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编号:10290611
P-450c17mRNA在原发性醛固酮增多症肾上腺皮质腺瘤及增生组织中的表达及意义
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     作者:方玉江 臧美孚 陈松森 狄旭

    单位:方玉江(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科,北京100073);臧美孚(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院泌尿外科,北京100073);陈松森(基础医学研究所生物化学与分子生物学系,北京100005);狄旭(基础医学研究所生物化学与分子生物学系,北京100005)

    关键词:原发性醛固酮增多症发;肾上腺皮质腺瘤;增生;P-450c17-羟化酶mRNA的表达

    基础医学与临床000509

    摘要 :为探讨细胞色素P-450c17-羟化酶(P-450c17)mRNA在原发性醛固酮增多症(原醛)肾上腺皮质腺瘤(APA)及增生组织中的表达及其意义,采用 Northern Blot法对7例APA组织,3例结节样增生组织,7例正常肾上腺组织,1例腹壁骨骼肌组织P-450c17 mRNA 的表达水平进行检测。结果显示P-450c17mRNA在原醛APA组织与正常肾上腺组织中的表达有显著性差异(P<0.05)。P-450c17mRNA在原醛肾上腺皮质增生组织与正常肾上腺组织中的表达、在原醛APA组织与原醛肾上腺皮质增生组织中的表达相似 。提示P-450c17mRNA在APA组织中的表达降低很可能是原醛APA组织分泌过多醛固酮(ALD)的分子生物学原因。
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    中图分类号:R586.22 文献标识码: A

    文章编号:1001-6325(2000)05-0030-04

    Expression of cytochrome P-450c17-hydroxynase mRNA in adrenocortical adenomas and hyperplasia from patients with primary aldosteronism and its significance

    FANG yu-jiang, ZANG mei-fu, CHEN song-seng, et al.

    (Peking Union Medical College Hospital,CAMS-PUMC,Peking Union Medical College,Beijing 100073,China)
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    Abstrsact :To determine the expression of cytochrome P-450c17-hydroxynase mRNA in adrenocortical adenomas and hyperplasia from patients with primary aldosteronism and its significance,Total RNA were extracted from7 cases of APA tissue sample,3 nodular adrenal hyperplasia tissue sample,7 normal adrenal tissue sample,1 normal abdominal skeleton muscle tissue sample,the expression of cytochrome P-450c17-hydroxynase mRNA was examined by Northern Blot analysis. The results showed there was a significant difference between the expression of cytochrome P-450c17-hydroxynase mRNA in APA tissue and that in normal adrenal gland tissue(P<0.05), no significant difference between nodular adrenal hyperplasia tissue and normal adrenal gland tissue, no significant difference between APA and nodular adrenal hyperplasia tissue .we conclude that the markedly lower level of P-450c17mRNA in APA may be the cause of hypersecretion of aldosterone in APA patients.
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    Key words :Primary aldosteronism; Adrenocortical adenomas; Hyperplasia; Expression of P-450c17-hydroxynase

    原发性醛固酮增多症(原醛)临床上并不少见。主要因肾上腺皮质腺瘤(APA)或肾上腺皮质增生分泌过多的醛固酮(ALD)所致。临床上二者的治疗方法不同,前者需手术治疗,后者则行保守治疗。因此,对二者的鉴别一直被泌尿外科医生所关注。在肾上腺组织中,P-450c17-羟化酶(P-450c17)以孕酮为底物合成皮质醇及性激素,孕酮又是合成ALD的底物,因此P-450c17的活性可影响孕酮在肾上腺组织中的含量,进而影响ALD的合成。国外已有研究证实,原醛患者APA及增生组织中可合成过量的ALD。近年来,随着分子生物学的迅猛发展,已成功克隆了P-450c17 cDNA[1] 。为了解原醛患者肾上腺过量ALD合成的机理及探讨原醛APA组织及增生组织的区别,我们用分子生物学方法研究了原醛患者APA组织及增生组织P-450c17mRNA的表达。
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    1 材料与方法

    1.1 组织标本

    原醛患者APA及增生(结节样增生)的组织标本均来自我院手术切除的组织,病理特点典型,诊断明确。其中,APA标本共7例,男1例,女6例;年龄26~40岁。结节样增生标本共3例,男1例,女2例;年龄27~41岁。正常肾上腺组织取自肾移植用新鲜尸体,均为男性;年龄20~30岁。腹壁骨骼肌组织男1例,年龄40岁。所有标本离体后5~10min内,迅速置于液氮中冷冻保存。

