睑板腺癌P53基因和人乳头状瘤病毒HPV-16的检测
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37c医学网
作者：严 瑛 牛膺筠 纪建中 罗 兵
单位：青岛医学院(青岛 266003)；严 瑛 牛膺筠 纪建中 附属医院眼科；罗 兵 微生物学教研室
关键词：睑板腺癌；霰粒肿；乳头状瘤病毒；P53基因；聚合酶链反应
青岛医学院学报990103 【摘要】 ①目的 探讨睑板腺癌发生的分子生物学机制。②方法 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法，对34例眼睑组织(睑板腺癌和霰粒肿各17例)中P53基因248位点进行检测，并用PCR技术检测其中人乳头状瘤病毒(HPV)致癌型HPV-16 DNA片段。③结果 29.5%的睑板腺癌中有P53基因的突变,霰粒肿中则未检测到,两者比较差异有显著性(P=0.022)。P53基因突变与睑板腺癌临床病理特征无关(P>0.05)。睑板腺癌及霰粒肿中均未检测到HPV-16 DNA片段。④结论 P53基因突变可能在睑板腺癌发生的早期起一定作用，而与临床病理特征无关。
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中国图书资料分类法分类号 R730.23
DETECTION OF P53 GENE AND HUMAN PAPILLOMAVIRUS HPV-16 IN MEIBOMIAN GLAND CARCINOMAS
Yan Ying, Niu Yingjun, Ji Jianzhong, et al
Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To inquire into the molecular biological mechanisms of the occurrence of meibomian gland carcinomas. Methods Using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms(PCR-RFLP) method, we studied 248 points in 34 samples ( including 17 meibomian gland carcinomas,17 chalazions). DNA segment of HPV-16 was also detected by PCR technique. Results 29.5% meibomian gland carcinoma were shown to contain point mutation in P53 gene, no point mutation was found in chalazions, the difference was significant (P=0.022).No significant correlation was found between the P53 gene mutations and the clinical pathological manifestations of meibomian gland carcinomas (P>0.05). No HPV-16 DNA was found in meibomian gland carcinomas. Conclusion P53 gene mutations might play roles in the early stage of the development of meibomian gland carcinomas. No correlation between P53 gene mutations and clinical manifestations was found.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 carcinomas of meibomian glands; chalazions; human papillomavirus; P53 gene; polymerase chain reaction
睑板腺癌是常见的眼睑恶性肿瘤,早期诊断较为困难，易误诊为霰粒肿，其5年肿瘤相关死亡率较高，早期的诊断和彻底的治疗可改善其预后。本研究采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，检测睑板腺癌中P53基因248位点的突变，并用分子生物学技术检测其中致癌型HPV-16的DNA片段，以初步探讨睑板腺癌发生的分子生物学机制，为其早期诊断提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本收集
标本均来自青岛医学院附属医院眼科病理室1977～1997年石蜡包埋的34例眼睑送检组织，其中睑板腺癌和霰粒肿各17例。上述组织标本均经病理证实。
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1.2 仪器与试剂
