胞合成和分泌的一种糖蛋白,在内皮细胞损伤时释放入血增加,因此检测血液中vWF 的水平,可以作为反映内皮细胞的功能状态和损伤程度的指标[3,4];同时,vWF作为一种促凝因子,在血液凝固和血栓形成中发挥着一定的作用,因而vWF也可做为反映血液高凝状态、估计疾病严重程度的一个指标[5]。我们通过观察内皮细胞损伤过程中内皮细胞胞浆和血液中vWF 含量的变化及与血液高凝状态之间的关系,为临床血栓性疾病的诊断和评估提供依据。
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    材料和方法

    1 实验动物和分组 取体重200~220g健康成年雄性Wistar大鼠60只,随机分成6组,每组10只,分为实验组和正常对照组,缺氧1~5h组。

    2 实验方法 正常对照组不做任何处理,缺氧组在常压缺氧舱(氧浓度FIO2=6%,二氧化碳浓度FICO2=1.5%~3.0%)中进行缺氧处理[6],各组其余实验条件均相同。

    将实验动物用乌拉坦麻醉后,仰卧位固定于手术台上,分离皮肤和肌肉后剪断膈肌和肋骨,暴露心肺。从心尖处采血4.5ml,枸橼酸钠抗凝,3000r/min离心15min,取上层血浆置-25℃冰箱备检。取出两肺组织,在体积分数为10%的福尔马林液中固定并制作石蜡切片。

    肺组织石蜡切片以ABC法免疫组织化学(免疫组化)染色。
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    一抗为兔抗人vWF抗体(ZYMED公司产品),工作液浓度为1∶100;ABC试剂盒为Vector公司产品。光镜观察阳性部位棕黄色颗粒的染色强度,显微分光光度计测量其吸光度(A)值。用ELISA法检测血中vWF的含量,用全自动酶联免疫检测仪(SLT型)在波长为492nm处测定A值。

    肺组织石蜡切片进行磷钨酸苏木素(PTAH)染色,光镜观察肺血管中呈蓝色丝网状结构的纤维蛋白。判断标准: “-”表示未见;“+”表示偶见;“++”表示可见;“+++”表示多见。

    3 统计学方法 用单因素方差分析法对血管内皮细胞vWF免疫组化染色测定的A值和用ELISA方法检测的表示血浆中vWF含量的A值进行组间比较,两两比较用Newman-Keuls检验,资料用均数±标准差表示。

    结果

    1 肺组织石蜡切片vWF免疫组化染色结果
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    1.1 光镜观察: 肺小动脉内皮细胞胞浆内可见黄褐色颗粒沉着。各缺氧组与正常对照组相比,血管内皮细胞的染色明显变浅;各缺氧组之间随着缺氧时间的延长,染色强度呈递减趋势。肺动脉、肺小动脉及毛细血管之间的变化基本相似。

    1.2 显微分光光度计的定量分析: 从每个组的vWF免疫组化染色切片中随机抽取10张,每张切片中随机选取5个部位的肺小动脉内皮细胞进行测量,所测得的A值见表1。定量分析结果显示,随着缺氧时间的延长,肺小动脉内皮细胞的vWF含量逐渐降低,但是缺氧2h组和缺氧3h时组之间差别无显著性(P>0.05)。

    vWF的免疫组化染色和显微分光光度计的定量分析结果表明,随着缺氧时间的延长,肺小动脉内皮细胞的vWF含量逐渐减少。

    2 血浆中vWF含量的测定结果 用ELISA方法测定各组血浆中vWF值(A),结果见表1。从表中可以看出随着缺氧时间的延长,各组的vWF含量逐渐增加,其中缺氧1h和2h组之间,缺氧4h和5h组之间相比差异无显著性(P>0.05)。
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    表1 不同缺氧时间对内皮细胞和血浆中vWF的影响 组别

    样本数

    vWF含量(A值)

    内皮细胞

    血浆

    正常对照组

    50

    0.276±0.042

    0.135±0.000

    缺氧组

    缺氧1h组

    50
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    0.207±0.041#*

    0.142±0.001#*

    缺氧2h组

    50

    0.148±0.037#*

    0.143±0.001*

    缺氧3h组

    50

    0.140±0.045*

    0.150±0.003#*
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    缺氧4h组

    50

    0.097±0.022#*

    0.162±0.000#*

    缺氧5h组

    50

    0.073±0.029#*

    0.165±0.002*

    注: 与相邻上组比较,#P<0.05;与正常对照组比较,*P<0.05

    本测定结果表明,随着缺氧时间的延长,内皮细胞损伤加重,vWF释放增多,以致血浆中的vWF含量逐渐增加。
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    3 血液高凝状态的观察结果 用PTAH染色显示血液高凝状态。当缺氧3h,肺血管内可见蓝色丝网状结构;缺氧5h,蓝色丝网状结构明显增多,结果见表2。