    1.2 P-450c17的cDNA探针

    实验用含有P-450c17cDNA探针的PCW质粒由美国Vanderbilt大学生物化学系Waterman教授赠送。转化大肠杆菌DH5a后,制备并纯化质粒,最后用内切酶SalⅠ,Hind切下,电泳回收P-450c17cDNA作实验用探针。
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    1.3 试剂和仪器

    同位素a-32P-dATP购自北京亚辉生物医学工程公司。随机引物标记试剂盒购自Promega公司。异硫氰酸胍为GIBCO-BRL公司产品,其它生化试剂为国产分析纯。激光光密度仪为Pharmacia公司产品。电泳仪为北京东方仪器厂DF-D直流电泳仪。

    1.4 组织中总RNA的提取

    按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[2],稍加改进后,提取正常及腺瘤和增生组织(1g)中总RNA。用紫外分光光度计测定RNA样品的260/280A值,计算RNA含量。用0.5%SDS溶解,-70℃冰箱备用。

    1.5 P-450c17cDNA探针的标记

    P-450c17cDNA探针的标记参照Promega公司随机引物标记试验所述方法。取P-450c17cDNA样品10.5mL(25ng),于100℃沸水中变性5min后,快速置冰浴中冷却,将其加至已有dTTP,dCTP,dGTP各2mL,及5×Buffer 6mL,及含a-32P-dATP7.5mL的另一试管中,加入Klenow酶后用去离子水补体积至50mL。室温下反应70 min后,用SephadexG-50柱分离。平衡及洗脱液均为2×SSC,收集标记的cDNA作为探针。
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    1.6 Northern Blot法检测P-450c17mRNA的表达水平

    取 RNA20mg于离心管中,依次加入DEPC水,变性液15.5mL使总体积为20mL,65℃处理15min,冰浴冷却,加3uL加样缓冲液。在含50%甲醛凝胶和甲醛电泳缓冲液中电泳,电压为80V,2h,取出凝胶,10×SCC洗2次,每次10min。将RNA转移至硝酸纤维素薄膜上,转膜约18h。烤干后,装入一杂交袋中,加入预杂交液(50%甲酰胺+5×SSC+30mmol/L磷酸缓冲液+5×Denhardt+300ug/ml的SSD)30mL,42℃下预杂交,保温过夜。次日倒出,加入杂交液(同前+5%硫酸葡聚糖)约30mL,加入已变性并标记的探针,42℃振摇下过夜。SSC/SDS梯度漂洗滤膜,室温晾干。将X光胶片压于膜的两侧置于带双增感屏的暗盒中,-70℃下暴光3天,显影,定影,分析杂交强度。以b-actin探针作内参照,激光光密度扫描测定杂交带的积分吸光值。按实际P-450c17cDNA探针杂交峰值与实际b-actin杂交峰值比作为P-450c17mRNA在各组织的相对表达水平,以任意单位表示。
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    1.7 统计方法

    各峰值以±s表示,组间比较用t检验。

    2 结果

    b-actin和P-450c17的cDNA探针在原醛APA组织、增生组织,正常肾上腺组织及内对照腹壁骨骼肌组织中的放射自显影结果见图。其中,1~3号,5~8号为APA组织;4号,9号,10号为结节样增生组织;11~17号为正常肾上腺组织;18号为正常腹壁骨骼肌组织。为了从数量上加以比较,附表列出了实际P-450c17cDNA探针杂交峰值与实际b-actin杂交峰值比作为P-450c17mRNA在各组织的相对表达水平。

    b-actin在不同组织的杂交强度基本相同(见图1)。P-450c17mRNA在正常腹壁骨骼肌组织中不表达,在正常肾上腺组织呈高水平表达,在原醛APA组织中P-450c17mRNA呈明显低水平表达,在原醛肾上腺皮质增生组织中的表达亦较高(见图1)。经t检验表明,P-450c17mRNA在原醛APA组织与正常肾上腺组织中的表达有显著性差异(P<0.05);P-450c17mRNA在原醛肾上腺皮质增生组织与正常肾上腺组织中的表达、在原醛APA组织与原醛肾上腺皮质增生组织中的表达相似(表1)。
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    图1 P-450 c17 cDNA 在原醛APA 组织增生组织正常肾上腺组织及腹壁骨骼肌组织中的杂交

    Fig 1 Hybridization of P-450c17 cDNA in APA ,nodular hyperplasia,normal adrenal

    gland and abdominal skeletal muscle tissue

    APA tissue:No.1-3,No.5-8;Nodular hyperplasia tissue No.4,No.9,No.10;Normal adrenal tisste:No.11-17;

    Abdominal skeletal muscle tissue:No.18

    表1 P-450c17 mRNA 在APA 组织结节样增生组织和正常肾上腺组织中的相对表达水平
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    Table 1 The relative expression level of P-450c17 mRNA in APA nodular hyperplasia and normal adrenal gland tissue APA

    No.