4800型DNA扩增仪系美国PE公司产品;微量移液器系法国Gilson公司产品;PCR反应体系(Taq DNA聚合酶、dNTP，10×buffer反应液、MgCl2)，限制性核酸内切酶MSPⅠ，酶切缓冲液，Mark 100bp ladder，蛋白酶K均为美国Promega公司产品;琼脂糖系德国宝灵曼公司产品;P53基因第7外显子引物，HPV-16引物由美国CyberSyn公司合成。
1.3 DNA抽提
标本以10 μm厚切成5～10片，置于1.5mL离心管中。经二甲苯脱蜡，无水乙醇洗涤，乙醇梯度水化。蛋白酶K裂解液(10mmol/L Tris,pH 8，5mmol/L EDTA,300mg/L蛋白酶K，体积分数
0.005的SDS)消化，过夜。常规酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1,V∶V∶V )抽提。醋酸钠及无水乙醇沉淀DNA.沉淀物于室温下干燥后，加入30μL去离子水，溶解DNA沉淀，4℃贮存，备用。
, 百拇医药
1.4 P53基因PCR扩增及限制性酶切
P53基因第7外显子引物序列见文献〔1〕。扩增片段长164bp.野生型P53基因第7外显子248位点为限制性核酸内切酶MSPⅠ的酶切位点(CCGG-MSPⅠ酶切位点)。PCR产物经此酶酶切后电泳，在琼脂糖凝胶上可观察到113bp及51bp两条核酸电泳条带。若相应酶切位点的核苷酸出现变化，则不能被酶切，只能观察到总长度为164bp核酸对的电泳带，即为突变型P53.扩增条件：反应总体积30μL.反应体系包括：10×PCR缓冲液3μL，dNTP终浓度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，引物终浓度0.6μmol/L，模板8μL，加入去离子水至终体积30μL.混匀后离心，加无菌石蜡油覆盖液面。置DNA扩增仪。反应条件：94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环。最后72℃延伸5min.PCR产物用氯仿抽提1次备用。酶切条件：取PCR产物18μL，加入限制性内切酶MSPⅠ酶3U，37℃水浴1.5h，分别取PCR产物及酶切产物各10μL,以100bp mark ladder作为扩增片段长度标准，于含溴化乙锭(0.5mg/L)的25g/L琼脂糖凝胶电泳(80V)1h.由紫外光透射仪观察结果并照相。
, 百拇医药
1.5 HPV-16 PCR扩增
HPV-16型特异性引物、特异性扩增HPV-16 E6区、扩增片段长258bp，两个寡核苷酸引物见文献〔2〕。扩增条件：反应总体积30μL.反应体系包括：10×PCR缓冲液3μL，dNTP终浓度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，引物终浓度0.8μmol/L，模板8μL(以新鲜冰冻宫颈癌HPV-16阳性标本作为阳性对照，模板3μL)，加入去离子水至终体积30μL.混匀后离心，加无菌石蜡油覆盖液面。置DNA扩增仪上扩增。反应条件同上。由紫外光透射仪观察结果并照相。
1.6 统计学处理
统计学方法采用四格表精确概率法。
2 结 果
2.1 突变型P53基因检测结果
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睑板腺癌和霰粒肿P53基因第7外显子全长序列扩增均获成功,经MSP Ⅰ酶切后，17例睑板腺癌中有5例未被切开，为突变型，突变率为29.5%；17例霰粒肿均为野生型，突变率为0,两者比较,差异有显著意义(P=0.022)。P53基因突变与睑板腺癌临床病理特征之间的关系见表1.结果表明，睑板腺癌P53基因突变与病人性别、年龄、肿瘤分化程度及肿瘤复发无关。
表1 P53基因突变与睑板腺癌临床病理特征之间的关系(例) 临床病理特征
突变
未突变
构成比(%)
P值
性别
男
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1
4
20.0
女
4
8
33.3
>0.2
年龄(岁)
<60
2
7
22.2
≥60
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3
5
37.5
>0.3
分化程度
高
2
3
40.0
中
1
6
14.3
低
, http://www.100md.com
2
3
40.0
>0.3
肿瘤发生
原发
2
9
18.2
复发
3
3
50.0
>0.2
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2.2 HPV-16 PCR检测结果
睑板腺癌及霰粒肿中均未检测到HPV-16 DNA片段。
3 讨 论
近来研究证明，野生型P53基因是一种抑癌基因，对细胞的生长、分化、增殖起调控作用。P53基因突变已被证实是许多肿瘤发病的动因。人类P53基因定位于17P13.1，由11个外显子和10个内含子组成。对P53基因生物活性机制的研究表明,野生型P53基因参与基因转录、DNA合成和修复，监视基因组的完整性和细胞的程序性死亡。DNA损伤后，野生型P53基因累积，引起细胞周期阻滞，使DNA有足够的时间修复；若损伤不能修复，野生型P53能够启动细胞凋亡过程，从而阻止具有癌变倾向的突变细胞产生。野生型P53基因功能失活的主要方式是基因突变。早期的研究注意到大多数P53基因的突变主要发生在进化过程中高度保守的区域，即外显子5～8(126～306密码子)。
, 百拇医药