    表2 缺氧处理后各组肺血管PTAH染色结果 组别

    大血管

    小血管

    毛细血管

    对照组

    -

    -

    -

    缺氧1h组

    +
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    -

    -

    缺氧2h组

    +

    -

    -

    缺氧3h组

    ++

    +

    -

    缺氧4h组

    ++

    +

    +
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    缺氧5h组

    +++

    +

    +

    结果表明,随着缺氧时间的延长,血管内纤维蛋白的生成逐渐增多,尤其是大血管,血液的凝固性逐渐增加。

    讨论

    关于vWF在内皮损伤性疾病中的报道很多,学者们多采用免疫组化和免疫荧光的定性检测方法,对vWF免疫组化染色缺乏定量的分析[7-10]。目前尚未见到急性缺氧过程中血管内皮细胞vWF含量变化定量检测的报道。我们通过正常对照组和各不同时间缺氧组肺血管壁vWF免疫组化染色的光镜观察及显微分光光度计的定量分析,表明了随缺氧时间延长,血管壁vWF含量逐渐降低的动态变化。同时血中vWF的含量随缺氧时间的延长呈逐渐增加的趋势。这两者的变化均与内皮细胞的损伤程度有关,且两者之间有一定关系。我们的实验结果与文献报道相一致。我们通过对内皮细胞和血中vWF的量化,不仅对内皮细胞的损伤程度有更精确的判定标准,而且也为了解内皮细胞vWF含量和血中vWF 含量的关系提供了数量上的依据。本研究结果表明缺氧可致血管内皮细胞vWF释放入血量增加,随缺氧时间延长其含量在血中递增,即随着内皮细胞损伤程度的加重,内皮细胞胞浆内vWF的含量减少,而血中vWF的含量增加。不同缺氧时间组血管内皮细胞vWF含量的减少和血中vWF含量的增加不完全呈平行关系,如缺氧2h和3h组。这一方面可能与缺氧时间和例数有关,另一方面与内皮下组织也含有一定量的vWF有关。
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    目前就vWF的具体含量和血液高凝状态血液中出现纤维蛋白的确切关系尚未见到报道。我们通过测定血中vWF含量和用PTAH染色显示血液中纤维蛋白的形成来反映血液高凝状态的方法,初步确定了两者之间的关系。当缺氧3h,血中表示vWF含量的A值为0.15时,大、小血管中均可见到纤维蛋白丝,且随着血中vWF含量的进一步增高,纤维蛋白亦逐渐增多。通过对vWF的定量和血液高凝状态之间关系的观察,为今后临床血液高凝状态的检测和评价提供理论依据。

    参 考 文 献

    1,Pearson JD. Endothelial cell biology. Radiology,1991,179:9-14.

    2,Fajardo LF. The complexity of endothelial cells. Am J Clin Pathol,1989,92:241-250.
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    3,Boneu B. Factor Ⅷ complex and endothelial damage. Lancet, 1975,1:1430.

    4,金榕兵. 血管内皮细胞损伤的研究进展. 国外医学军事医学分册, 1994, 11: 49-52.

    5,Hoyer LW. The factor Ⅷ complex: structure and function. Blood,1981,58:1-13.

    6,冉丕鑫, 段生福. 常压缺氧性大鼠肺动脉高压模型的建立. 中华医学杂志,1994,22:229-231.

    7,洪欣, 南新中, 尹昭云,等. 缺氧时肺动脉内皮细胞合成因子Ⅷ相关抗原和前列环素的变化. 航天医学与医学工程,1995,8 :250-252.

    8,魏树军, 柳大昌,张莉,等. 实验性多器官衰竭肺血管内皮细胞FⅧ相关抗原的检测. 中华结核和呼吸杂志,1990, 13:346-348.

    9,梁延杰, 魏树均. 30例肺心病患者FⅧ相关抗原的组织学检测. 中华结核和呼吸杂志, 1998,11:154-155.

    10,高绪兰, 李玉林,于洪藻,等. 肺组织毛细血管内皮细胞FⅧ相关抗原表达的免疫组织化学研究. 中华病理学杂志,1993,22 :241.

    (收稿日期:2000-02-08), 百拇医药