    1

    2

    3

    5

    6

    7

    8

    Ratio(%)
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    71

    119

    91

    162

    119

    66

    108

    Average(%)

    105±33

    Nodular

    No.

    4

    9
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    10

    hyperplasia

    No.

    118

    192

    124

    Average(%)

    145±41

    Normal

    No.

    11

    12

    13
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    14

    15

    16

    17

    adrenal

    Ratio(%)

    287

    173

    145

    94

    122

    215

    177
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    gland

    Average(%)

    173

    64

    3 讨论

    当原醛症的定性诊断明确后,需进一步明确其两种主要类型,即APA或肾上腺皮质增生,因为二者的治疗方法明显不同。肾上腺皮质腺瘤需手术治疗,肾上腺皮质增生仅需药物治疗即可。

    术前鉴别的方法有:(1)症状体征,(2)通过卧立位血管紧张素及ALD来区别,(3)血浆18-羟皮质酮[4],(4)影像学。但仅根据以上特点来鉴别肾上腺皮质腺瘤或肾上腺皮质增生还不可靠。

    对临床上有明显原醛症状体征,术前检查仍不能明确性质的单发结节,宜行肾上腺探查术。而明确的病理诊断对预后的判断非常重要。如为APA则预后好,如为结节样增生则预后差。典型的原醛肾上腺结节样增生的特点是,直径1~6mm,偶可达2cm。镜下细胞呈增生性改变,结节外的皮质也呈增生状态,无包膜。典型的APA的特点是,腺瘤常为单发,直径平均为1.8cm,圆形或卵圆形,包膜完整,切面金黄色,质细腻,瘤边有被挤压在旁的正常球状带细胞,镜下呈肿瘤细胞的特点。术后从肾上腺取出的单发结节,若病理特点不典型,很难明确其到底是APA还是结节样增生,本研究用分子生物学方法拟探究一种途径与病理诊断相互验证,结果提示,通过P-450c17mRNA表达的差异来鉴别APA与正常肾上腺很有意义,对增生与正常肾上腺的鉴别无明显意义,目前从小样本试验初探该方法尚不能鉴别APA与增生。
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    P-450c17的基因位于10号染色体上[5],离体及在体实验均证实P-450c17对cAMP具有高度的依赖性,而球状带细胞cAMP的水平极低。因此在球状带细胞并不表达P-450c17活性。酶学及免疫组织化学的研究也证实P-450c17位于正常肾上腺束状带和网状带,在球状带细胞并不表达P-450c17活性。本研究结果表明尽管与正常肾上腺组织和增生组织相比,APA组织中P-450c17mRNA表达降低,但仍有一定程度的表达。这就提示APA的细胞来源不是球状带细胞,从而为酶学及免疫组织化学的研究结果证实P-450c17位于正常肾上腺束状带和网状带提供了分子水平上的证据。

    在肾上腺组织从孕酮合成ALD的过程中,需P-450c11-羟化酶(P-450c11)的作用,而肾上腺组织束状带内侧细胞不具有P-450c11的活性,因而不能合成ALD。所以APA细胞来自束状带内侧细胞的可能性极小。有研究提示肾上腺组织中只有束状带外侧细胞同时具有P-450c11和P-450c17的活性[6],日本学者研究提示APA病人P-450c11mRNA的表达增高[7]。从孕酮合成ALD及皮质醇,性激素的过程中,P-450c17对于ALD的合成亦很重要,若P-450c17的活性降低,则可使底物孕酮堆积,从而利于ALD的合成。本研究结果提示P-450c17mRNA在APA组织中的表达明显降低,进而引起P-450c17的活性降低,结果使ALD的合成增多。因此,P-450c17mRNA在APA组织中的表达降低很可能是APA分泌过多ALD的原因。关于APA细胞是由束状带外侧细胞异常增生而来,还是从原始的肾上腺皮质细胞转化而来,目前争议很大[7],我们的研究结果表明P-450c17mRNA在正常肾上腺组织,增生组织,APA组织相对表达量分别是173,145,105,其表达在程度上是一个递减的关系。提示APA细胞可能是由束状带外侧细胞异常增生而来,但尚需更多的证据来证实。
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    2000-05-11

    2000-06-05, 百拇医药


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