本组检测结果显示,P53基因在睑板腺癌中有较高的突变率，而在霰粒肿中却很少发生，表明P53基因248位点的突变在睑板腺癌的发生中起一定作用，是睑板腺癌P53基因突变的一个热点。
实验结果同时显示，P53基因第7外显子248位点的突变与睑板腺癌的临床病理特征(包括性别、年龄、肿瘤的分化程度及肿瘤的复发)无关，表明P53基因突变在睑板腺癌发生的早期起作用。与此相似，许多国外学者在研究肺癌、头颈部癌及皮肤肿瘤中P53基因的突变，也得出相似的结论〔3～5〕。
许多研究结果表明，P53基因突变的位点和类型可因不同地理位置、不同肿瘤组织存在差异，这些差异可能是由于不同组织生物学特性的差异或暴露于某种类型的致癌物引起〔6～9〕。因此，不同肿瘤组织中P53基因突变的位点和类型，可为肿瘤的病因学和发病机理提供线索。本组结果显示，248位点密码子的突变是睑板腺癌P53基因突变的热点，可进一步行DNA测序，观察其突变类型，以从分子水平上揭示眼睑恶性肿瘤的发生机制。
, 百拇医药
越来越多的研究表明，HPV与人类多种肿瘤发生有关。HPV是一种引起人皮肤及黏膜增生性损害的DNA病毒。目前已发现70多种型别的HPV，根据其致癌的危险性，HPV可分为“高危组”与“低危组”。HPV-16致癌的中心环节是HPV-16 E6,E7转化蛋白与细胞癌基因相互作用的结果。有文献报道，宫颈鳞癌中主要存在HPV-16的基因相关序列，而宫颈腺癌中则以HPV-18为主。本组检测结果显示，睑板腺癌、霰粒肿中未检出HPV-16 DNA，可进一步检测HPV-18或其他型别的HPV DNA,以探讨睑板腺癌P53基因突变与HPV感染之间的关系及其在睑板腺癌发生中的作用。
综上所述，P53基因第7外显子248位点的突变在睑板腺癌的发生早期起一定作用，是P53基因突变的一个热点，与睑板腺癌的临床病理特征无关。
本文为青岛市科委资助课题(批准号：SG9703121)参考文献
1 罗元辉，房殿春，鲁 荣，等.PCR-RFLP技术分析石蜡包埋胃癌组织ras和P53基因点突变.肿瘤防治研究,1995,10(5):116
, http://www.100md.com
2 Kinoshita M,Shin S,Aono T.A sensitive and quantitive method for the determination of number of HPV-16 DNA copies by using the competitive PCR. GATA,1993,10(5):116
3 El Naggar AK,Lai S,Luna-MA, et al.Sequential P53 mutation analysis of preinvasive and invasive head and neck squamous carcinoma. Int J Cancer.1995,64(3):196
4 Lohman D,Putz B,Reich U,et al.Mutational spectum of the P53 gene in human small- cell lung cancer and relationship to clinicopathological data.Am J Pathol,1993,142:907
, 百拇医药
5 Campbell C,Auinm AJ,Ro YS,et al.P53 mutations are common and early events that precede tumor invasion in squamous cell neoplasia of the skin. J Invest Dermatol,1993,100:746
6 De Fromental CC,Soussi T.P53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Gen Chrom Cancer,1992, 4:1
7 Hsu IC,Metcalf RA,Sun T,et al.Mutational hot spot in the P53 gene in human hepatocellular carcinomas. Nature ,1991,350:427
, 百拇医药
8 Brash DE,Ruldolf JA,Simon JA,et al.A role for sunlight in skin cancer,UV-induced P53 mutations in squamous cell carcinoma. PNAS, 1991,88:10124
9 Puisieux M,Lim S,Groopman J,et al.Selective targeting of P53 gene mutational hot spots in human cancer etiologically defined carcinogens. Cancer Res,1991,51:6185
(1998-09-20收稿 1998-12-01修回), 百拇医药
单位：青岛医学院(青岛 266003)；严 瑛 牛膺筠 纪建中 附属医院眼科；罗 兵 微生物学教研室
关键词：睑板腺癌；霰粒肿；乳头状瘤病毒；P53基因；聚合酶链反应
青岛医学院学报990103 【摘要】 ①目的 探讨睑板腺癌发生的分子生物学机制。②方法 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性方法，对34例眼睑组织(睑板腺癌和霰粒肿各17例)中P53基因248位点进行检测，并用PCR技术检测其中人乳头状瘤病毒(HPV)致癌型HPV-16 DNA片段。③结果 29.5%的睑板腺癌中有P53基因的突变,霰粒肿中则未检测到,两者比较差异有显著性(P=0.022)。P53基因突变与睑板腺癌临床病理特征无关(P>0.05)。睑板腺癌及霰粒肿中均未检测到HPV-16 DNA片段。④结论 P53基因突变可能在睑板腺癌发生的早期起一定作用，而与临床病理特征无关。
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中国图书资料分类法分类号 R730.23
DETECTION OF P53 GENE AND HUMAN PAPILLOMAVIRUS HPV-16 IN MEIBOMIAN GLAND CARCINOMAS
Yan Ying, Niu Yingjun, Ji Jianzhong, et al
Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To inquire into the molecular biological mechanisms of the occurrence of meibomian gland carcinomas. Methods Using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms(PCR-RFLP) method, we studied 248 points in 34 samples ( including 17 meibomian gland carcinomas,17 chalazions). DNA segment of HPV-16 was also detected by PCR technique. Results 29.5% meibomian gland carcinoma were shown to contain point mutation in P53 gene, no point mutation was found in chalazions, the difference was significant (P=0.022).No significant correlation was found between the P53 gene mutations and the clinical pathological manifestations of meibomian gland carcinomas (P>0.05). No HPV-16 DNA was found in meibomian gland carcinomas. Conclusion P53 gene mutations might play roles in the early stage of the development of meibomian gland carcinomas. No correlation between P53 gene mutations and clinical manifestations was found.
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【KEY WORDS】 carcinomas of meibomian glands; chalazions; human papillomavirus; P53 gene; polymerase chain reaction
睑板腺癌是常见的眼睑恶性肿瘤,早期诊断较为困难，易误诊为霰粒肿，其5年肿瘤相关死亡率较高，早期的诊断和彻底的治疗可改善其预后。本研究采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，检测睑板腺癌中P53基因248位点的突变，并用分子生物学技术检测其中致癌型HPV-16的DNA片段，以初步探讨睑板腺癌发生的分子生物学机制，为其早期诊断提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本收集
标本均来自青岛医学院附属医院眼科病理室1977～1997年石蜡包埋的34例眼睑送检组织，其中睑板腺癌和霰粒肿各17例。上述组织标本均经病理证实。
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1.2 仪器与试剂
4800型DNA扩增仪系美国PE公司产品;微量移液器系法国Gilson公司产品;PCR反应体系(Taq DNA聚合酶、dNTP，10×buffer反应液、MgCl2)，限制性核酸内切酶MSPⅠ，酶切缓冲液，Mark 100bp ladder，蛋白酶K均为美国Promega公司产品;琼脂糖系德国宝灵曼公司产品;P53基因第7外显子引物，HPV-16引物由美国CyberSyn公司合成。
1.3 DNA抽提
标本以10 μm厚切成5～10片，置于1.5mL离心管中。经二甲苯脱蜡，无水乙醇洗涤，乙醇梯度水化。蛋白酶K裂解液(10mmol/L Tris,pH 8，5mmol/L EDTA,300mg/L蛋白酶K，体积分数
0.005的SDS)消化，过夜。常规酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1,V∶V∶V )抽提。醋酸钠及无水乙醇沉淀DNA.沉淀物于室温下干燥后，加入30μL去离子水，溶解DNA沉淀，4℃贮存，备用。
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1.4 P53基因PCR扩增及限制性酶切
P53基因第7外显子引物序列见文献〔1〕。扩增片段长164bp.野生型P53基因第7外显子248位点为限制性核酸内切酶MSPⅠ的酶切位点(CCGG-MSPⅠ酶切位点)。PCR产物经此酶酶切后电泳，在琼脂糖凝胶上可观察到113bp及51bp两条核酸电泳条带。若相应酶切位点的核苷酸出现变化，则不能被酶切，只能观察到总长度为164bp核酸对的电泳带，即为突变型P53.扩增条件：反应总体积30μL.反应体系包括：10×PCR缓冲液3μL，dNTP终浓度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，引物终浓度0.6μmol/L，模板8μL，加入去离子水至终体积30μL.混匀后离心，加无菌石蜡油覆盖液面。置DNA扩增仪。反应条件：94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环。最后72℃延伸5min.PCR产物用氯仿抽提1次备用。酶切条件：取PCR产物18μL，加入限制性内切酶MSPⅠ酶3U，37℃水浴1.5h，分别取PCR产物及酶切产物各10μL,以100bp mark ladder作为扩增片段长度标准，于含溴化乙锭(0.5mg/L)的25g/L琼脂糖凝胶电泳(80V)1h.由紫外光透射仪观察结果并照相。
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1.5 HPV-16 PCR扩增
HPV-16型特异性引物、特异性扩增HPV-16 E6区、扩增片段长258bp，两个寡核苷酸引物见文献〔2〕。扩增条件：反应总体积30μL.反应体系包括：10×PCR缓冲液3μL，dNTP终浓度1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，引物终浓度0.8μmol/L，模板8μL(以新鲜冰冻宫颈癌HPV-16阳性标本作为阳性对照，模板3μL)，加入去离子水至终体积30μL.混匀后离心，加无菌石蜡油覆盖液面。置DNA扩增仪上扩增。反应条件同上。由紫外光透射仪观察结果并照相。
1.6 统计学处理
统计学方法采用四格表精确概率法。
2 结 果
2.1 突变型P53基因检测结果
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睑板腺癌和霰粒肿P53基因第7外显子全长序列扩增均获成功,经MSP Ⅰ酶切后，17例睑板腺癌中有5例未被切开，为突变型，突变率为29.5%；17例霰粒肿均为野生型，突变率为0,两者比较,差异有显著意义(P=0.022)。P53基因突变与睑板腺癌临床病理特征之间的关系见表1.结果表明，睑板腺癌P53基因突变与病人性别、年龄、肿瘤分化程度及肿瘤复发无关。
表1 P53基因突变与睑板腺癌临床病理特征之间的关系(例) 临床病理特征
突变
未突变
构成比(%)
P值
性别
男
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1
4
20.0
女
4
8
33.3
>0.2
年龄(岁)
<60
2
7
22.2
≥60
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3
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37.5
>0.3
分化程度
高
2
3
40.0
中
1
6
14.3
低
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2
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>0.3
肿瘤发生
原发
2
9
18.2
复发
3
3
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>0.2
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2.2 HPV-16 PCR检测结果
睑板腺癌及霰粒肿中均未检测到HPV-16 DNA片段。
3 讨 论
近来研究证明，野生型P53基因是一种抑癌基因，对细胞的生长、分化、增殖起调控作用。P53基因突变已被证实是许多肿瘤发病的动因。人类P53基因定位于17P13.1，由11个外显子和10个内含子组成。对P53基因生物活性机制的研究表明,野生型P53基因参与基因转录、DNA合成和修复，监视基因组的完整性和细胞的程序性死亡。DNA损伤后，野生型P53基因累积，引起细胞周期阻滞，使DNA有足够的时间修复；若损伤不能修复，野生型P53能够启动细胞凋亡过程，从而阻止具有癌变倾向的突变细胞产生。野生型P53基因功能失活的主要方式是基因突变。早期的研究注意到大多数P53基因的突变主要发生在进化过程中高度保守的区域，即外显子5～8(126～306密码子)。
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本组检测结果显示,P53基因在睑板腺癌中有较高的突变率，而在霰粒肿中却很少发生，表明P53基因248位点的突变在睑板腺癌的发生中起一定作用，是睑板腺癌P53基因突变的一个热点。
实验结果同时显示，P53基因第7外显子248位点的突变与睑板腺癌的临床病理特征(包括性别、年龄、肿瘤的分化程度及肿瘤的复发)无关，表明P53基因突变在睑板腺癌发生的早期起作用。与此相似，许多国外学者在研究肺癌、头颈部癌及皮肤肿瘤中P53基因的突变，也得出相似的结论〔3～5〕。
许多研究结果表明，P53基因突变的位点和类型可因不同地理位置、不同肿瘤组织存在差异，这些差异可能是由于不同组织生物学特性的差异或暴露于某种类型的致癌物引起〔6～9〕。因此，不同肿瘤组织中P53基因突变的位点和类型，可为肿瘤的病因学和发病机理提供线索。本组结果显示，248位点密码子的突变是睑板腺癌P53基因突变的热点，可进一步行DNA测序，观察其突变类型，以从分子水平上揭示眼睑恶性肿瘤的发生机制。
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越来越多的研究表明，HPV与人类多种肿瘤发生有关。HPV是一种引起人皮肤及黏膜增生性损害的DNA病毒。目前已发现70多种型别的HPV，根据其致癌的危险性，HPV可分为“高危组”与“低危组”。HPV-16致癌的中心环节是HPV-16 E6,E7转化蛋白与细胞癌基因相互作用的结果。有文献报道，宫颈鳞癌中主要存在HPV-16的基因相关序列，而宫颈腺癌中则以HPV-18为主。本组检测结果显示，睑板腺癌、霰粒肿中未检出HPV-16 DNA，可进一步检测HPV-18或其他型别的HPV DNA,以探讨睑板腺癌P53基因突变与HPV感染之间的关系及其在睑板腺癌发生中的作用。
综上所述，P53基因第7外显子248位点的突变在睑板腺癌的发生早期起一定作用，是P53基因突变的一个热点，与睑板腺癌的临床病理特征无关。
本文为青岛市科委资助课题(批准号：SG9703121)参考文献
1 罗元辉，房殿春，鲁 荣，等.PCR-RFLP技术分析石蜡包埋胃癌组织ras和P53基因点突变.肿瘤防治研究,1995,10(5):116
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2 Kinoshita M,Shin S,Aono T.A sensitive and quantitive method for the determination of number of HPV-16 DNA copies by using the competitive PCR. GATA,1993,10(5):116
3 El Naggar AK,Lai S,Luna-MA, et al.Sequential P53 mutation analysis of preinvasive and invasive head and neck squamous carcinoma. Int J Cancer.1995,64(3):196
4 Lohman D,Putz B,Reich U,et al.Mutational spectum of the P53 gene in human small- cell lung cancer and relationship to clinicopathological data.Am J Pathol,1993,142:907
, 百拇医药
5 Campbell C,Auinm AJ,Ro YS,et al.P53 mutations are common and early events that precede tumor invasion in squamous cell neoplasia of the skin. J Invest Dermatol,1993,100:746
6 De Fromental CC,Soussi T.P53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Gen Chrom Cancer,1992, 4:1
7 Hsu IC,Metcalf RA,Sun T,et al.Mutational hot spot in the P53 gene in human hepatocellular carcinomas. Nature ,1991,350:427
, 百拇医药
8 Brash DE,Ruldolf JA,Simon JA,et al.A role for sunlight in skin cancer,UV-induced P53 mutations in squamous cell carcinoma. PNAS, 1991,88:10124
9 Puisieux M,Lim S,Groopman J,et al.Selective targeting of P53 gene mutational hot spots in human cancer etiologically defined carcinogens. Cancer Res,1991,51:6185
(1998-09-20收稿 1998-12-01修回), 百拇医药